近年来，大气对流层CO₂、O₃浓度升高与全球性气候变化已经引起全社会的广泛关注^[1]。日益增加的研究结果表明，大气CO₂浓度升高主要通过改变植物根系分泌物和土壤微生物群落的组成和数量、土壤中碳氮的流动与分配，以及可溶性碳水化合物库的大小等途径间接地改变土壤理化特性，从而潜在地影响着土壤微生物生态系统的变化^[2-3]。人们通常采用FACE（Free-air CO₂ enrichment）或OTC（Open top chamber）系统探讨大气CO₂浓度升高条件下土壤-植物系统的变化^[4-6]。土壤酶参与土壤中的物质循环、能量流动以及有机污染物的降解，其活性变化可反映出土壤中各种生物化学过程的强度和方向。因此，土壤酶已经用于评价大气CO₂等污染条件下土壤微生态环境的变化^[7]。就目前研究的土壤酶类而言，认为其活性被诱导而升高者居多，但也有相反的报道^[8-9]。由于供试土壤的特性、供试植物种类和CO₂增加方式等的不同，导致大气CO₂浓度升高对土壤微生物的区系、群落结构、土壤呼吸、微生物量以及土壤酶活性影响的研究尚未得出一致的结论。

O₃是另一种温室气体，也是光化学烟雾的主要成分。臭氧浓度升高会对植物产生负面影响。O₃通过气孔进入植物组织，降低气孔导度、抑制光合作用和养分的吸收、降低植物生物量和作物产量等^[10-12]。O₃胁迫下，植物根系分泌物的改变还可能改变土壤的理化性质，降低土壤微生物量碳、氮，从而潜在地改变根际的微生物群落、营养状态、土壤酶活性和酚类物质含量^[13-16]。人们通常采用OTC系统探究大气O₃浓度升高对植物和土壤微生物系统的影响^{[13, 17]}。研究发现，O₃升高对陆生生态系统地下部分的作用效应比地上部分出现得早，而且还表现出积累效应^{[1, 9]}。据报道，O₃浓度升高能够诱导土壤微生物功能多样性、生物量和酶活性的改变^{[2, 18-19]}，但相关研究还相当薄弱。

目前，多数研究是模拟单一CO₂或O₃升高对生态系统安全性的影响和评估，而对二者复合条件下的研究则有待加强。然而，国内外关于大气CO₂和O₃升高条件下土壤酶活性影响的研究鲜见报道。本文在OTC平台下构建微宇宙土壤-青菜盆栽模拟系统，探讨[CO₂]、[O₃]和[CO₂+O₃]升高条件下土壤蛋白酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶活性以及微生物生物量的变化，以期获得未来大气CO₂或/和O₃升高对菜地土壤微生态环境的影响。

试验平台位于南京大学仙林校区（118°57′36.15″E，31°7′23.99″N），平台包括4个气室：一个气室通正常大气；一个气室控制CO₂浓度比正常大气高200 nL·L^-1；一个气室控制O₃浓度比正常大气高50 nL·L^-1；一个气室控制CO₂和O₃浓度复合升高。气室为八边形，直径2 m，高2.8 m。CO₂由杜瓦罐（Q/JB-THB₀₀₂，北京天海工业有限公司）提供，CO₂气体购自南京天泽气体有限公司，纯度99.9%，O₃由臭氧发生器（NPF₁₀/W，山东绿邦）产生。CO₂或O₃（通过分压阀和流量计控制气体量）与正常大气混合后通过轴流风机（SFG-2，上海佳豹）通入气室底部，气体再通过气室底部和腔体中间不锈钢板上的小孔（直径0.5 cm）进入气室腔体，气体再通过气室顶部的开口进入外部大气，气体的更换频率为保证气室腔体中气体每分钟更换3~4次。CO₂浓度用CO₂检测仪（Li-7000，Li-Cor，USA）监测，O₃浓度用O₃检测仪（Model 205，2B Co.，USA）监测。气室24 h通入CO₂，气室通入O₃的时间为早上9：00至下午5：00（雨天除外）。

2014年6月将土壤分装入花盆（10 kg·盆^-1），施加复合肥（2 g·盆^-1，N∶P∶K =1∶1∶1），翻耕、混匀，然后播撒10颗青菜种子（上海四季青）。将上述土壤的花盆转移至OTC的4个气室里，即[Amb]、[CO₂]、[O₃]、[CO₂+O₃]，分别表示正常大气、高CO₂、高O₃、CO₂和O₃混合升高。青菜发芽后再生长一个星期就开始间苗，每个花盆保留3棵大小基本一致的青菜苗，定期补充等量去离子水。间苗30 d后采集土壤样品，用于下述指标的检测与分析。

土壤理化性质的测定参照鲍士旦等^[20]方法进行。采用烘干法测定土壤含水量；应用便携式pH计测定土壤pH值；应用钼锑抗比色法测定土壤全磷；应用原子吸收光谱法测定钾（K）；应用多元素N/C分析仪（EA 3000 Series，Italy）测定总碳（TC）和总氮（TN）；应用流动注射分析仪（FIAStar 5000，FOSS）测定铵态氮NH₄⁺-N（AN）、硝态氮NO₃-N（NN）和速效P（AP）；采用TOC分析仪（Multi C/N 3100，Jena）测定土壤可溶性碳（DOC）和可溶性氮（DON）^[21]。

采用氯仿熏蒸-K₂SO₄浸提法测定土壤MBC和MBN^[22]。应用TOC分析仪测定浸提液中有机碳及全N含量（Multi C/N 3100，Jena）。MBC和MBN的计算方法如下：MBC=EC/0.45，MBN=EN/0.45，EC、EN分别为熏蒸和未熏蒸土样浸提液的有机碳或全氮的差值^[23]，0.45为氯仿熏蒸后提取生物量的比例系数^[24]。微生物碳氮比用MBC/MBN表示。

土壤酶活性按照关松荫的方法^[25]，土壤蛋白酶（PRA）活性采用茚三酮比色法测定，以24 h后1 g土生成1 mg NH₂-N定义为1 mg NH₂-N·g^-1·24 h^-1。蔗糖酶（SA）采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，以24 h后1 g土壤生成1 mg葡萄糖定义为1 mg glucose·g^-1·24 h^-1。脲酶（UA）活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定：以1 g土壤37 ℃恒温培养24 h生成1 μg NH₃-N定义为1 μg NH₃-N·g^-1·24 h^-1。多酚氧化酶（POA）活性采用紫色没食子素比色法进行测定，把1 g土壤在2 h内生成1 mg紫色没食子素定义为1 mg PG·g^-1·2 h^-1。土壤酸性磷酸酶（APA）和中性磷酸酶（NPA）活性均采用磷酸苯二钠法进行测定，将100 g土壤于37 ℃恒温培养2 h生成1 mg P₂O₅定义为1 mg P₂O₅·100 g^-1·2 h^-1。

应用SPSS 18. 0软件对数据进行统计分析（Duncan检验，P<0.05），应用Origin 软件作图。

由表 1可见，随着OTC中CO₂或/和O₃的升高，土壤中NN、TP、TK和TC的含量呈现[CO₂]>[amb]>[CO₂+O₃]>[O₃]的变化趋势。就NN而言，[CO₂]暴露组显著高于其他处理组（P<0.05），[O₃]暴露组显著低于[CO₂]和[amb]处理组（P<0.05），而[CO₂+O₃]则缓解了[O₃]对土壤NN的抑制作用（P>0.05）。与[amb]比较，[CO₂]提高了TP或TK的含量（P>0.05），[O₃]则诱导了TP或TK显著性降低（P<0.05），而[CO₂+O₃]又缓解了[O₃]对TP或TK的抑制作用（P>0.05）。同时发现，各暴露组之间未见TC含量的显著性变化（P<0.05）。

表 1 大气CO₂或/和O₃升高对土壤理化性质的影响 Table 1 Effects of elevated atmospheric CO₂ or/and O₃ on soil physicochemical properties

表选项

土壤中AN、DON、TN和DOC含量的大小依次为：[CO₂]>[CO₂+O₃]>[amb]>[O₃]。与[amb]比较，[CO₂]和[CO₂+O₃]诱导了AN升高（P>0.05），而[O₃]则导致AN下降，并显著低于其他三种处理组（P<0.05）。DON和TN含量与AN的变化趋势相似，但各处理组中未见显著性变化（P>0.05）。同时发现，四种处理组之间DOC含量变化显著（P<0.05）。在上述实验条件下，SWC和AP含量的变化为：[CO₂]>[CO₂+O₃]>[O₃]>[amb]，而pH值的大小则随着[O₃]>[CO₂+O₃]>[amb]>[CO₂]的变化而趋于下降，且各处理组之间变化不显著（P>0.05）。

如图 1所示，土壤微生物量碳（MBC）和微生物量氮（MBN）含量的变化表现为：[CO₂]>[CO₂+O₃]>[amb]>[O₃]。与[amb]比较，通入CO₂诱导了MBC和MBN含量显著性升高（P<0.05），而其他处理组未见显著性变化。微生物量碳氮比（MBC/MBN）显示出[O₃]>[CO₂+O₃]>[CO₂]>[amb]的变化。与[amb]比较，只有[O₃]诱导了MBC/MBN显著性升高（P<0.05）（图 2）。

图 1 大气CO2或/和O3升高对土壤微生物量碳（MBC）和微生物量氮（MBN）的影响 Figure 1 Effect of elevated atmospheric CO2 and/or O3 on contents of microbial biomass carbon（MBC） and nitrogen（MBN）

图选项

图 2 大气CO2或/和O3升高对土壤MBC/MBN比值的影响 Figure 2 Effect of elevated atmospheric CO2 and/or O3 on ratio of MBC/MBN in the soils

图选项

如图 3所示，大气CO₂或/和O₃升高条件下土壤蛋白酶（PRA）和蔗糖酶（SA）的活性变化为[CO₂]>[CO₂+O₃]>[amb]>[O₃]，与其土壤中MBC和MBN的变化一致。与[amb]比较，只有通入O₃诱导了PRA显著性下降（P<0.05），只有通入CO₂诱导了SA显著性升高（P<0.05）。

图 3 大气CO2或/和O3升高对土壤蛋白酶（PRA）和蔗糖酶（SA）活性的影响 Figure 3 Effect of elevated atmospheric CO2 and/or O3 on activities of protease（PRA） and sucrase（SA）

图选项

如图 4所示，土壤脲酶（UA）和多酚氧化酶（POA）活性的变化为[CO₂]>[CO₂+O₃]>[amb]>[O₃]，与其土壤中PRA和SA酶活性的变化一致，但各处理组的UA或POA之间差异不显著（P>0.05）。

图 4 大气CO2或/和O3升高对土壤的脲酶（UA）和多酚氧化酶（POA）活性的影响 Figure 4 Effect of elevated atmospheric CO2 and/or O3 on activities of urease（UA） and phenol oxidases（POA） in the soils

图选项

大气CO₂或/和O₃升高条件下土壤酸性磷酸酶（APA）活性呈现[CO₂]>[CO₂+O₃]>[amb]>[O₃]的递减趋势，与该土壤中PRA和SA酶活性的变化一致。同时，中性磷酸酶（NPA）活性显示[CO₂]>[amb]>[CO₂+O₃]>[O₃]，且通入CO₂诱导了NPA显著性升高（P<0.05），而通入O₃则降低了NPA酶活性（P>0.05）（图 5）。

图 5 CO2或/和O3升高对土壤的酸性磷酸酶（APA）和中性磷酸酶（NPA）活性的影响 Figure 5 Effect of elevated atmospheric CO2 and/or O3 on activities of acid phosphatase（APA） and neutral phosphatase（NPA） in the soils

图选项

本实验利用OTC平台构建土壤-青菜盆栽模拟系统，研究了CO₂或/和O₃升高后土壤理化性质和土壤酶活性的变化。结果表明，[CO₂]升高诱导了土壤NN、AN、TN、TP、TK、TC、DOC、DON、MBC、MBN等理化指标不同程度的增长，呈现[CO₂]>[amb]的变化趋势。同时发现，NPA、PRA、SA、UA、POA、APA等土壤酶活性也显示相似的变化（表 1，图 1、图 3、图 5）。由此推测，[CO₂]的升高对上述土壤理化指标和土壤酶活性产生了促进作用。有研究报道，大气CO₂浓度升高能够促进植物的光合作用，提高根系的生物量和分泌物，并改变根系输入到土壤中的物质成分^[2-3]。大气CO₂升高还能够通过植物的代谢作用提高土壤总有机碳含量和根际碳的可利用性，导致土壤微生物量C、N和微生物活性的升高^[4-5]。土壤微生物量的改变进而诱导了PRA、UA、POA、APA等土壤酶活性的变化^{[4, 26]}。因此，本实验中[CO₂]的升高很可能通过促进青菜的光合作用及其根系分泌物的合成与输出，不同程度提高了土壤TN、TP、TK、TC、DOC、DON、MBC和MBN等理化指标，进而诱导了NPA、PRA、SA、UA、POA和APA等土壤酶活性的升高（表 1，图 1、图 3、图 5）。

同时还发现，[O₃]的升高降低了上述土壤理化指标和酶活性，呈现[O₃]<[amb]的递减趋势。同时，[O₃]升高还导致微生物MBC/MBN比值的升高（图 2）。有研究报道，大气O₃浓度升高能够关闭叶片的气孔，限制CO₂进入叶片组织，从而降低了光合速率和植物体内碳水化合物的含量^[27]。O₃浓度升高能够减少根系的分泌物，改变分泌物的类型^{[10, 28]}；还能够降低土壤微生物量C的代谢和N的含量，提高MBC/MBN比值^[29]，从而干扰了土壤养分、根际微生态环境和土壤酶活性^{[16, 18, 30-31]}，进而从本质上影响土壤微生物的群落组成及其功能多样性^[32]。据此推测，[O₃]升高很可能通过抑制青菜的光合作用，减少并改变了青菜根系的分泌物，在一定程度上改变了土壤C、N的代谢，导致NN、AN、TN、TP、TK、TC、DOC、DON、MBC、MBN等理化指标的异常变化，因而不同程度地抑制了NPA、PRA、SA、UA、POA、APA等土壤酶的活性（表 1，图 1、图 3、图 5）。同时这些结果还能反映土壤微生物量和土壤酶活性的变化，能够评价大气CO₂或/和O₃升高对菜地土壤微生态环境的影响。

研究结果还表明，[CO₂+O₃]复合条件下，土壤TN、TP、TK、TC、DOC、DON、MBC和MBN等理化指标，以及NPA、PRA、SA、UA、POA、APA等土壤酶活性大小呈现[CO₂+O₃]>[O₃]的变化（表 1，图 1、图 3、图 5）。[CO₂]可能消减了[O₃]对青菜叶片组织的伤害以及对青菜叶片组织光合作用等生理生化过程的干扰，从而间接地诱导了TN、TP等土壤理化指标以及NPA、PRA等酶活性不同程度的升高。相关机理有待进一步探讨。

[CO₂]升高诱导了土壤NN、AN、TP、TC、DOC、DON、MBC、MBN等理化指标以及NPA、PRA、SA、UA、POA和APA等土壤酶活性不同程度的升高，呈现[CO₂]>[amb]的变化趋势。[O₃]升高降低了上述土壤理化指标和酶活性（[O₃]<[amb]），却提高了土壤微生物MBC/MBN的比值。而[CO₂+O₃]升高在一定程度上则消减了[O₃]对土壤微生物量和酶活性的抑制作用，也缓释了[CO₂]升高对土壤微生物量和酶活性的刺激效应。