土壤酶是指在土壤中能催化生物学反应的一类蛋白质，其活性表征了土壤生物活性的强弱，是土壤新陈代谢的重要因素。土壤酶活性对土壤质量的生物活性指标及土壤肥力指标均具有很好的评价作用。目前我国土壤重金属污染问题日益严重，有关部门调查显示，约有20%的土壤存在着不同程度的镉污染。大量实验研究已经表明，土壤中Cd 元素的加入对不同类别的土壤酶活性存在着显著的影响，其中以脲酶、磷酸酶等氧化还原酶类的反应最为敏感，蔗糖酶次之，且其影响以抑制作用为主。生物质炭的施用可以显著改善土壤重金属污染的形态和迁移行为^[1]，生物质炭能够降低土壤中Pb、Cd 的酸可提取态含量，因而可以降低重金属的生物有效性，对重金属表现出很好的固定效果^[2-4]。由于土壤酶活性受重金属元素的影响较为显著，其强弱与重金属污染程度存在着某种相关性，土壤酶活性对重金属污染程度具有良好的恢复及指示效应。课题组前期研究结果表明^[5]，在土壤中生物质炭含量较低（0~5%）时，2.5%含量的生物质炭输入对土壤碳循环类酶活性及氧化还原类酶活性均具有最强的修复效应，其中碳循环类酶活性比不加生物质炭高出7.4%，氧化还原类酶活性比不加生物质炭时高出18.50%。除此之外，重金属污染对根际土壤也具有很强的影响力。根系分泌物是土壤酶的重要来源，在植物生长发育的过程中，根系作为物质和土壤的重要界面，不仅是吸收和代谢器官，而且是强大的分泌器官，植物根系分泌物、残体（含根系脱落物和凋落物）在土壤分解过程中可刺激微生物活动，从而使根际土壤酶活性得到增强^[1]。前人的研究成果已经证明了这种趋势^[5-6]，如玉米、杉木，其根际土壤酶活性值是非根际土壤的2~5倍；水稻根际土壤过氧化氢酶活性比非根际土壤高出了35%，蔗糖酶活性值高出23%。这便是作物中普遍存在的根系效应。

目前，国内有关生物质炭对重金属污染下土壤酶活性值变化研究较多，然而有关水稻根际土及非根际土酶活性值差异方面的研究仍然较少涉及，有关不同量的生物质炭对不同程度的重金属污染下的作物根系不同类别酶活性的影响方面尚不明确。本文在总结汲取前人及本课题研究成果的基础上，选取水稻这一最为广泛种植和食用但同时却最易受重金属富集危害的农作物作为研究对象，通过改变不同量的生物质炭及重金属元素Cd 的施入，探究更高浓度的生物质炭添加下的水稻根际土及非根际土中对土壤重金属响应较为灵敏的氧化还原类土壤酶及对生物质炭响应较为灵敏的碳循环类土壤酶活性的变化，探究水稻根际土及非根际土碳循环类酶及氧化还原类酶活性在不同量的生物质炭及重金属Cd 施用下的变化机理，旨在为生物质炭对重金属Cd 污染水稻根际土及非根际土酶活性的影响提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计

选取云南农业大学后山红壤8 kg 作为试验供试土壤，将CdCl₂·2.5H₂O 与去离子水配成母液，稀释成处理浓度（10、2.5、5 mg·kg^-1）后与土壤反复混合均匀，同时设置空白对照。选取秸秆生物炭按添加量（0、2.5%、5%、10%的质量比）进行原状土添加，即得到13种不同处理的土样，分别记作Cd0B0、Cd1B0、Cd1B2.5、Cd1B5、Cd1B10、Cd2.5B0、Cd2.5B2.5、Cd2.5B5、Cd2.5B10、Cd5B0、Cd5B2.5、Cd5B5、Cd5B10。

经处理的土壤样品分装后置于玻璃温室中，在自然状态下进行老化处理60 d，保持土壤水分在田间水量的70%^[7]。选取优良品种的水稻种子分别种植于上述处理的土样中（每类土样均需设平行对照），用塑胶夹板夹住少量土壤，使根系在夹板中生长，保持5~6cm 的水层，水稻抽穗前2 d适当排水通气，齐穗到蜡熟期可间歇灌溉，待黄熟后可开始排水。水稻成熟收获后，取夹板中近根土做根际土，夹板外的土即为非根际土。对所得到的水稻根际土及非根际土的FDA 水解酶、纤维素酶、蛋白酶、脲酶、蔗糖酶及过氧化氢酶的活性进行测定。表 1为试验用生物炭的基本性状。

1.2 测定方法

对FDA 水解酶（又名荧光素二乙酸酯酶）以无色的荧光素二乙酸为基质，采用比色法来测定其活性；采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定纤维素酶解所产生的还原糖量来表示纤维素酶活性；蛋白酶酶活的测定采用茚三酮比色法，以24 h后1 g 土壤中的氨基氮的毫克数表示；脲酶的酶活采用苯酚钠-次氯酸钠比色法，以尿素为基质，测定其活性；蔗糖酶酶活采用二硝基水杨酸比色法测定，以24 h后1 g 土壤中的葡萄糖毫克数来表示；磷酸酶酶活的测定采用磷酸苯二钠比色法来测定，以磷酸苯二钠为基质，在磷酸酶的作用下，以水解基质所生成的苯酚的量来表示；过氧化氢酶酶活采用紫外分光光度法测定，以每20 min 内每克土壤分解的过氧化氢的毫克数来表示^[8]。

为消除土壤中原有物质对实验结果造成的误差，以上每种土样的酶活测定均需要设置无基质对照，整个实验需做无土对照。为使实验结果精准可靠，每种土样的酶活测定也需做平行对照。

1.3 酶活性综合值的计算

根据前人研究结果及各种酶的具体作用及性质，将所选取的土壤酶分为两大类：第一类为对土壤碳循环变化响应较为明显的酶类，这类酶有FDA 水解酶、纤维素酶、蛋白酶；第二类为对Cd 活性变化响应较为敏感的酶类，这类酶也被称之为土壤氧化还原酶，其中包括脲酶、蔗糖酶、磷酸酶及过氧化氢酶^[8-11]。对这两大类型的酶活性分别求取几何平均数，作为衡量土壤中碳循环相关酶及氧化还原酶活性的指标，其中土壤碳循环酶的公式为：

土壤氧化还原酶活性公式为：

最后，对不同处理下土样的各种酶活性求几何平均数，作为衡量土壤质量的综合酶活性指标，公式为：

式中：FDA 代表FDA 水解酶活性；Cel 代表纤维素酶活性；Pro 代表蛋白酶活性；Ure 代表脲酶活性；Inv 代表蔗糖酶的活性；Cat 代表过氧化氢酶的活性。

1.4 数据处理

本文中分析数据采用Excel（2007）统计软件及SPSS19.0 软件对各种处理下水稻根际及非根际土壤不同酶活性值进行单因素方差分析，检验不同处理之间的差异显著性（P<0.05）。

2 结果与分析 2.1 外加镉处理下生物质炭输入对水稻根际及非根际土壤碳循环酶活性的影响

碳循环酶包括FDA 水解酶、纤维素酶、蛋白酶三种。从图 1可以看出，当土壤中Cd的施入量为1 mg·kg^-1时，随着生物质炭量的施入，水稻根际土FDA 酶的活性逐渐升高，生物质炭的用量为2.5%时其值最小为0.382 mg·g^-1，当生物质炭用量为5%及10%时，FDA 酶的活性值分别增加71.64%及34.07%；生物质炭的输入量为2.5%时，根际土壤蛋白酶的活性最高，其值为240.22 mg·g^-1，比不加生物质炭、生物质炭含量5%及10%分别高出66.11%、53.10%及78.97%；生物质炭含量为5%时，纤维素酶的活性值最高为0.907mg·g^-1，比不加生物质炭及生物质炭含量2.5%、10%时分别增加了36.49%、34.07%、40.35%。土壤中Cd的施入量为2.5 mg·g^-1时，根际土FDA 酶的活性随着生物质炭施入量的增加亦呈上升的趋势，在生物质炭的施入量为0、2.5%、5%及10%时，该酶的活性值较前者分别增加1.23%、100.08%及47.06%；蛋白酶的活性值变化梯度显著，最高为生物质炭含量10%时，其值为556.981 mg·g^-1，最低为生物质炭施入量为0 时，该酶的活性值为13.002 mg·g^-1，下降97.66%，可见生物质炭对蛋白酶活性值的恢复具有显著作用；生物质炭含量10%时，纤维素酶的活性值最高为2.079 mg·g^-1，当不加生物质炭以及生物质炭施入量为2.5% 及5%时，较最高值分别下降79.60%、64.35%及79.26%，下降梯度显著。Cd的施入量为5 mg·g^-1时，当生物质炭的施用量分别为0、2.5%、5%及10%时，FDA 水解酶的活性值分别为0.508、0.777、1.190、1.428 μg·g^-1，上升梯度显著。蛋白酶的活性值介于45.323~136.388mg·g^-1 之间；不加生物质炭时，纤维素酶的活性值最高，其值为0.520 mg·g^-1。由此可见，在不同量的Cd 施入下，水稻根际土壤碳循环类酶活性值在不加生物质炭时最小，最大值则随着炭量施入量的变化而变化。这可能与Cd 的施入对各种土壤酶的抑制及不同种类的酶对于生物质炭的敏感程度有关，多方面因素的共同作用导致土壤碳循环类酶活性的差别及不同变化态势。当土壤中Cd的施入量为1 mg·kg^-1时，随着生物质炭的施入，水稻非根际土FDA 酶活性值逐渐升高，非根际土壤蛋白酶的活性值最高为生物质炭的输入量2.5%时；纤维素酶的活性值最高为生物质炭施入量10%时。当土壤中Cd 的施入量为2.5 mg·kg^-1时，FDA 水解酶的活性值随着生物质炭用量的增加呈现先增加后逐渐减少的趋势；当土壤中Cd 的施入量为5mg·kg^-1时，水稻非根际土FDA 水解酶的活性随着生物质炭施入量的增加逐渐降低，且下降幅度逐级增加；当土壤中Cd 的施入量为2.5 mg·kg^-1及5 mg·kg^-1时，非根际土壤蛋白酶的活性值随着生物炭施入量的升高依次递增，最高均为生物质炭的输入量为10%时。可见10%的生物质炭施入量对Cd 污染水稻非根际土壤蛋白酶活性值的恢复具有更显著的效果，而纤维素酶的活性值最高均为不加生物质炭时，其值分别为0.851、0.496 mg·g^-1。可见水稻非根际土壤碳循环类酶活性值变化趋势同根际土壤酶活相类似。

2.2 外加镉处理下生物质炭输入对水稻根际及非根际土壤氧化还原酶活性的影响

不同处理间水稻根际土壤氧化还原类酶的活性值变化显著，本文研究的是脲酶、蔗糖酶及过氧化氢酶（图 2）。当土壤中Cd 的施入量为1 mg·kg^-1时，生物质炭的输入量2.5%时，水稻根际土壤脲酶的活性值最高，比不加生物质炭及生物质炭含量5%、10%时分别高出42.99%、28.59%、30.35%；蔗糖酶的活性值随着生物质炭施入量的增加而递增，生物质炭含量为2.5%时，根际土壤蔗糖酶的活性值最高，其值为4.496mg·g^-1。当土壤中Cd的施入量为2.5 mg·kg^-1时，生物质炭施入量为2.5%时，根际土壤脲酶及蔗糖酶的活性值均最高；该处理下的脲酶活性值比生物质炭的施入量为0、5%及10%时分别高了73.12%、58.45%、24.73%；蔗糖酶的活性值比不加生物质炭时高出79.74%，比生物质炭含量5%时高出80%，比生物质炭含量10%时高出43.97%。过氧化氢酶的活性值最高为生物质炭含量5%时的4.485 mg·g^-1。Cd 的施入量为5 mg·g^-1时，水稻根际土壤脲酶的活性值最高亦为生物质炭施入量为2.5%时，其值为0.621 mg·g^-1；蔗糖酶的活性值最高为生物质炭含量10%时，其值为1.26 mg·mL^-1，比生物质炭含量0、2.5%及10%时的0.096、0.123、0.113 mg·mL^-1分别高出92.38%、90.24%、91.03%；生物质炭含量5%时，过氧化氢酶的活性值最高，其值为4.485 mg·g^-1，比不加生物质炭、生物质炭施入量2.5%及生物质炭施入量10%分别高出17.46%、38.01%、46.46%。可见在生物质炭含量为2.5%时，在不同量的Cd 添加下，土壤脲酶及蔗糖酶的活性值均最大，说明该浓度的生物质炭的输入对该两种酶活性的恢复具有重要意义，能够显著削弱重金属Cd 的抑制；而过氧化氢酶的活性值在生物质炭含量5%时达到最大，可能是与过氧化氢酶活性受土壤重金属污染程度的变化比较敏感^[15]，需要更多量的生物质炭施入有关。

当土壤中Cd的施入量为1 mg·kg^-1时，水稻非根际土壤脲酶的活性值随着生物质炭施入量的增加逐渐升高，最高为生物质炭的输入量10%；水稻非根际土壤过氧化氢酶的活性值在生物质炭含量为2.5%时最高。Cd 的施入量为2.5 mg·kg^-1时，水稻非根际土壤脲酶及蔗糖酶的活性值均在生物质炭的施入量2.5%时最高，其值分别为1.002、0.748 mg·mL^-1。当土壤中Cd 的施入量为5 mg·kg^-1 时，水稻非根际土壤脲酶的活性值在不加生物质炭时最高，比生物质炭含量2.5%时高4.43%，比生物质炭施入量5%高49.31%，比生物质炭施入量10%高40.99%；而蔗糖酶的活性值为不加生物质炭时最高。当土壤中Cd 的施入量为2.5 mg·kg^-1及5 mg·kg^-1，非根际土壤过氧化氢酶的活性值均在生物质炭含量为5%时最高。本课题之前的研究也表明^[2]，生物质炭输入可以提高土壤pH 值和土壤有机质含量，改变镉在土壤中的赋存比例，使土壤中可交换态镉比例降低并向残渣态转化，从而降低镉的生物有效性；而且生物质炭输入后对根际与非根际土壤各个粒级微团聚体镉形态间的影响效果明显，在不同镉污染浓度下随着生物质炭输入量有逐级递增，各个处理间镉有效态含量均呈现降低趋势，而残渣态含量则呈现上升趋势。这从本质上证明了生物质炭的施入对重金属镉污染的削弱作用是切实可信的。

2.3 外加镉处理下生物炭输入对水稻根际及非根际土壤综合酶活性的影响 2.3.1 不同处理下生物炭输入对水稻根际及非根际土壤碳循环酶的综合酶活性比较

对不同处理下的水稻根际及非根际土壤碳循环相关的酶活性求几何平均数（Geametric mean），作为衡量水稻根际及非根际土壤碳循环酶的综合指标，其计算结果如表 2 所示。可以直观看出，水稻根际土壤与碳循环相关的综合酶活性值普遍高于水稻非根际土壤。从处理CK到处理Cd5B10，水稻根际土壤碳循环酶的综合活性值与非根际土壤碳循环酶的综合活性值的差值介于0.542~10.880之间。差异最大的为Cd的施入量2.5mg·kg^-1，生物质炭的施入量10%时，其值为10.880。

2.3.2 不同处理下生物炭输入对水稻根际及非根际土壤氧化还原酶的综合酶活性比较

对不同处理下的水稻根际及非根际土壤氧化还原酶活性求几何平均数，作为衡量水稻根际及非根际土壤氧化还原酶的综合指标，其计算结果如表 3 所示。可以看出，水稻土壤氧化还原酶的综合酶活性值根际土与非根际土差异明显，从处理CK 到处理Cd5B10，水稻根际土壤氧化还原酶的综合活性值与非根际土氧化还原酶的综合活性值差值介于-0.307~0.498 之间。差异值最大为Cd 的施入量5 mg·kg^-1，生物质炭施入量10%时，其值为0.498。当Cd 的添加量为5 mg·kg^-1，生物质炭的施入量为0 时，其差异出现负值（-0.307）。

2.3.3 不同处理下生物炭输入对水稻根际及非根际土壤酶的综合酶活性比较

对不同处理下的水稻根际及非根际土壤各种酶活性求几何平均数，作为衡量水稻根际及非根际土壤的综合酶活性指标，其计算结果如表 4。可以看出，水稻土壤根际土壤酶活性的综合值与非根际土壤酶活性的综合值存在显著差异，从处理CK 到处理Cd5B10，水稻根际土壤氧化还原酶的综合活性值与非根际土氧化还原酶的综合活性值差值介于0.387~2.876 之间。差异最大为Cd 施入量2.5 mg·kg^-1，生物质炭施入量10%时，其差值为2.876。

3 讨论 3.1 生物质炭对重金属污染土壤酶活性的修复效应

重金属直接作用于酶分子，使酶的构象发生改变，从而影响酶的活性；其抑制土壤微生物的生长繁殖，使微生物体内酶的合成和分泌量减少，进而影响酶的活性；重金属影响到作物的代谢活力，使根分泌、释放酶的能力受影响^[6]。生物质炭的施入可以显著改变土壤中Cd 的形态和迁移行为，降低土壤中Cd 的可提取态含量，降低重金属的生物有效性，故对重金属具有很好的固持效应。Beesley^[6]向高Cd、Cu含量的土壤中添加生物质炭60 d后，土壤毛细管水中这两种重金属的浓度显著降低，其对土壤酶的抑制作用也有所下降；Khodadad 等^[7]研究认为，土壤中施加Cd 可使微生物群落发生改变，从而引起土壤酶活性的变化，与本文的研究成果一致。Steiner 等^[8]发现通常土壤中生物质炭的施入量为5%~10%时，土壤呼吸及土壤微生物量与生物质炭量呈线性关系。由于生物质炭独特的物质组成及其自身特有的性质，使得其向土壤中的施入可以加速土壤中生物化学反应的活跃程度、土壤微生物的活性以及养分物质的循环状况^[9]，进而改变土壤酶的活性，且其对土壤重金属污染具有很强的吸附及钝化效应。本文通过研究不同量的生物质炭重金属Cd 的共同作用下水稻根际及非根际土壤碳循环酶及氧化还原酶酶活性的变化，得出当生物质炭的施入量为10%时，不同量的Cd 添加下水稻根际及非根际土壤的酶活性值均高于其他处理，表明10%的生物质炭施入量对不同浓度Cd 污染土壤酶活均具有更好的恢复效果。

3.2 植物根际土壤与非根际土壤酶活性的差异性探究

由于植物根系的细胞组织脱落物和根系分泌物为根系微生物提供了丰富的营养和能量，植物根际的微生物数量和活性值普遍高于根外土壤，使得水稻根际土壤酶活性值通常高于非根际土壤的活性值。土壤各种酶的积累是土壤微生物、土壤动物和植物根系生命活动共同作用的结果，作物可以直接或间接地影响土壤酶含量。前人研究表明，根际土壤磷酸酶、蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶、水解酶的活性较非根际土壤均有增强^[10-11]。孟令军等^[12]对鹿蹄草根际及非根际土壤酶活性值测量得知，鹿蹄草的土壤酶也表现出根际酶活性较强的特性，根际土壤脲酶、转化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶活性值比非根际土壤分别高出32.04%、22.40%、30.57%、8.17%，与本文中水稻根际土壤酶活性值普遍高于非根际土壤酶活性值的事实一致。这是因为相对于非根际土壤，根际土壤中的可溶性有机碳（DOC）含量及pH 值显著增高，根系分泌的可溶性有机物质与土壤中的Cd 离子产生络合作用，导致根际土壤中的Cd 较难解吸^[13]，从而有效降低了重金属对土壤的危害，促进了根际土壤微生物的繁殖和生长，增加了重金属污染下作物体内酶的分泌和形成，最终显著提高了作物根际土壤酶的活性。齐晓娟^[14]通过探究羊蹄（Rumex patientia）的根际土壤微生物组成，得知相对于非根际土壤，羊蹄根际微生物群落更多，主成分分析结果显示，自生固氮菌、氨化细菌是根际土壤的最主要影响因子。同时，根际土壤酶活性值受作物的类别影响很大，形成原因可能与不同种类的作物其根际土壤微生物活性以及根际分泌物的组成不同有关。

3.3 土壤碳循环类酶及氧化还原类酶活性值的差异

马瑞萍等^[15-16]通过研究不同量的有机碳施入下黄土高原不同植物群落的土壤团聚体中的各种酶活性，结果表明土壤中碳循环类酶活性值的提高，有助于土壤活性有机碳含量增加；同时也有相关研究证明^[17]土壤氧化还原类酶活性值的提高，有助于土壤腐殖质的积累，从而从根本上提高土壤肥力。牛文静等^[18]研究表明，外源有机物料的施入显著提高了土壤中200~2000 μm 和<2 μm 两粒组中酶活性的综合指数，可见土壤酶活性综合指数可以较好反映土壤生物学性状，是土壤生物质量的综合评价指标。本文通过对土壤碳循环酶及土壤氧化还原酶分别求取几何平均数作为衡量土壤中碳循环类酶及氧化还原类酶活性的指标，结果表明不同处理下的水稻根际及非根际土壤碳循环酶活性差值的平均数为3.024 9，显著高于不同处理下水稻根际及非根际土壤氧化还原酶活性差值的平均数0.262 6。可见在不同量生物质炭及重金属Cd的处理下，水稻根际土壤碳循环酶的活性值有大幅提高。这与前人^[19-21]向水稻土中施入有机肥显著提高了土壤中纤维素酶及FDA 水解酶等土壤碳循环酶活性值的结论相吻合。

水稻根际土壤碳循环类酶活性的大幅提高可能是因为生物质炭的施入显著提高了土壤中有机质及活性碳含量。马玉芳^[22]通过传统耕作及秸秆等有机肥还田耕作对比显示，后者能够大幅提高土壤有机碳含量，其含量分别较初始值增加了74.76%和71.13%，这些有机肥的施入，为纤维素酶及FDA 水解酶等参与土壤碳循环的主要酶的酶促反应提供了大量易利用的底物，从根本上激发了水稻根际土壤碳循环类酶的活性。土壤氧化还原类酶的活性值升幅则较小，因为Cd 的添加在很大程度上抑制了对重金属污染响应较为灵敏的氧化还原类土壤酶。

4 结论

（1）生物质炭的施入对土壤重金属污染的水稻根际土及非根际土均有显著的修复效应，当生物质炭施入量为10%，不同量的Cd 添加下水稻根际及非根际土壤的酶活性值均高于其他处理。

（2）外加Cd 处理下水稻根际土的碳循环酶综合活性值显著高于氧化还原酶综合活性值。

（3）水稻根际土壤碳循环酶的综合活性指数值随着生物质炭量的增加，其值总体上升；而根际土壤氧化还原酶的综合活性指数值则呈现先降后升的趋势。