秸秆通常占作物生物量的50%以上，是极为丰富且能直接利用的可再生有机资源^[1] 。据统计，我国＜有35.3%的秸秆在田间焚烧^[2]，不仅造成大量秸秆资源的浪费而且污染环境，影响交通安全，也不利于土壤质量的培育和农业的可持续发展^[3-4]。秸秆还田是增加土壤有机质含量、全面提升地力的有效途径^[5-7]，秸秆还田增加了土壤有机质的含量，改善了土壤理化性状^[8-11]，对促进农业的可持续发展起到重要作用。但是在北方春玉米地区，由于秋冬季气温低，导致玉米秸秆腐解缓慢，甚至不能完全降解，对农田土壤整地播种质量产生不利影响^[12-15]，因而北方地区秸秆还田比例仅为30.9%，蒙新地区甚至仅为7.4%和5%。目前，秸秆腐解菌的研究主要集中在中高温或者常温条件下，这些菌株不适合在北方地区低温条件下应用，有关低温秸秆腐解菌的研究鲜有报道。因此，研发低温条件下高效快速分解秸秆的菌剂是推进北方春玉米地区玉米秸秆还田的重要措施。

研究证实，天然复合菌系对秸秆的腐解效果显著优于人工纯培养的微生物^[16-17]。Kato 等^[18]将天然复合菌系中分离的微生物重新组合后，发现复合菌系中非纤维素菌群对菌系纤维素的降解起了非常重要的作用。20 世纪中叶以来，科学家们获得了大量天然降解秸秆的真菌，尤以木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、漆斑霉属(Myrothecium)、毛壳霉属(Chaetomium)、曲霉属(Aspergillus)等为主^[19-23]。

国内外对高效秸秆菌剂及发酵条件的研发取得了一定进展。金海洋等^[24]使用经过芽孢杆菌属和分解脂肽梭菌属组合的菌剂处理的秸秆，在30 ℃条件下秸秆降解率为45.5%；张庆华等^[25]筛选出4 株效果较好的纤维素腐解菌剂，在50 ℃时秸秆腐解率达到83.7%；Haruta 等^[26]通过多次组合筛选构建了一个稳定的复合菌系，在50 ℃条件下，4 d内可使水稻秸秆降解率高于60%以上；Spela 等^[27]研究表明，在堆肥活＞期接种微生物菌剂能提高堆肥效率，有机质的矿化更为迅速，产生的堆肥品质更稳定。张丽青等从稻秆堆腐物及牛粪中分离筛选出一株分解纤维素能力较强的菌株N-12，培养基pH 设置为8.0，接种量设置为4%，蛋白胨作为氮源，在37 ℃条件下培养72h，此时菌株的CMC(Sodium carboxyl methyl cellulose羧甲基纤维素)酶最高^[28]；以腐解过程中秸秆失重率、CMC 酶活等指标评价玉米秸秆腐解效果可行，以腐熟终点C/N 和T 值作为评价玉米秸秆的腐熟度指标初步可行^[29]。

本研究利用从自然界低温腐殖锯末已分离高效秸秆降解复合菌系，研究发酵条件及液态发酵条件下菌剂对秸秆的降解能力，制成生物菌剂，并应用于大田试验。以期为解决低温秸秆田间降解难的难题提供微生物资源和技术支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

复合菌系：筛选自锯末中的一组玉米秸秆降解复合菌系GF-S72^[14]。

载体：白炭黑(Silica，成都艾科达化学试剂有限公司)、煅烧高岭土(Kaolin，国药集团化学试剂有限公司)、硅藻土(Diatomite，国药集团化学试剂有限公司)、滑石粉(Talc，天津风船化学试剂科技有限公司)、皂土(Bentonite，上海山浦化工有限公司)、凹凸棒土(Attapulgite，国药集团化学试剂有限公司)、轻质碳酸钙(Calciumcarbonate，上海泗联化工有限公司)。

DNS 试剂：准确称取酒石酸钾钠(C₄H₄Na₂O₆)185.0 g溶于蒸馏水中(低于50 ℃加热)，待溶解后加入3，5-二硝基水杨酸(C₇H₄N₂O₇)6.313 g，全部溶解后加入氢氧化钠(NaOH)21 g、苯酚(C6H5OH)5.0 g、无水亚硫酸钠(Na₂SO₃)5.0 g，搅拌使之溶解，冷却至室温后加水定容到1000 mL，贮存于棕色试剂瓶，室温放置一周后使用。

柠檬酸缓冲液(pH=4.8)：A 液：取一水柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)21.014 g，定容到1000 mL；B 液：称取二水柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O7·2H₂O)29.412 g定容至1000mL。取A 液271.2 mL、B 液228.8 mL 定容至1000mL，于4 ℃冰箱内保存。

1%羧甲基纤维素钠：称取1.0 g 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)于烧杯中，加热溶解后用柠檬酸缓冲液(pH=4.8)定容至100 mL。

基础培养基：硫酸铵[(NH₄)₂·SO₄]1.0 g、磷酸氢二钾(K₂HPO4)1.0 g、氯化钠(NaCl)0.2 g、硫酸镁(MgSO₄)0.5 g、碳酸钙(CaCO₃)2.0 g，加入蒸馏水1000 mL。

1.2 菌株培养基的优化 1.2.1 不同氮源的优化

选用基础培养基，以玉米秸秆作为碳源，分别用蛋白胨、酵母粉、硝酸铵、硝酸钠、硫酸铵、尿素代替基础培养基中的氮源，加入量为0.2%；培养条件为装液量30 mL/150 mL，接种量为10%，pH7，温度15 ℃，转速130 r·min^-1。每个处理设3 次重复，培养3 d后测量菌系纤维素酶活，进而选出最佳氮源。纤维素酶活包括滤纸酶活FPA(Filter paper activity)、内切酶Cx(Endoglucanases)、外切酶C1(Cellobiohydrolases)。纤维素酶活力是指在特定条件下，经酶的催化作用形成葡萄糖时每分钟所需该酶的量为1 个酶活国际单位“U”。

1.2.2 最佳尿素浓度、碳氮比的优化

选用基础培养基，尿素浓度为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%，设置碳氮比分别为0.1:1、5:1、10:1、20:1、40:1，共5个水平进行试验。培养条件为装液量30 mL/150 mL，接种量10%，pH7，温度15 ℃，在转速为130r·min^-1的摇床中培养。每个处理设3次重复，3 d后测量菌系纤维素酶活，得出最佳尿素浓度和碳氮比。

1.3 复合菌系培养条件的优化

选用基础培养基，对培养温度、装液量、培养时间、初始pH、接种量进行单因素优化试验，每组试验设3次重复，3 d后测量菌系纤维素酶活，得出各单因素最佳指标。

1.4 复合菌系GF-S72 正交试验

在以上试验的基础上，按正交试验L₉(3⁴)四因素三水平对菌株摇瓶培养条件进行优化，3 d后测定菌系纤维素酶活，得出摇瓶培养复合菌系GF-S72 的最优配比。

1.5 菌剂研制 1.5.1 筛选试验加工工艺

将复合菌系(GF-S72号复合菌系在pH8.0、10 ℃、C:N=20:1、装液量12%、接种量2%的条件下振荡培养6 d获得)摇瓶发酵液与填料按一定比例混合制成母液，置于冷冻干燥机干燥制成母粉。

1.5.2 初始制剂成分配比

初始制剂成分质量配比为发酵液50%，填料50%。

1.6 载体筛选试验

选择白炭黑、煅烧高岭土、硅藻土、皂土、凹凸棒土、滑石粉、轻质碳酸钙7种不同载体做填料，比较不同载体情况下制剂降解纤维素的差异。将制备的各制剂室温贮藏14 d后测定秸秆降解率和滤纸降解情况(在无菌条件下取1 g搭载不同载体的制剂接种到盛有基础培养基的三角瓶中，每个三角瓶放3 条滤纸条，每处理设定3 次重复，摇床130 r·min^-1 振荡培养，10 ℃恒温培养2 d，检测滤纸降解情况)，以此考察填料对复合菌系的生物相容性。综合秸秆降解率、滤纸降解情况、价格等因素，筛选出最适填料。以原菌液为CK。

1.7 质量指标测定 1.7.1 pH 值的测定

取1 g自制菌剂置于100 mL 烧杯中，加入100mL 蒸馏水，搅拌后静置1 min，用pH 计测其pH 值。平行测定3次，取其平均值。

1.7.2 含水量的测定

称取1 g自制菌剂置于托盘中，在105 ℃烘箱中烘干，24 h后取出测定前后质量差。

1.7.3 保藏参数的测定

选取含水量较高的低温高效降解玉米秸秆复合菌制剂3 g，于-109 ℃下采用冷冻干燥机(labogene原Scanvac 冷冻干燥机系列，丹麦)冷冻干燥，然后在此冷冻干燥后菌剂基础湿度上加入相应质量的蒸馏水使菌剂密封“保藏湿度”为0%、10%、20%、40%和80%，并将样品分别抽真空密封保存。在无菌条件下取3 g 密封菌剂接种到盛有基础培养基的三角瓶中，每个三角瓶放5 条滤纸条，每处理设定3 次重复，摇床130 r·min^-1 振荡培养，10 ℃恒温培养2 d，检测滤纸降解情况，14 d后测定秸秆降解率，以原菌液为CK。选择制备的低温高效降解玉米秸秆复合菌制剂3 g，将样品分别密封后，分别存于4 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃保温箱中，2 d后观察滤纸降解情况(方法同上)，14 d后测定秸秆降解率。以原菌液为CK。

1.7.4 负载量的测定

载体与菌液最佳负载量配比测定：分别称取1 g载体与菌液按一定比例混合(具体配比见表 4)。2 d后观察滤纸降解情况(方法同上)，14 d后测定秸秆降解率，以原菌液为CK。

菌剂与秸秆负载量配比试验：分别称取0.002 g、0.01 g、0.05 g、0.25 g、1.25 g菌剂放入三角瓶中，每瓶放入2 g 秸秆，每个处理重复3 次，14 d后取样测定秸秆降解率。以原菌液为CK。

1.8 数据处理

利用IBM SPSS Statistics 19.0 统计软件对试验结果进行统计分析，所有数据均采用3 次重复的平均值依标准偏差表示。不同处理间的差异显著性采用配对样本进行评价。采用Sigmaplot 12.5 进行数据分析和绘图。

2 结果与讨论 2.1 复合菌系GF-S72 培养基优化

本试验中，采用纤维素酶活来表征微生物的生长状况。在供试的6 种氮源中，GF-S72 在以尿素为氮源时生长最好，其次是硫酸铵，蛋白胨最差(P＜0.05，图 1)。由此可以看出，GF-S72对无机氮的利用率好于有机氮。当选择尿素作为最佳氮源，其浓度为0.1%时，GF-S72 的生长状况最好(P＜0.05，图 2)。此外，在供试的5 种碳氮比条件下，GF-S72 在碳氮比为20:1 时生长最好，其次是碳氮比10:1，碳氮比为0.1:1 时生长最差(P＜0.05，图 3)。当碳氮比为10:1时FPA 酶活高于其他比例，因此需要做正交试验进一步验证。

2.2 复合菌系GF-S72 培养条件优化

选择培养温度、装液量、培养时间、初始pH、接种量五个因素，每个因素设定合适的水平数，对复合菌系GF-S72 进行培养条件单因素优化，并对所得数据进行单因素方差分析。由图 4 可知，装液量、培养时间三种酶活统一，培养温度、初始pH、接种量这三个因素三种酶活不统一。据此就这三个指标做了正交试验，进一步验证单因素试验。

2.3 复合菌系GF-S72 正交试验

根据单因素试验结果，选择合适因素和水平(表 1)，按正交试验对GF-S72 复合菌系培养条件(培养温度、初始pH、接种量、碳氮比)进行优化，每个处理3个重复，对所得数据进行分析，结果见表 2。四个因素对试验结果影响强弱顺序为C(培养温度)＞B(初始pH)＞D(碳氮比)＞A(接种量)；C1酶活的正交试验结果与FPA和Cx酶活正交试验结果稍有不同。结合单因素结果可得，复合菌系GF-S72最佳摇瓶培养条件为：接种量2%，初始pH8，培养温度10 ℃，碳氮比20:1。

2.4 复合菌系GF-S72 载体筛选试验

由表 3 可知，硅藻土效果最佳，白炭黑、滑石粉、轻质碳酸钙的滤纸降解情况优于凹凸棒土及皂土，低于硅藻土。但是硅藻土、凹凸棒土及皂土的玉米秸秆降解率明显优于白炭黑、滑石粉、轻质碳酸钙。该结果表明，白炭黑、滑石粉、轻质碳酸钙与GFS-72 复合菌系的生物相容性较差。就硅藻土、凹凸棒土、皂土做方差分析显示，硅藻土明显优于后两种载体，因此选择硅藻土作为填料。

2.5 GF-S72 复合菌剂质量指标的测定 2.5.1 pH 对复合菌剂生长的影响

GF-S72 复合型菌剂pH 值为8.2，与之前发酵条件测得的最适pH 值相差不大，能很好满足复合菌系生存，符合标准。

2.5.2 含水量对复合菌剂降解率的影响

本试验测得复合型菌剂的含水量为1.42%。含水量及保藏湿度测定结果表明，菌剂在不同储藏条件下对菌株存活率影响很大，水分过高，菌体代谢旺盛，死亡率高，还容易造成粘结成团，影响制剂使用。但菌剂含水量也不是越小越好，如果粉体过于干燥，含水量接近零点，则微粒对周围环境中水分吸收强，且因为干燥微粒间存在强静电，吸收的水分子与微粒会迅速结成稳定的晶体结构，造成粉体絮结成坚硬的块状，影响制剂的湿润性和分散性。因此，将菌剂中水分控制在合理范围内及选择合适保藏湿度对于菌剂加工和应用都具有非常重要的意义。

由表 4 可知，10%的湿度降解滤纸情况明显高于其他处理，其次是0%和20%，而40%和80%几乎无降解。在供试的5 种比例中，GF-S72 在保藏湿度为10%时，玉米秸秆降解率最高，菌株最活＞，说明在此湿度下，复合菌系可以最大程度地与载体相容，其次是保藏湿度20%，保藏湿度为80%时最差。

2.5.3 保藏温度对复合菌剂降解率的影响

保藏温度测定结果表明，GFS-72 复合菌剂在贮藏温度为15℃条件下，滤纸降解情况和秸秆降解率明显比其他条件高。其次是25℃，最差为45℃。这一结果也验证了低温降解菌系在高温条件下玉米秸秆降解能力下降的现象(表 5)，说明最适保存温度为15 ℃。

2.5.4 负载量对复合菌剂降解率的影响

(1) 当菌液与载体配比为3:1 时，降解滤纸情况和秸秆降解率都明显高于其他条件，随着菌液稀释浓度越高，降解滤纸能力越低，玉米秸秆降解率也随之降低(表 6)。在供试的14 种比例中，GF-S72 在菌液比载体比例为3:1 时，玉米秸秆降解率最高，说明在此比例下，复合菌系可以最大程度地与载体相容，保持菌株之间的活＞性。S1:1 次之，S7:1 最差(表 6)。

(2) 当加入菌剂为0.05 g时，玉米秸秆降解率最高，因此最适菌剂量为0.05 g。在供试的5 种比例中，GF-S72 在菌剂为0.05 g时，玉米秸秆降解率最高，说明在此比例下，菌剂与玉米秸秆比例最佳。0.002 g次之，1.25 g 最差(图 5)。

3 结论

(1) 采用单因素和正交试验，确定复合菌系GF-S72最佳发酵条件为：尿素0.1%、碳氮比20:1、培养温度10 ℃、初始pH 为8、装液量为18 mL/150 mL、培养时间为6 d、接种量2%。

(2) 通过试验选取硅藻作为最佳载体，且在菌液:载体=3:1、菌剂与秸秆配比为0.05 g/2 g，制备低温高效降解玉米秸秆复合型菌剂。

(3) 在pH 值8.2、含水量1.42%、保藏湿度10%、保藏温度15 ℃时，复合型菌剂降解效率最好。

由于本试验并未考虑成本问题，菌株如果应用到实际生产，还应综合考虑各方面因素，在保证菌株降解效果的前提下，选用廉价原料和合适的培养条件，使菌剂的生产效℃最大化。