臭氧（O₃）是近地层空气中二次气体污染物，属短生命期的温室气体，除少量经平流层向近地面传输及自然产生（自然源）外，大部分是由氮氧化物（NOx）和挥发性有机物（VOCs）等前体物质经光化学反应生成的^[1]。近年来，由于化石燃料燃烧、含氮化肥的过度使用及汽车尾气排放急剧增加，导致O₃浓度升高^[2-3]，特别在光照强度大、风速低的气候条件下，近地层中的O₃易积累至较高浓度^[4]。有文献表明^[5-6]，长江三角洲地区作为我国水稻的主要产区之一，近年来O₃浓度逐年攀升，其污染已成为该地区农作物产量损失的一个主要原因^[7-8]，目前平均监测浓度可达50~60nL·L^-1，最高达到150nL·L^-1，对栽培植物已产生严重的负面影响^[9]，而未来O₃浓度进一步增加将使这种伤害变得更为严重^[10]。

水稻是世界上最重要的作物之一，种植面积分布非常广泛，全世界超过一半人口以此为主食。近年来国内外开展了大量有关O₃浓度升高对水稻影响的研究，但多数集中在生长发育和产量形成方面^[11]，鲜有涉及到O₃胁迫下水稻品质的响应。仅有的几例研究表明，稻米或稻草^{[1, 2-14]}品质在O₃ 胁迫下表现出总体变劣的趋势。水稻中富含人类健康不可或缺的P、K、Mg、Ca、Fe、Zn 等多种矿质元素^[15]，其在植物代谢中起着重要作用。因此，高臭氧浓度环境下水稻矿质元素吸收和利用的变化势必影响作物的生长发育，同时通过土壤输入（如秸杆还田和根茬输入）影响元素的地球生物化学循环^[16]，进而对环境造成影响。但迄今为止，这方面的研究非常有限。前期研究表明，O₃ 胁迫对水稻生长的影响因品种而异，但这些研究一般只局限于少数几个品种^[17-19]。鉴于此，本研究依托新型自然光气体熏蒸平台，以23个不同O₃敏感型水稻品种（或株系）为供试材料，采用自然采光特别是土培方式培育水稻植株。试验设室内对照（约10 nL·L^-1）和高浓度O₃处理（100 nL·L^-1）两个水平，于水稻成熟期测定植株叶片和茎秆中N、P、K、Ca、Mg、Mn、Fe、Cu和Zn 的浓度，研究O₃胁迫对不同敏感类型水稻营养器官元素浓度、吸收量和分配的影响，旨在为地表O₃浓度升高情形下我国水稻耐性品种的选育提供科学依据。

试验于2013 年在扬州大学农学院（119.42毅E，32.39毅N）自然光气体熏蒸平台上进行。土壤类型为清泥土，所在地年均降水量1000 mm左右，年均蒸发量在940 mm 左右，年平均温度15℃，年日照时间大于2100 h，年平均无霜期220 d。土壤理化性质为：有机质24.3 g·kg^-1，全N 1.5 g·kg^-1，碱解N 126.1 mg·kg^-1，全P 0.66 g·kg^-1，速效P 13.4 mg·kg^-1，速效K 35.2 mg·kg^-1，电导率0.17 mS·cm^-1，pH₇.1，土壤中砂粒（0.02~2mm）占57.9%，粉砂粒（0.02~0.002 mm）占28.4%，黏粒（＜0.002 mm）占13.7%。

实验平台的结构和控制详见前报^[20]，简要说明如下：采用分布式拓扑结构，通过实时监测由平台附属气象站观测采集到的温度变化，利用温度调控系统实现对外界环境的动态模拟，使气室内的温度与室外的差异维持在最小水平。试验共设置两个处理，即对照（C-O₃）和高臭氧浓度（设定为100 nL·L^-1，E-O₃）处理，每处理两个气室，即重复两次。臭氧熏气时间设定为每天上午9：00 至下午5：00。相对湿度在7 月22日之前设定为78%，后根据室外平均湿度改为65%，9月3 日至10日又调整为50%。温度、光照和大气压力动态模拟外界环境。臭氧是以纯氧为气源，由佳环臭氧发生器（QD-001-3A）产生，通过Model 49i 臭氧分析仪对O₃浓度进行即时检测。

水稻返青后即6 月13 日开始进行熏气处理，9月10 日停止熏气，共90 d。平台运行期间，除因设备故障、雷雨天气以及臭氧分析仪校准等原因暂停布气外（6 月17日、7 月10 日、7 月17—18 日和7 月20—21 日，共6 d），其余时间系统运行正常。

以23 个水稻品种或株系为供试材料，分别为L2、L9、L12、L17、L26、L35、L36、L48、L54、L56、L71、L81、L82、L92、L95、L105、L147、L152、L154、L156、Nippon原bare、SL41 和SL46，其中SL41 和SL46 为Nipponbare和野生稻品种Kasalath 杂交得到的两个株系，其余均为SL41 和SL46 杂交再自交得到的株系。大田旱育秧，于5月14日播种，6月5日移栽，9 月10 日开始收获。密度为27株·m^-2，每室3 个重复。全生育期总施氮量为15 g·m^-2，其中6 月4 日施基肥（占总施氮量的60%），7 月20 日施穗肥（占总施氮量的40%）；磷、钾肥总施用量均为7 g·m^-2，均作为基肥一次性施用。氮、磷、钾肥分别使用尿素（有效成分）、过磷酸钙（有效成分27.5%）和氯化钾（有效成分60%）。水分管理为6 月5 日—7 月15 日保持水层（约4 cm），7 月16日—7 月25 日控水搁田，以轻搁为主，7 月26日—8 月10 日保持水层（约3 cm），8 月10 日以后干湿交替，8 月25 日后断水。适时进行病虫草害防治，保证水稻正常生长发育。

成熟期以穴为单位分别测定各品种地上部不同营养器官（叶片、茎鞘和稻穗）干物重（105℃杀青30 min，80℃烘干72 h），并计算植株地上部总干重。利用植物微型粉碎机将植株茎鞘和叶片部位粉碎后，称取样品0.1 g 左右置于50 mL 消化管中，并加入5 mL 浓H₂SO₄ 置于360℃的红外消煮炉上，该过程中加30%分析纯的H₂O₂直到消煮液呈透明状，且无气泡产生，即可取出冷却定容，再稀释10 倍后，用化学自动间断分析仪（SMART CHEM 200）测定N的浓度。营养器官P、K、Ca和Mg元素浓度用IRIS 电感耦合离子体原子发射光谱仪（ICP，Thermo Elemen原tal，美国）测定，即元素浓度=测定值伊10伊50伊10-3衣0.1mg·g。Mn、Fe、Cu 和Zn 元素含量的测定采用马弗炉（F6010 Blue M，Thermolyne）灰化法：称取0.1 g 左右样品，移入10 mL 坩埚中，置于马弗炉中480℃下灰化16 h，冷却后加入2 mL 25%HNO₃静置3~5 h，加8mL纯净水，过滤后用IRIS 电感耦合离子体原子发射光谱仪测定Mn、Fe、Cu和Zn 浓度，即元素浓度=测定值伊10衣0.1 mg·kg^-1，最终元素吸收量=元素浓度伊对应部位总生物量。稻草部位元素吸收量为叶片和茎鞘元素吸收量之和，稻草部位元素浓度=稻草部位元素吸收量/（叶片生物量+茎鞘生物量）。

最小组内平方和动态聚类方法是以组内平方和之和最小为标准的新的动态聚类方法，能有效地调整初始分组中的个体，使其达到最优的分类，并具有良好的稳健性^[21]。本研究采用这种聚类方法将供试材料按成熟期地上部生物量对臭氧胁迫的响应从低到高依次分为粤、月、悦共3 种类型。使用Excel 软件进行基础统计和作图，应用SPSS19.0 软件进行数据标准化处理和方差分析，显著水平设P<0.01、P<0.05、P＜0.1、P>0.1，分别用**、*、+和ns表示。

熏蒸平台臭氧、温度、光照和大气压的日平均曲线示于图 1。熏蒸平台的控制一般用TAR（TargetAchievement Ratio，实际测定值/设定目标值）值来表示，TAR 值越接近1，则控制精度越高。图 1 表明，室内对照和高浓度臭氧处理熏蒸期间平均臭氧浓度分别为10.4 nL·L^-1和100.1 nL·L^-1（图 1A），臭氧精度控制的TAR 值为1.01。整个臭氧熏蒸期间的各室平均温度（图 1B）和大气压力变幅（图 1C）分别为32.1~32.2℃和99.2~99.6 kPa，TAR 值均达到1.00。室内对照和臭氧处理的平均光照值分别为26.8 klx 和29.0klx（图 1D），TAR值为1.6。

图 1 2013 年水稻生长季自然光气体熏蒸平台的控制状态 Figure 1 Performance of greenhouse-type gas fumigation device in 2013 rice growing season

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本研究采用组内最小平方和的动态聚类分析方法，根据23 个水稻品种或株系成熟期地上部生物量对臭氧胁迫的响应大小，从低到高依次分为A、B 和C 类共3个类别，各类型材料数分别为3、13 和7 个。与对照相比，臭氧胁迫使A、B、C 类水稻地上部生物量平均分别下降9.3、22.4 g·plant-1 和28.6 g·plant-1，降幅分别为19.2%、38.5%和51.8%，后两者达极显著水平（图 2和表 1）。方差分析表明，臭氧处理、水稻类型及其互作对地上部生物量的影响分别达0.01、0.05、0.1 显著水平（图 2）。多重比较表明，地上部生物量对臭氧胁迫的响应不同水稻类型间均达极显著水平（表 1）。

图 2 臭氧胁迫对不同类型水稻成熟期地上部生物量的影响 Figure 2 Effects of ozone stress on aboveground biomass of different types of rice at maturity

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表 1 供试材料地上部生物量对臭氧胁迫响应（%）的统计分析 Table 1 Statistical analysis of above-ground biomass of different types of rice in response to ozone stress

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所有供试材料平均，臭氧胁迫使叶片N、K、Mg、Mn、Fe 和Zn 浓度分别增加14%、14%、23%、24%、33%和13%，使Ca 浓度减少20%，均达极显著水平，而对P和Cu 浓度无显著影响（图 3a）。除K 外，臭氧和水稻类型的互作对叶片所有测定元素浓度均无显著影响（图 3a）。多重比较表明，叶片各元素浓度对臭氧的响应不同水稻类型间均无显著差异（表 2）。

图 3 臭氧胁迫对不同类型水稻叶片、茎鞘和稻草元素浓度的影响 Figure 3 Effects of ozone stress on elements concentrations of leaf，stem and straw of different types of rice

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表 2 不同类型水稻叶片、茎秆和稻草各元素浓度、吸收量及其分配对臭氧胁迫的响应（%） Table 2 Responses of elements concentration，uptake and allocation in different types of rice to ozone stress（%）

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对茎鞘而言，臭氧胁迫对Ca 浓度没有影响，但使N、P、K、Mg、Mn、Fe、Cu 和Zn 浓度分别增加20%、9%、22%、29%、40%、14%、26%和34%，多数达极显著水平（图 3b）。尽管B、C两类水稻茎鞘元素浓度对臭氧响应显著的数量（均为7 个元素）多于A 类水稻（4个元素），但臭氧和水稻类型的互作对各元素浓度（除Cu 外）均无显著影响。多重比较表明，水稻茎鞘中N和Fe 浓度对臭氧胁迫的响应在A 类与C 类水稻间存在显著差异，但其他元素对臭氧的响应在不同类型间均无显著差异（表 2）。根据叶片和茎鞘元素浓度计算稻草元素浓度，结果示于图 3c。臭氧处理使稻草中N、P、K、Mg、Mn、Fe、Cu 和Zn 浓度分别增加24%、5%、22%、33%、42%、13%、20%和25%，均达显著或极显著水平，但对Ca 浓度无显著影响。与此不同，臭氧处理与水稻类型间的互作均未达显著水平。表 2 表明，稻草N、Mg、Fe浓度对臭氧的响应A 类与C 类间存在显著差异，但其他元素不同水稻类型间均无差异。

臭氧胁迫使叶片Ca 吸收量减少（26%），使Mg、Fe、Mn 吸收量增加（增幅为13%~23%），但对其他元素吸收量均无显著影响（图 4a）。除Fe和Cu外，臭氧处理与水稻类型的互作对其他元素吸收量的影响均达显著或极显著水平（图 4a）。多重比较表明，叶片P、K、Mg 吸收量对臭氧胁迫的响应三种水稻类型间差异均达显著差异，其他元素吸收量对臭氧的响应A与B 和A 与C 类水稻间均存在显著差异，但B、C 两类水稻间没有差异（表 2）。

图 4 臭氧胁迫对不同类型水稻叶片、茎鞘和稻草元素吸收量的影响 Figure 4 Effects of ozone stress on elements uptake of leaf，stem and straw of different sensitivities of rice

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臭氧胁迫使茎鞘所有元素的吸收量均大幅下降。N、P、K、Ca、Mg、Mn、Fe、Cu 和Zn 吸收量分别减少29%、36%、28%、44%、25%、19%、30%、28%和23%（图 4b）。臭氧和水稻类型的互作均达显著或极显著水平（除Ca 外），表现在臭氧胁迫下茎鞘各元素吸收量的降幅总体上为C 类>B 类>A 类水稻。多重比较表明，茎鞘N、K、Mg、Mn、Fe 吸收量对臭氧胁迫的响应在不同类型间差异均达显著或极显著水平，P 和Zn吸收量A、B 两类水稻间没有差异，但这两类与C 类水稻均有显著差异（表 2）。

对稻草而言，臭氧胁迫使N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu和Zn 吸收量平均分别减少16%、29%、18%、34%、11%、21%、20%和17%，但对Mn吸收量无显著影响（图 4c）。从不同类型看，臭氧胁迫对A类水稻稻草各元素吸收量均无显著影响（Ca除外），但使B和C两类水稻各元素吸收量均大幅下降，且C 类水稻降幅更为明显，表现在臭氧与水稻类型间的互作均达显著或极显著水平（图 4c）。多重比较表明，不同类型水稻间稻草各元素吸收量对臭氧的响应多存在显著差异（表 2）。

与对照相比，臭氧胁迫使稻叶中N、P、K、Ca、Mg、Mn、Fe、Cu 和Zn 元素累积量与茎鞘中的比值平均分别增加53%、47%、52%、32%、54%、46%、92%、37%和37%，除Cu外均达极显著水平。方差分析表明，叶片与茎秆中元素吸收量的比例在不同水稻类型间多存在显著或极显著的差异，但臭氧和水稻类型间均无交互作用（图 5）。多重比较表明，除P、Fe 外，不同类型水稻间叶片与茎鞘元素累积量的比例对臭氧胁迫的响应均无显著差异（表 2）。

图 5 臭氧胁迫对水稻叶片与茎鞘各元素吸收量比值的影响 Figure 5 Effects of ozone stress on ratio of elements uptake in rice leaf to stem

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试验平台是在借鉴传统气候室优点的基础上研制的一种新型自然光气体熏蒸平台^[20]。平台自然采光并用群体土培方式培育试验材料，同时对室外温度进行动态模拟，使控制区域内的微环境更接近自然条件。气室运行数据表明，尽管光照强度由于平台框架结构的影响控制精度稍低，但其他因子如臭氧和温度的控制与目标值接近，满足了试验的要求（图 1）。

水稻地上部生物量的积累是形成籽粒产量的物质基础，是衡量作物逆境条件下生长状况的重要指标。臭氧胁迫使水稻光合作用和生长发育受到抑制，造成最终生物量下降^{[11, 22-23]}。Ainsworth^[24]对气室研究中68 个观察值的整合分析表明，与过滤空气相比，84nL·L^-1臭氧浓度使水稻地上部生物量平均下降16%，变幅为8%~24%。本试验依据收获期地上部生物量对臭氧胁迫的响应大小，通过聚类分析将23 个供试水稻品种或株系分为A、B、C 3种敏感类型。同类水稻所有供试材料平均，臭氧胁迫使A、B 和C 类水稻地上部最终生物量分别下降19%、39%和52%，类型间差异均达极显著水平（图 2 和表 2）。与整合分析结果相比，尽管A 类水稻生物量的响应相近，但B、C 两类水稻的降幅分别增大了2倍和3倍。这除了与本试验设置的臭氧处理浓度略高（100 nL·L^-1）有关外，可能亦与水稻生长季遭遇极端高温有关。该生长季臭氧熏蒸期间平均温度超过35℃的多达29 d，日最高气温超过38℃的多达12 d，且多集中在7 月下旬至8 月中旬期间（图 1B），对水稻开花和灌浆过程均造成明显的负面影响。当然，臭氧胁迫与气温之间是否存在互作还需进一步研究。

臭氧胁迫使水稻生物量降低，但使植株元素浓度多呈增加趋势^[25-26]。本研究发现除Ca元素外，臭氧胁迫使水稻叶片、茎鞘和稻草中其他元素（N、P、K、Mg、Mn、Fe、Cu和Zn）浓度均呈增加趋势，增幅分别为4%~33%、13%~40%和13%~42%，多达显著水平（图 3）。这些元素直接参与叶片光合作用、碳水化合物的代谢，淀粉、蛋白质合成等一系列生理过程，因此臭氧胁迫导致的元素浓度增加可能是水稻自身对逆境的一种适应。植物的蒸腾作用是吸收钙元素的主要动力，臭氧胁迫使叶片气孔导度下降，植株蒸腾减弱，可直接导致钙的吸收下降，因此水稻叶片和茎秆钙的浓度下降或不变，不同于其他元素浓度增加的趋势。研究还发现，无论是叶片、茎鞘和稻草，尽管臭氧胁迫使测定元素的浓度多呈增加趋势，但不同敏感类型水稻间多无显著差异，方差分析（图 3a~图 3c）和多重比较结果（表 2）均说明了这一点。相关分析表明，臭氧胁迫下地上部生物量的响应与稻草及其组分中测定元素浓度（除N外）的响应均未达显著相关水平（表 3），进一步说明臭氧胁迫下水稻元素浓度的增幅与其对臭氧的敏感性无明显关联。这一结果说明，臭氧胁迫导致的元素浓度增加，除了与“浓缩”效应有关外^[27]，可能还与其他因子的变化相关联。已有文献表明，与其他作物相似^[28]，臭氧胁迫对水稻地下部生长的影响通常要大于地上部，导致根冠比减少^{[11, 23]}。这种资源分配策略有助于减弱逆境对地上部叶片光合作用的影响，但同时亦影响水稻对土壤矿质元素的吸收。臭氧胁迫下敏感品种根系受到的伤害可能大于钝感品种，导致对矿质元素吸收的抑制作用增大。除此之外，臭氧胁迫导致气孔关闭引起的蒸腾下降，敏感水稻可能明显大于钝感水稻^[29]，亦会影响植株对元素的吸收和转运。以上两个因素对水稻元素浓度影响的方向与“浓缩”效应刚好相反，可能是本试验不同敏感类型间水稻茎叶元素浓度对臭氧响应没有差异的重要原因。

近地层臭氧浓度升高对植物尤其对水稻植株的营养元素吸收量的影响目前鲜有报道。小麦研究结果表明，地表臭氧浓度增加50%使小麦秸秆中P、K 元素吸收量呈降低趋势，但降幅因品种而异^[30-31]。本研究表明，臭氧胁迫下稻叶元素吸收量的响应呈现3 种情形（增加、减少或没有变化），但多数情况下变幅较小；与此不同，臭氧胁迫导致供试材料茎鞘和稻草各元素的吸收量均大幅下降，降幅分别为19%~44%和5%~34%，多达0.05 以上显著水平（图 4）。稻草作为饲料主要来源，臭氧胁迫下水稻茎叶中元素累积量的不均衡下降，可能会给用稻草作为部分饲料来源地区的动物健康带来隐患。从稻草组分看，对照茎鞘、叶片元素浓度的响应可以推知，臭氧胁迫下叶片元素吸收量的降幅小于茎鞘主要与生物量的响应有关：所有供试材料平均，茎鞘生物量的降幅（-41%，P<0.01）平均是叶片生物量降幅（-8%，P=0.09）的5 倍。从不同类型水稻看，臭氧胁迫对C 类水稻营养器官元素吸收的负面影响最大，A 类水稻最小（甚至增加），而B 类水稻多介于两者之间，叶片、茎鞘和稻草趋势一致（图 4a~图 4c）。相关分析亦表明，臭氧胁迫下稻草及其组分所有测定元素（除Cu 外）吸收量的响应与地上部生物量的响应均达极显著正相关（表 3）。以上结果说明，臭氧胁迫对水稻营养器官中元素吸收量的影响可在较大程度上反映水稻生长对臭氧胁迫的敏感性。

表 3 水稻不同部位各元素浓度、吸收量及其分配对臭氧胁迫响应与生物量响应的关系 Table 3 Relationships between ozone-induced changes in above-ground biomass and elements concentration，uptake and allocation in different parts of rice plants

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臭氧胁迫对水稻元素吸收在不同器官中的分配报道甚少。本研究表明，与对照相比，臭氧胁迫对水稻叶片和茎鞘中所有元素吸收量的比值均大幅增加，除Cu 元素外均达极显著水平。这种响应模式与臭氧胁迫下水稻物质分配的变化一致。本试验数据表明，臭氧胁迫使干物质在叶片中的分配比例平均增加51%（P<0.01），而使茎鞘中的分配比例平均减少8%（P＜0.01），说明臭氧胁迫下水稻有更多的光合产物被分配至叶片中，而茎鞘表现出相反趋势。这种物质分配的变化在水稻^{[11, 22-23, 32]}和其他作物^[33]中均有报道。叶片是臭氧胁迫的最初感应器官，当受到臭氧伤害时，植物体本身存在一个自我修复机制，即利用更多的能量和物质来修补叶片的损伤以维持植物必须的光合作用，从而减少了茎秆中光合产物和矿质元素的累积。本研究还发现，方差分析（图 3）、多重比较（表 2）和相关分析（表 3）均表明，臭氧胁迫对元素在茎、叶中的分配比例不同敏感类型水稻间没有差异，说明根据这一参数的变化难以判定水稻对臭氧胁迫的敏感性。

多数情形下，臭氧胁迫使水稻营养器官中各元素浓度明显增加，但吸收量则呈明显的下降趋势。高臭氧浓度环境下元素在稻叶中的分配比例增加，而在茎鞘中分配比例减少。臭氧胁迫下敏感水稻元素吸收的受抑程度明显大于钝感水稻。需要指出的是，由于本试验水稻生长季遭遇高温热害，部分水稻结实能力明显受到影响，个别材料没有结实，故本试验没有测定稻穗部位（籽粒），本试验观察的现象及其内在生理机制还需进一步的研究，特别是在完全开放的大田条件下。