集约化养殖在带来产量的同时，也使水质恶化和水产品质量安全问题加剧。就水质净化而言，池塘原位修复技术主要以“鱼-菜共生”养殖模式为代表，该模式利用人工构建的生态浮床在养殖水体上层栽培蔬菜，达到水体净化目的的同时，也额外增加经济效益^[1]。作者所在课题组前期采用循环水养殖^[2]和“鱼菜共生”体系构建^[3]在池塘原位修复上做了诸多工作，研究结果均表明鱼菜共生体系不仅能提高农户单位面积的产值，还能对池塘水体氮、磷有很好的去除效果。近几年来，中草药已经被广泛用于调控池塘水质，国内也早已开始将中草药用于治疗（或预防）鱼类的单殖吸虫等疾病^[4]，增强鱼类免疫能力^[5]。

鱼类主要免疫因子包括金属硫蛋白（MT）、免疫球蛋白（IgM）、转铁蛋白（TRF）、干扰素-酌（IFN-酌）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-10（IL^-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和表皮生长因子（EGF）等。MT 能够调节机体必需重金属的稳态及对有害重金属进行解毒，并起氧化应激防护作用；IgM 是鱼类适应性体液免疫应答中最主要的介质^[6]；TRF 主要功能是负责机体中的Fe3+在吸收、储存和利用部位间的传递，是呼吸链中的重要因子^[7]；IFN-酌在天然免疫和适应性免疫应答（如抗病毒感染和皮肤免疫）中均发挥着重要的作用^[6]；白细胞介素是一类促炎反应的前期细胞因子^[6]，IL-8/IL^-10 是一种中性粒细胞、T 细胞及嗜碱性粒细胞的趋化因子，因此在免疫和炎症过程中具有重要调节意义；TNF-α是一种能杀伤某些肿瘤细胞并使体内肿瘤组织发生坏死的因子^[6]；EGF 是促进细胞内DNA、RNA 以及蛋白质的合成，从而诱导细胞的有丝分裂、迁移和分化等过程^[8]。

吉富罗非鱼（GIFT tilapia，Oreochromis niloticus）是1993年以来在菲律宾利用尼罗罗非鱼的四个非洲品系和四个亚洲品系等广泛的优良种质资源选育而成的新品种，目前该品种已在苏北地区大量养殖。鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb）在四川、重庆、湖南、贵州、安徽以及广东地区有大量种植，研究表明浮床栽培鱼腥草不仅可以改善罗非鱼池塘水质指标^[9]，还可明显提高吉富罗非鱼非特异免疫能力^[10]。胆汁作为肝脏的分泌产物，对污染物的蓄积能力很强^[11]。前期观察发现不同养殖状态下吉富罗非鱼胆汁液颜色出现差异，其主要原因在于胆汁液中的胆红素（黄色）和胆绿素（胆红素氧化而来）之间可以互相转化。本试验选择胆汁作为研究对象的原因：通过对胆汁液的分析不仅可以反映环境水体的污染状况^[12]，还能在一定程度上反映鱼体自身的免疫能力；吉富罗非鱼胆较大易于取样。本研究针对鱼腥草-罗非鱼共生这一实例，旨在从鱼类免疫增强角度，探究鱼腥草种植后对吉富罗非鱼胆汁液中免疫因子的影响，为鱼腥草-罗非鱼共生体系构建的应用前景及其推广提供数据支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料与设计

试验基地为中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴屺亭养殖基地。试验用池塘每口面积为1333 m2，水深1.5 m，并配备微孔增氧系统。养殖品种为大规格“新吉富”罗非鱼（Oreochromis niloticus）越冬种，平均投放规格为（42±2.1）g·尾^-1，养殖密度为1750尾·667m^-2，同时搭配少量滤食性鲢鱼（20尾·塘^-1）和鳙鱼（30 尾·塘^-1）。浮床植物选用鱼腥草，试验分4口塘进行种植（浮床面积占池塘面积比例分别为0、5%、10%和15%），试验于2015 年5 月开始，至10 月结束。每日上午8：00 进行定量投喂1次，饲料为天邦罗非鱼膨化料（编号5532、5533、5534、5536），饲料饲喂量占鱼体重比例为3%。养殖期间的病害防控及日常管理基本一致，除池塘水分渗漏、蒸发补水外，养殖过程池塘不换水，且用水符合渔业水质标准（GB11607—1989）。

试验选用PVC 管材料（ψ50 mm）制作的浮床，规格为2 m×2 m。浮床两面分别用网孔为30 mm（便于鱼腥草扦插）的网片包裹。试验开始前，将预先培育好的鱼腥草苗（株高20 cm），按株距30 cm×行距20 cm进行扦插，种植前根茎和叶总重在43~129 g·m^-2 之间，收割后根茎和叶总重在173~519 g·m^-2 之间^[9]，浮床集中固定在池塘中排列整齐，每3 个浮床用尼龙绳连接成组。

1.2 八种免疫因子测定

试验结束后，从每个处理组中随机挑选30 尾鱼，采集吉富罗非鱼胆汁液。八种免疫指标包括：金属硫蛋白（MT，检测范围0.05~20 ng·mL^-1）、免疫球蛋白（IgM，检测范围0.05~10 mg·mL^-1）、转铁蛋白（TRF，检测范围5~2000 mg·L^-1）、干扰素-酌（IFN-酌，检测范围5~1000 ng·L^-1）、白细胞介素-8（IL-8，检测范围0.5~200 ng·L^-1）、白细胞介素-10（IL^-10，检测范围2~600ng·L^-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，检测范围3~900ng·L^-1）和表皮生长因子（EGF，检测范围5~2000 ng·L^-1），其测定方法均按南京酶联免疫试剂盒说明书进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 统计学分析

数据结果均用X軍依SD 的方法表示，免疫指标用SPSS11.0 软件进行ANOVA显著性分析，P<0.05 认为差异显著，用不同小写字母表示。

2 结果

5%和10%处理组显著提高吉富罗非鱼胆汁液中MT 的含量（图 1），15%处理组与对照组没有显著性差异。

5%、10%和15%处理组均显著提高吉富罗非鱼胆汁液中IgM 的含量（图 2），且浓度依赖性下降（P＜0.05）。

5%、10%和15%处理组均显著提高吉富罗非鱼胆汁液中TRF的含量（图 3），随处理面积增加虽呈依赖性下降趋势，但5%和10%处理组并未达到显著水平（P>0.05）。

5%处理组显著提高吉富罗非鱼胆汁液中IFN-酌的含量（图 4），10%和15%处理组显著降低吉富罗非鱼胆汁液中IFN-酌的含量，且10%处理组显著高于15%处理组。

5%处理组显著提高吉富罗非鱼胆汁液中IL-8和IL^-10 的含量（图 5、图 6），10%和15%处理组显著降低吉富罗非鱼胆汁液中IL-8 和IL^-10 的含量。10%处理组IL-8 显著低于15%处理组，但10%处理组IL^-10与15%处理组无显著性差异（P>0.05）。5%、10%和15%处理组均显著提高吉富罗非鱼胆汁液中TNF-α的含量（图 7），且10%处理组和15%处理组无显著性差异（P>0.05）。

5%、10%和15%处理组均显著提高吉富罗非鱼胆汁液中EGF 的含量（图 8），且10%处理组和15%处理组无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

免疫毒理学（Immunotoxicology）是毒理学的一个新分支，主要研究药物和物理因素对人和动物免疫系统产生的不良影响和机理。鱼类参加免疫应答的细胞主要有巨噬细胞和淋巴细胞，这些免疫细胞产生的细胞因子包括白细胞介素（参与免疫和炎症过程）、IFN-酌（参与免疫调节）、EGF（促免疫细胞分化）和TNF-α（参与机体免疫调节、巨噬细胞活化）等。史丽娜等^[10]对鱼腥草-罗非鱼共生体系的研究表明，吉富罗非鱼血清溶菌酶（LSZ）、一氧化氮（NO）、碱性磷酸酶（AKP）以及超氧化物歧化酶（SOD）酶活力均高于对照塘，从而提高其成活率及产量。感染黄杆菌（Flavobacterium psychrophilum）的虹鳟鱼鳃、肝脏、脾脏和肾脏等器官中MT、IL1茁和TNF-茁基因表达量显著降低^[13]。本研究中不同鱼腥草种植面积能提高吉富罗非鱼胆汁液中IgM、TRF、TNF-α、EGF的含量，这与鱼腥草在施氏鲟上表现出的抗氧化能力结果相一致^[14]，表明鱼腥草浮床可明显提高吉富罗非鱼非特异免疫能力。

本研究结果表明浮床栽培鱼腥草显著提高罗非鱼免疫力，主要原因在于中草药根系化感作用分泌的黄酮类等物质增加了鱼类的免疫能力^[10]，中草药的根系对水体氨氮、硝态氮、总磷、总氮等主要富营养化因子具有很好的吸收转化作用，进而可以通过改善水质指标达到预防鱼病发生的目的^[10]。作者前期工作表明浮床栽培鱼腥草能降低水体中的污染物含量，并带走一定的氮、磷，5%鱼腥草种植面积（相比10%和15%）适合进行中试，鱼腥草处理组NO₃^--N 下降^[9]，且其收获鱼总重和所测生物学指标（除体重）显著高于对照和其他处理组，并对成活率和饵料系数无大的影响^[9]。本研究中5%鱼腥草处理组能显著提高吉富罗非鱼胆汁液中MT、IFN-酌、IL-8 和IL^-10 的含量，表明吉富罗非鱼养殖池塘种植5%的鱼腥草不仅可以起到免疫增强作用，还能获得良好养殖效益，具有较好的推广应用价值。研究表明农药草甘膦的使用能通过改变草鱼IFN-酌，IL^-1茁（IL^-1亚型）和TNF-α的含量破坏鱼类非特异性免疫能力^[15]，且鱼体内IFN-酌、IL^-10（与IL^-1同属白细胞介素家族）、TNF-α等细胞因子之间能相互作用（如彼此间提供胞内信号）^[16]，如TNF-α和白细胞介素共同参与促或抗炎症反应；IFN-酌参与抗病毒和杀死胞内病原体等。池塘集约化养殖会带来大量的污染物，鱼腥草根系若能带走养殖过程所带来的污染物，将有益于罗非鱼的健康养殖。精养团头鲂池塘的整个停饵期间表层沉积物微生物群落的丰富度和多样性指数较高^[17]，史丽娜等^[5]的研究表明鱼腥草浮床具有增加罗非鱼池塘沉积物菌群功能多样性和优化菌群结构的作用。因此，鱼腥草根系分泌物对水体不同分层微生物的群落结构以及对罗非鱼免疫增强的效应值得进一步研究。

作者所在课题组前期研究结果表明，吉富罗非鱼在低浓度氨氮和亚硝酸盐氮胁迫下，自身机体采取一种主动调节措施，但随着氨氮和亚硝酸盐氮浓度的升高，一些免疫相关酶活性则呈下降的趋势^[18]，MT、TNF-α、IL^-1茁基因表达量显著上升，但IgM 和IGF-1基因表达量显著下降^[19]。本试验中10%和15%鱼腥草处理造成IFN-酌、IL-8 和IL^-10 含量显著下降（图4~图 6），可能与不同表达水平有关（文献^[19]从基因表达方面入手，本研究在蛋白水平）。

4 结论

试验表明5%鱼腥草处理能显著增强吉富罗非鱼胆汁液中所测八种免疫因子的活性。