2017, Vol. 36文章信息
- 崔星怡, 秦俊豪, 李智鸣, 黎华寿
- CUI Xing-yi, QIN Jun-hao, LI Zhi-ming, LI Hua-shou
- 不同品种空心菜对重污染土壤砷的吸收累积及其亚细胞分布
- Accumulation and subcellular distribution of arsenic in water spinach(Ipomoea aquatica) cultivars from arsenic contaminated soil
- 农业环境科学学报, 2017, 36(1): 24-31
- Journal of Agro-Environment Science, 2017, 36(1): 24-31
- http://dx.doi.org/10.11654/jaes.2016-1009
文章历史
- 收稿日期: 2016-08-06
2. 广东省现代生态农业与循环农业工程技术研究中心, 广州 510642;
3. 广东省高等学校农业生态与农村环境重点实验室, 广州 510642
2. Guangdong Engineering Research Center for Modern Eco-agriculture and Circular Agriculture, Guangzhou 510642, China;
3. Key Laboratory of Agroecology and Rural Environment of Guangdong Regular Higher Education Institutions, Guangzhou 510642, China
砷（As）是一种毒性较强且具有致癌作用的类金属[1]。随着工农业的发展，As和含As化合物的大量使用，使土壤As污染问题日益严重[2]。土壤是As 净化和累积的主要场所，土壤As 的世界平均含量约5mg·kg-1，中国为（11.2±7.9）mg·kg-1，且显现出从西南到东北逐渐由高到低的趋势[3]，即西南和华南地区As本底值和污染较高。与世界土壤As含量水平相比，我国As含量较高，《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国土壤中As 的点位超标率为2.7%，在调查的砷、镉、钴、铬、铜、氟、汞、锰、镍、铅、硒、钒、锌等多种无机污染物中，As 的超标率排行第三。土壤中的As 可被农作物吸收，并通过食物链累积放大，最终严重危害人类健康[4]。
蔬菜是人们日常生活中所必需的副食品，有研究表明，蔬菜食用是As 进入人体的主要途径之一[5-6]。空心菜又名蕹菜、通菜、竹叶菜、藤菜等，可食用部分为76%，适宜生长在热带多雨地区，夏秋季普遍栽培，主要分布于岭南地区，是南方较为常见的一种叶菜类蔬菜。根据调查，我国As污染区的蔬菜中48.2%的样本As含量超过0.25 mg·kg-1限量值，32.2%的样本As含量超过0.5 mg·kg-1的限量值，其中叶菜类超标率为47.9%，根茎类蔬菜超标率为12.8%[7]。有研究表明，不同种类蔬菜如萝卜、胡萝卜以及马铃薯的不同品种对As富集积累能力差异很大[8]。宋波等[9]在桂林市13 个县区蔬菜种植基地和蔬菜批发市场共采集71 种566 个蔬菜样品，检测结果表明，叶菜类蔬菜中的As 含量高于根茎类和瓜果类。肖细元等[7]研究表明，不同种类蔬菜的As 含量依次为叶菜类>根茎类>茄果类>鲜豆类，而空心菜在叶菜中也属于抗As 污染能力较弱的物种。Mathieu 等[10]在研究几种叶类蔬菜对As 吸收及累积特性中发现，5 种叶菜对As 的累积顺序是空心菜>芹菜>苋菜>生菜>莴苣，对砷的转移系数均值分别为0.02、0.03、0.06、0.08 和0.15，空心菜对砷的转移系数最大。不同培养液砷浓度下5种蔬菜对砷富集系数的均值以空心菜（18.67）最高，而莴苣和生菜仅为2.75 和2.66，且在1 mg·L-1 As的条件下，空心菜的As 含量就已经远远超过国家食品卫生标准限值。通过前人的研究可以知道空心菜较容易吸收累积土壤中的As，筛选和培育低累积As 的空心菜品种，可充分利用轻、中度重金属污染土壤来生产安全的食物，以期降低普通人群通过食物链对As 的摄入，减少人类As摄取风险。
植物体隔离、积累和耐受重金属的一种重要解毒机制是细胞区隔化，因此植物体中As 的亚细胞组分的分布也可以提供有关积累、耐受、解毒As 的信息[11]。有关砷在植物细胞组织微区及亚细胞分布层面的研究较多[12-13]，但砷在空心菜细胞组织微区及亚细胞分布层面的研究较少，通过亚细胞分级方法分离出亚细胞组分后，用化学分析手段测定各组分中As 的浓度，可以提供As 的亚细胞分布信息，因此探讨As对不同品种空心菜的细胞活动的影响及其生物化学作用具有重要意义[14-15]。
本试验通过收集生产上使用的19 种空心菜品种进行栽培分析，研究在As胁迫状态下各空心菜品种的生物量变化、As 累积差异，并采用组织分离-差速离心的方法，对As在亚细胞中的分布进行了探讨，以期揭示不同品种空心菜对As 的吸附特征及As 对空心菜的毒害效应，为空心菜品种的选择以及保障农产品的质量安全提供重要的参考。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试的19 个空心菜（Ipomoea aquatica）品种购于广东省农科院蔬菜研究所，品种名详见表 2。
1.2 试验设计试验在华南农业大学生态系农场15 个水泥池（长1 m×宽1 m×高0.65 m）中进行。将水泥池内部均分成4 个小区（每个小区尺寸0.5 m×0.5 m），共有小区60块，19个供试空心菜品种均重复3 次共需57块小区（空余3 块不种植物），将19 种不同空心菜的种子各20 粒随机播种于各小区中，待植株长出第1片真叶后定苗4 株。试验期间不定期（1~2 d）向水泥池中加入等量自来水。定植60 d（2015 年4 至6 月）后，取样测定19 个空心菜品种的生物量。
1.3 供试土壤供试水泥池土壤来自华南农业大学生态学系农场的耕作层。土壤采集后剔除碎石、枯叶等杂物，自然风干，过2 mm筛后混匀备用。水泥池小区As污染土壤浓度设置为人工添加As 50 mg·kg-1（以三氧化二砷加入，按耕作层30 cm 计算），种植一季水稻老化As后，取样检测其基本理化性质，见表 1。
从成熟期的4 株空心菜中随机取2 株（全株取回）。选取其中1 株，将整株空心菜地上部与地下部（根系）分开，依次用自来水、蒸馏水、去离子水完全洗净，最后用吸水纸把植株表面水分吸干，装入信封，编号后置于60℃烘箱中烘干至恒重，称干重后用粉碎机将空心菜地上部及地下部粉碎，贮存于封口袋中供总As含量分析。另1 株空心菜洗净后，置于封口袋中保存于-20℃的冰箱中供植株的亚细胞分布测定。
1.4.2 样品的分析总As的测定：称取0.2 g 植物干样，加8 mL 硝酸+2 mL 30% 过氧化氢，经微波消解（CEMMars6）后，用双道原子荧光光度计（AFS-230E，北京科创海光仪器有限公司）测定消解液中As含量。
As 的亚细胞分布的测定：操作参照Hans[16]方法，取新鲜空心菜地上部或地下部的样品0.5 g置于研钵中，加入预冷的提取缓冲液（250 mmol·L-1 蔗糖、50mmol·L-1 Tris-HCl-pH7.5 和1 mmol·L-1二硫赤鲜糖醇）20 mL，充分研磨成匀浆液。将匀浆液在3000 r·min-1下离心15 min，沉淀即为细胞壁组分；上清液在15 000 r·min-1 下离心30 min，沉淀为细胞器组分，上清液则为胞质组分（包括细胞质及液泡）。整个实验操作过程均在4℃下进行。将分离出的胞质、细胞壁、细胞器组分微波消解后，用双道原子荧光光度计测定提取液中As含量。
转移系数=地上部As含量/地下部As含量
1.4.3 数据统计与分析试验数据用Excel 2013进行处理；利用SPSS 20.0中的单因素方差分析（One-way ANOVA）对每个测定项目统计结果进行显著性方差分析，对生物量、As 含量以及亚细胞各组分固持As 含量进行相关性分析，欧式聚类对地上部As含量进行统计分析。
2 结果 2.1 As胁迫对不同品种空心菜生物量的影响由表 2 可知，19 个品种空心菜地上部生物量（以干重计）为1.22~19.43 g，均值为9.26 g，生物量最大的品种是泰国尖叶空心菜，生物量最小的品种是青骨柳叶空心菜，相差15.93 倍。泰国尖叶空心菜生物量与泰国竹叶空心菜、台湾白骨柳叶空心菜、江西大叶空心菜、999 青骨柳叶空心菜、青骨柳叶空心菜这5个品种生物量差异达显著水平（P<0.05）；台湾青梗竹叶空心菜生物量与999 青骨柳叶空心菜、青骨柳叶空心菜这2个品种生物量差异达显著水平（P<0.05）；其余品种生物量之间没有显著差异（P>0.05）。地下部生物量为0.63~4.12 g，最大与最小之间相差5.6 倍，均值1.79 g，19 种空心菜品种间地下部生物量差异达显著水平（P<0.05）。
由表 3可知，空心菜不同品种之间As 积累量呈显著性差异（P<0.05），19 个品种空心菜地上部As 含量范围为0.73~191.12 mg·kg-1，最高与最低之间相差261.81倍。对照GB 2762—2012 对蔬菜中As的限量标准（0.5 mg·kg-1）全部超标，说明在重污染土壤种植的空心菜均不适宜食用。此外，空心菜品种间As含量差异很大，其中：地上部As含量最高的是港种青绿梗叶空心菜，为191.12 mg·kg-1，As含量最低的是油青空心菜，为0.73 mg·kg-1；地下部As 含量最高的是台湾白骨柳叶空心菜，为229.76 mg·kg-1，含量最低品种为青骨柳叶空心菜，达78.57 mg·kg-1。19个空心菜品种的转运系数差异明显，最低的台湾白骨柳叶空心菜为0.004，最高的港种青绿梗叶空心菜为2.19，其中台湾大叶白骨空心菜、菜农D-95空心菜、港种青绿梗叶空心菜、泰国竹叶空心菜4个品种的转运系数大于1。
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通过聚类分析（图 1）得知，泰国白梗柳叶空心菜、油青空心菜、台湾白骨柳叶空心菜、台湾青梗竹叶空心菜、泰国空心菜、河北大叶空心菜、玉帅竹叶青空心菜、999 青骨柳叶空心菜、白梗柳叶空心菜9 个品种相对于其他品种累积As含量较少，其中台湾白骨柳叶空心菜、泰国白梗柳叶空心菜、油青空心菜地上部累积As 含量均低于1 mg·kg-1；台湾大叶白骨空心菜、菜农D-95 空心菜、港种青绿梗叶空心菜、泰国竹叶空心菜4 个品种相对于其他品种积累As 含量较高，含量范围是141.18~191.12 mg·kg-1。
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| 图 1 19 个品种空心菜地上部As含量聚类树形图 Figure 1 Clustering tree of above-ground portion of As concentration in 19 Ipomoea aquatica cultivars |
本试验中积累As 含量较高的4 个品种（台湾大叶白骨空心菜、菜农D-95 空心菜、港种青绿梗叶空心菜、泰国竹叶空心菜）转运系数均大于1，即地上部As含量高于地下部，其中只有泰国竹叶空心菜转运系数为1.08，地上部As含量略高于地下部，且台湾大叶白骨空心菜、菜农D-95 空心菜、港种青绿梗叶空心菜地上部生物量较高，均大于10 g。因此，综合来看，相对高累积As的空心菜品种是台湾大叶白骨空心菜、菜农D-95空心菜、港种青绿梗叶空心菜。在As含量较低的9个品种中，除河北大叶空心菜以外其余品种的转运系数均在0.01 以下，且泰国空心菜、白梗柳叶空心菜、台湾青梗竹叶空心菜、玉帅竹叶青空心菜、油青空心菜的生物量较大，综合来看，泰国空心菜、白梗柳叶空心菜、台湾青梗竹叶空心菜、玉帅竹叶青空心菜、油青空心菜为相对低累积As的品种。
2.3 不同品种空心菜As的亚细胞分布由表 4 可知，19 个品种空心菜地上部亚细胞中固持As 含量呈现胞质>细胞器>细胞壁，其中地上部胞质中固持As 含量占亚细胞As 总量的49.06%~77.44%，细胞器中固持As 含量占亚细胞As 总量的19.90%~46.82%，而细胞壁中固持As 含量最少，仅占总量的2.22%~16.73%。19个品种中地下部胞质中固持As含量占亚细胞As总量的47.61%~84.95%，细胞器为2.18%~39.32%，细胞壁为1.04%~29.49%。此外，油青空心菜地下部的胞质、细胞器与细胞壁中固持As含量为19 个空心菜品种中最高，分别达到20.39、9.99、10.47 mg·kg-1。进一步分析表 4发现，19 个空心菜品种地上部及地下部间各亚细胞固持As 含量差异不显著（P>0.05），但同一品种间细胞壁、细胞器与胞质中固持As 含量差异达显著水平（P<0.05）。此外，19 个空心菜品种地下部各亚细胞固持的As 含量均高于地上部。
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对不同品种空心菜亚细胞各部分所固持的As 含量与生物量及As 含量进行相关性分析，结果（表 5）显示，地上部细胞壁中固持的As含量与生物量之间有显著的正相关（P<0.05），但与地上部的As 含量之间没有显著相关性；地上部胞质中固持的As含量与地上部生物量之间呈极显著的正相关（P<0.01），其与地上部的As含量之间无显著相关性。细胞器中固持的As 含量与地上部生物量及地上部As 含量之间均无显著相关性。地下部亚细胞各部分所固持的As含量与地下部生物量及地下部As含量均无显著相关性（P>0.05）。
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有研究表明，土壤中低浓度的As可以刺激植物的生长，但当土壤中的As 含量达到一定程度时则会危害植物的生长[17]，过量的As 可降低植物蒸腾作用、呼吸作用，抑制根系活性，进一步影响植物对养分和水分的吸收，最终通过植株的受害症状、生长状况和产量变化表现出来[18-19]。本研究分析了19种空心菜在66.40 mg·kg-1的土壤As 浓度胁迫下地上部、地下部生物量的变化，结果表明不同品种空心菜对As 的耐性表现出一定的差异，且地上部与地下部的生物量之间呈显著正相关。999 青骨柳叶空心菜、青骨柳叶空心菜这两个品种生物量较低，对As的耐受性较差，不适于在重度As 污染的土壤上种植。
3.2 不同品种空心菜累积As的差异分析空心菜对As 的吸收富集因品种的不同而有所差异。在50 mg·kg-1 As 胁迫下，19 个品种空心菜地上部As 含量为0.73~191.12 mg·kg-1，均超过国家食品卫生标准限值（0.5 mg·kg-1），为国家标准的1.46~382.24 倍。这说明在As 66.40 mg·kg-1 的土壤中，空心菜易受到As 污染。肖细元等[7]研究表明空心菜属于抗As 污染能力较弱的物种；Mathieu 等[10]在研究中发现在1 mg·L-1 As 的条件下空心菜As 含量就已经远远超过国家食品卫生标准限值。因此，本试验中在外源添加As 50 mg·kg-1的土壤条件下，空心菜超标率为100%，与前人的研究相符。
前人研究表明叶菜类蔬菜植株累积重金属的规律是地上部<地下部[20]，但也有研究表明其规律是地上部>地下部[21-22]，可见叶菜类蔬菜地上部、地下部积累重金属量不仅与蔬菜种类有关，也与蔬菜品种有关，同一种类蔬菜的不同品种之间也有差异。本试验中有4 个品种空心菜的地上部As 含量大于地下部，即转运系数大于1，综合生物量考虑，台湾大叶白骨空心菜、菜农D-95 空心菜、港种青绿梗叶空心菜被确定为高累积As的品种。
由于不同植物对As的耐性存在差异，目前的研究多集中于两个方向：一个方向是筛选超积累植物，通过植物的富集作用提取土壤中过量的As，而后收获植物而达到减少土壤As污染的目的；另一个研究方向是筛选As 抗型作物，使其在轻度As 污染土壤中生长发育不受影响[22-25]。因此，由本试验所筛选出的高积累品种台湾大叶白骨空心菜、菜农D-95 空心菜、港种青绿梗叶空心菜，可在中、高度As 污染土壤中种植，然后通过反复收获来减少土壤As污染，将受污染的收获物直接作垃圾填埋处理或作为能源植物等工业原料；而筛选出的台湾白骨柳叶空心菜、泰国白梗柳叶空心菜、油青空心菜等5 个低累积品种则可以在轻度As污染土壤中种植，以期获得可以安全食用的空心菜。
3.3 不同品种空心菜亚细胞累积As的差异分析研究表明，重金属积累通常会破坏植物的亚细胞结构[26-28]。本试验研究分析了在50.00 mg·kg-1 As胁迫下，As 在19 个品种空心菜地上部、地下部亚细胞中的分布，结果表明亚细胞中固持As 含量规律为胞质>细胞器>细胞壁。空心菜所吸收的As主要储存在胞质中，地上部胞质中的As 含量占亚细胞总As 含量的49.06%，地下部胞质中的As 含量占亚细胞总As含量的47.61%。对不同品种空心菜亚细胞各部分所固持的As 含量与生物量及植株As 含量进行相关性分析可以发现，地上部细胞壁中固持的As含量与生物量之间呈显著的正相关（P<0.05），地上部胞质中固持的As 含量与地上部生物量之间呈极显著的正相关（P<0.01）。这反映了细胞壁与胞质固持As 的能力与解毒作用有关，细胞壁和胞质固持As 的能力越强，As 对空心菜的毒害作用越弱，植株生长就越好。同时还发现了白梗柳叶空心菜地下部细胞器中固持的As含量最高，为11.93 mg·kg-1，而其地下部的生物量是最低的，仅为0.63 g，可见若是细胞器中固持太多的As，会影响细胞正常的代谢活动，危害植株生长。
植物的胞质组分由细胞质和液泡组成，细胞液是细胞新陈代谢的主要场所[29]；液泡的主要功能是参与细胞的水分代谢，同时也是植物细胞代谢副产品及废物囤积的场所[30]。有研究表明，某些超富集植物的解毒机理是通过液泡的区隔化来实现的[31-33]。在本试验中，细胞壁固持As的能力不强，仅占总量的2.22%~16.73%。这与陈璐等[12]对三七积累As 的研究结论相同，他们发现As 积累量为细胞液>细胞壁>细胞质，以细胞液组分中As的相对比例最高，大幅高于细胞质和细胞壁所占的分布比例。上述结果与Ernst 等[34]和陈同斌等[35]所认为的细胞壁具有重金属的束缚作用和解毒能力的结论不相符。陈同斌等[35]研究超富集植物蜈蚣草中As的亚细胞分布时发现，在低As浓度时，细胞壁会优先与As 结合，将As 固定来限制其向内部转运，但蜈蚣草细胞壁对As的贮存能力有限，因此当体内As浓度过高时，绝大部分As都会向上转移至羽叶中，然后通过区隔化作用来减轻As 对其的伤害。本试验表明空心菜对As的解毒机理主要是通过液泡的区隔化来实现的。
4 结论在As 的重污染土壤小区种植的南方常见19 种空心菜均可生长，但不同品种空心菜生物量及As 累积量存在显著差异（P<0.05），且As均超出GB 2762—2012 的安全限量标准（0.5 mg·kg-1）。泰国空心菜、白梗柳叶空心菜、台湾青梗竹叶空心菜、玉帅竹叶青空心菜、油青空心菜为相对低累积As的品种，适合在轻度As污染土壤上进行农业生产；而相对高积累As品种为台湾大叶白骨空心菜、菜农D-95 空心菜、港种青绿梗叶空心菜，可考虑通过收获生长较快的地上部逐步修复污染土壤中的As。空心菜累积As主要在胞质中，其解毒机制与液泡的区隔化有关，而空心菜的细胞壁对As的累积能力有限。
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