近年来，重金属Cd 污染形势严峻^[1-2]，它因具有半衰期长、移动性强、生物毒性大等特点，对生态环境、工农业生产、食品安全和人类健康等均造成一系列负面影响。大量的研究指出重金属对土壤微生物具有胁迫毒害作用，主要表现为土壤微生物的数量、活性、群落结构及多样性等的降低^[3-5]。而土壤微生物是反映土壤生态系统安全和土壤物质能量循环的敏感性生物指标之一^[6]，它可衡量土壤质量和肥力，评价土壤生态系统的可持续性。生物质炭能通过吸附、络合、 螯合、氧化还原等方式固定土壤中的重金属，降低其在土壤中迁移转化速率。国外有研究报道土壤中施入生物质炭后，Cd 浓度下降为原先的1/10，Cd 的生物有效性也显著降低^[7]。生物质炭能为土壤微生物生长繁殖提供充足的养分，可作为微生物栖息的微环境， 避免微生物间的竞争^[8]。研究表明，玉米秸秆、水稻秸秆两种生物质炭添加到土壤后均可以增加革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、放线菌和真菌的含量，改变土壤的微生物群落结构^[9]。生物质炭对土壤重金属污染良好的修复效应以及对土壤中微生物的保护效应得到了国内外学者的一致肯定。现今重金属Cd 和生物质炭双重作用机制下土壤微生物变化趋势及规律的研究却鲜有报道，且影响机制尚不明确。本文通过外源Cd 污染条件下不同量生物质炭对土壤微生物功能多样性的影响机制及作用原理的研究，旨在揭示生物质炭提升土壤微生物功能多样性是否可作为其修复重金属污染土壤的机制之一，以期为生物质炭在该领域的科学应用提供一个微生态的新思路。

本实验所用土壤为云南农业大学后山的红壤，基本理化性质详见表 1。

表 1 供试土壤理化性质 Table 1 Physical and chemical characteristics of soil

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选取河南三利公司生产的商品秸秆生物质炭，基本理化性质详见表 2。

表 2 生物质炭理化性质 Table 2 Physical and chemical characteristics of biochar

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实验为盆栽模拟实验，选用普通塑料桶，每桶装8kg 土。配制不同浓度的CdCl₂母液，与土壤混合均匀。秸秆生物质炭按照0%、2.5%、10%的质量比添加到上述混匀土壤中（因在前期实验中5%生物质炭添加量下Cd 形态、土壤酶活性没有明显变化，所以本实验不是按照梯度设置生物质炭添加量，而是选取了变化显著的2.5%、10%生物质炭添加量），并设置无任何添加的空白对照组，共4 种处理：Cd 添加量为0 mg·kg^-1，生物质炭添加量为0%（CK）；Cd 添加量为2.5 mg·kg^-1，生物质炭添加量为0%（B0）；Cd 添加量为2.5 mg·kg^-1，生物质炭添加量为2.5%（B2.5）；Cd 添加量为2.5 mg·kg^-1，生物质炭添加量为10%（B10）。 每种处理设置3 个平行对照组，置于温室大棚中并种植水稻，保持土壤湿度至田间持水量的70%，待水稻生长到分蘖期时采集（五点法）各处理土壤，进行功能多样性测定。

本研究采用Biolog-ECO 板分析土壤微生物群落的代谢功能特征。ECO 板所用接种液的制备采用Classen 等^[10]的方法。称取相当于5 g烘干质量的新鲜土样置于无菌三角瓶中，加入45 mL浓度为0.85% 的无菌生理盐水，200 r·min^-1 振荡30 min 后静置15 min，取5 mL上清液置于装有45 mL 无菌生理盐水的三角瓶中，重复稀释3 次，制得1颐1000 的接种液。将ECO 板提前预热到25 益，用八道移液枪取150 滋L 接种液于每孔中。ECO 板置于恒温培养箱中，25 益左右避光培养7 d，分别于4、24、48、96、120、144、168 h用Biolog 微生物自动鉴定系统读取590 nm 处吸光值， 每板重复读数3 次。

本文采用微平板每孔颜色平均变化率（Average Well Color Development，AWCD）描述土壤微生物整体活性。采用Shannon 指数、Simpson 指数与McIntosh 指数表征土壤微生物群落功能多样性。实验数据的方差分析和主成分分析均用SPS杂员怨软件完成，Excel 2007绘图。具体数据处理公式详见表 3。

表 3 文中各数据处理公式 Table 3 Formulas for index calculation

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AWCD 表征微生物群落对碳源的利用率，是土壤微生物群落利用单一碳源能力的重要指标之一，反映了土壤微生物活性、微生物群落生理功能多样性^[11]。 不同处理土样利用31 种碳源的总AWCD 变化趋势如图 1 所示。从整体上看，4 种处理下AWCD 值均随着培养时间的延长而增加，4耀24 h内增长缓慢，碳源基本未被利用，24耀120 h内快速增长变化明显，碳源被大幅利用，120 h以后增长趋于平缓。这表明，土壤微生物整体代谢活性与培养时间呈正相关关系，在24耀120 h碳源利用能力最强，微生物代谢活性最高。 具体来看4 个处理在整个培养过程中有明显差异，土壤微生物的碳源利用能力4耀72 h时间段内依次为B2.5>B10>B0>CK，72 h 后为B2.5>B10>CK>B0。可见，添加生物质炭处理的土壤微生物代谢活性远远高于未添加生物质炭的两个处理，尤其是B2.5 处理组对土壤微生物代谢活性影响最为显著；单加Cd 的B0 处理组72 h之前AWCD 值呈上升趋势，微生物碳源利用能力高于CK 对照组，但72 h后AWCD 值表现为下降趋势，碳源利用能力低于CK 对照组，即B0 处理组微生物代谢活性随时间推移逐渐降低。

图 1 培养期内土壤微生物AWCD 值的变化 Figure 1 AWCD changes of soil microbial community during incubation

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Shannon 多样性指数是研究群落物种丰富度的综合指标，是目前应用最为广泛的群落多样性指数之一，Simpson 指数较多反映了群落中最常见的物种优势度，McIntosh 指数则是群落中物种均一性的度量^[12]。 文中基于培养时间段内AWCD 值较稳定的120 h数据，利用3种多样性指数来分析土壤微生物群落的功能多样性，分析结果详见表 4。Shannon 指数、Simpson 指数、McIntosh 指数值均呈现B2.5>B10>CK>B0 的规律。表明土壤微生物群落功能多样性在Cd 胁迫下降低，生物质炭输入后对土壤微生物的功能多样性具有提升作用，B2.5 处理下作用效果尤为突出。添加生物质炭两处理组与单加Cd 的B0 对照组相比，McIntosh 指数上升70.59%，Shannon 指数上升27.65%，Simp原son 指数仅上升8.82%。生物质炭使Cd 污染土壤中微生物群落物种的均一度发生了显著变化，群落物种的丰富度得到一定的提升，但对群落中常见的微生物物种影响甚微。

表 4 4种处理下土壤微生物群落功能多样性 Table 4 Diversity and evenness indices of soil microbial community in different treatments

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根据ECO 板上31 种碳源的结构与化学性质，将其分为6 大类碳源化合物^[13]：糖类7 种；羧酸类9 种； 胺类2 种；氨基酸类6 种；聚合物类4 种；其他类3 种。对培养120 h六类碳源化合物的AWCD 值进行分析，结果如图 2 所示。4 个处理在碳源代谢方面的优势群落从大到小依次为其他类、糖类、胺类、聚合物类、氨基酸类、羧酸类，其中：糖类B2.5>B10>CK>B0； 羧酸类B2.5>CK>B10>B0；胺类B2.5>B10>CK>B0；氨基酸类B10>CK>B2.5>B0；聚合物类B2.5>B0>CK> B10；其他类B2.5>B0>CK>B10。可见，除氨基酸类化合物B10 处理组利用能力最强外，其余五类化合物均是B2.5 处理组的利用能力最强，表明Cd 污染条件下，4 种处理微生物对六类碳源化合物的利用强度差异显著，碳源利用率与生物质炭添加量没有直接的线性关系。这跟土壤微生物AWCD 值、功能多样性指数分析结果一致。添加生物质炭两个处理组与单施Cd 的对照组相比，羧酸类的利用能力提高了10 倍，氨基酸的利用能力提高了5 倍，糖类的利用能力提高了3 倍，胺类的利用能力提高了2 倍，聚合物类和其他类仅提升了1倍。这表明生物质炭输入Cd 胁迫下土壤微生物对羧酸类、氨基酸类、糖类、胺类四类碳源化合物利用能力增强，但对聚合物类、其他类的利用能力无显著变化。从相反角度来看，Cd 污染促进了土壤微生物对聚合物类和其他类两类化合物的利用。

图 2 土壤微生物对六类化合物的利用率 Figure 2 Utilization rates of six kinds of compounds by soil microbial community 同一类化合物下，不同处理间字母不同表示差异达到显著水平（P＜0.05）

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主成分分析（Principal component analysis，PCA） 是采取降维的方法，使用少数相互无关的综合指标反映原统计数据中所包含的绝大多数信息。它能够将多维数据的差异反映在二维坐标图上，进而揭示复杂数据背景下的简单规律。样品的群落碳源利用能力越相似，则它们在PCA 图中的距离越接近。为进一步了解不同处理下土壤微生物对不同类型碳源利用能力的差异，对各处理在培养120 h的六类碳源化合物进行了主成分分析。

如图 3 所示，4 种处理在PC 轴上出现了明显的分异，B2.5 位于第一象限，B10 和CK 都位于第二象限距离较近，B0 则位于第三象限，与其余3 个处理组的距离较远。由此可见，B10 与CK 两个处理组群落碳源利用能力相似，表明土壤遭受重金属Cd 污染后土壤微生物碳源利用能力减弱，2.5%的生物质炭添加量碳源利用能力最强，而生物质炭添加量10%土壤微生物的群落碳源利用率基本没有变化。由图 4 可知， 对PC1 贡献大的碳源化合物（系数>0.8）有3 类，分别是羧酸类、聚合物类和其他类。对PC2 贡献大的碳源化合物只有氨基酸这1 种。由于PC1 和PC2 分别占微生物群落碳源利用率总变异的63.19%和22.47%， PC1 是变异的主要来源。因此，对生物质炭处理组与单加Cd 对照组起区分作用的主要是羧酸类、聚合物类和其他类三大碳源群落。

图 3 四种处理下土壤微生物六类化合物利用特征主成分分析 Figure 3 Principal component analysis of utilization of six kinds of compounds by soil microbial community

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图 4 六类化合物在第一、第二主成分的载荷分布 Figure 4 Loadings of six kinds of compounds for first and second PCs

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有研究表明，重金属污染条件下改良剂-植物联合修复可改善土壤微生物群落代谢功能多样性^[14]。本研究也表明，在重金属Cd 污染条件下生物质炭输入后土壤微生物功能多样性提高。生物质炭中所含有机碳大部分是稳定的，仅有少部分可被土壤微生物分解利用^[15]，因而生物质炭通过两个途径影响Cd 污染条件下土壤微生物的功能多样性：一方面，生物质炭除C外，还含有N、P、K、Ca、Mg 等营养元素，成为土壤微生物生长繁殖的养分来源，生物质炭具有的巨大比表面积和孔隙结构等独特的性质为土壤微生物提供了生活、栖息的场所，直接影响了土壤微生物功能多样性；另一方面，本研究中的土壤为酸性红壤，较贫瘠， 生物质炭呈碱性，含有大量养分元素和官能团可改善土壤理化性质，从而吸附固持土壤中重金属Cd，降低Cd 的微生物有效性，间接影响土壤微生物的功能多样性。彭芳芳等^[16]、华建峰等^[17]、张宇宁等^[18]研究均显示，土壤微生物的代谢多样性与土壤有机质、N、P、K 含量、pH值等呈极显著正相关性。王鹤等^[19]试验证明了生物质炭可以通过提高土壤pH值和有机质含量来促进有效态铅向其他形态转化，从而降低土壤中铅的生物有效性。在本研究中，生物质炭对土壤微生物功能多样性的提升作用并未随生物质炭增加而提高，可能是由于2.5%低质量分数生物质炭与10%高质量分数生物质炭相比，能更有效地改善土壤理化性质，降低Cd的微生物有效性。可见，生物质炭的添加量是制约Cd 污染条件下土壤中微生物功能多样性变化的一个关键因素。当然土壤微生物多样性变化是多因素相互作用的结果，它也许还与生物质炭性质、土壤中酶活性、土壤类型、植被情况、背景重金属等相关。

本研究表明，Cd 胁迫下土壤微生物代谢活性、多样性指数、特别几类碳源化合物利用率均降低，滕应等^[20]很早便研究证实重金属污染引起了土壤微生物群落功能多样性的下降。生物质炭施入后缓解了Cd 的胁迫作用，土壤微生物的功能多样性提升。各多样性指数分析可知，生物质炭使Cd 污染土壤中微生物群落物种的均一度发生了显著变化，但群落中常见的微生物物种优势度基本无变化。张仕颖等^[21]研究显示，施用丁草胺后Simpson 指数越高，土壤微生物的碳源利用能力越集中，多样性越低。研究中Simpson 指数基本无变化，微生物对碳源利用能力均一，微生物分布均匀所以微生物均一度指数高。六类碳源化合物主成分分析显示，对4 个处理起分异作用的碳源化合物主要是羧酸类、聚合物类和其他类。陈琳等^[22]研究结果表明重金属污染抑制了微生物的代谢活性，尤其体现在对糖类和羧酸类碳源的利用上，与本文结果较为一致。本文中起区分作用的碳源化合物存在差别，可能是重金属Cd 污染土壤中外加生物质炭所致。六类碳源化合物具体利用状况分析表明，Cd 可刺激土壤微生物提高对聚合物类、其他类两类化合物的利用能力。有研究表明，中低浓度有机氯农药可能促进土壤中微生物对胺/氨基化合物的利用，高浓度则产生抑制作用^[23]。本实验外源Cd 的添加量为2.5 mg· kg^-1，模拟的是中低浓度Cd 污染条件。中低浓度污染可能会刺激土壤微生物中耐Cd 的优势菌群产生，而且这些优势菌群对聚合物类、其他类碳源具有偏嗜性，导致这两类碳源化合物的利用率提高。Coppotellil 等^[24]也认为污染胁迫会改变土壤微生物群落结构，形成较为适应污染土壤的优势菌群。B10 处理对氨基酸类碳源化合物利用能力增强，B2.5 处理组却对除此之外的五类碳源化合物利用能力均增强，尤其是羧酸类和糖类增强效果最显著。由此可知，2.5%低质量分数生物质炭可提高土壤微生物对羧酸类、糖类碳源化合物的利用率；10%高质量分数则可提高土壤微生物对氨基酸类碳源化合物的利用率。这表明在Cd 污染条件下，土壤微生物在功能多样性上对不同量生物质炭响应机制错综复杂，故有必要对其机制进一步深入探究。

（1）Cd 污染导致土壤微生物代谢功能多样性降低，生物质炭的施入缓解了Cd 的胁迫作用，但这种缓解作用与生物质炭添加量并无直接的线性关系。 AWCD 值、功能多样性指数、各碳源利用率最高均在2.5%生物质炭量条件下，表明此生物质炭量对Cd 污染土壤中微生物具有保护作用。

（2）Cd 污染条件下，生物质炭输入后土壤微生物各群落物种均一度发生了显著变化，群落丰富度增加，群落常见物种优势度基本无变化。

（3）2.5 mg·kg^-1低浓度Cd 污染条件下，土壤微生物对聚合物类、其他类两个类群碳源具有偏嗜性，而羧酸类、氨基酸类两个碳源类群对生物质炭的反应最灵敏。添加外源生物质炭的Cd 污染土壤中微生物对羧酸类、氨基酸类碳源利用能力分别提高10 倍和5 倍。2.5%低质量分数生物质炭可提高土壤微生物对羧酸类、糖类碳源类群的利用率；10%高质量分数的则可提高土壤微生物对氨基酸类碳源类群的利用率。