水稻（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物，如何培育出优质、高产的水稻品种对世界粮食生产具有重要意义^[1]。20世纪80年代，转基因技术被应用于水稻优化育种研究^[2]，迄今已有大量的相关研究报道^[3-5]。我国在世界转基因水稻研究方面具有重要地位，已成功获得一大批具有重要应用价值和自主知识产权的基因，并培育出抗虫、抗除草剂、抗病、营养高效、耐盐和高产等一系列转基因水稻品系/组合，其中转基因抗虫水稻研究处于世界领先水平^[6]。由于水稻在我国食物结构中的重要性和水稻起源的特殊地位，在研发转基因水稻的同时，其安全性问题亦成为被关注的焦点^[7]。

目前，转基因水稻的环境风险研究，主要集中在转基因水稻外源基因漂移及影响^[8-9]、转基因水稻对生物多样性的影响等。其中，对生物多样性的影响研究分为地上与地下两部分，地上部多以物种群落结构参数为评价指标^[10-11]，地下部多以土壤动物群落、微生物群落结构参数为评价指标^[12-13]。祝向钰等^[14]研究了转Bt水稻土壤跳虫群落组成及其数量变化，研究结果表明，转Bt水稻种植会导致土壤跳虫个别稀有类群的消失，并显著影响半土生和真土生类群以及土壤跳虫总量，但对群落多样性、均匀度和种类丰富度等无显著影响。由于田间调查数据的评价方法很容易受环境因子等影响，实验周期较长、重复性较差，近年来采用室内生测方法，利用常见环境生物的指示作用，成为研究转基因植物生态安全性的重要补充手段^[15]。Zwahlen等^[16]分别用转基因玉米叶片和非转基因玉米叶片喂饲蚯蚓，结果表明，用转基因玉米叶片喂饲的蚯蚓体重增加4.4%，而用非转基因玉米叶片喂饲的蚯蚓体重下降18.3%。

土壤动物在土壤生态系统中起着重要作用，特别是土壤中广泛存在的跳虫和蚯蚓。跳虫属于弹尾纲、弹尾目，其种类和个体数量在土壤中十分丰富，是土壤中的重要分解者^[17]，在土壤生态系统中能够参与物质循环、提高土壤肥力等活动，在土壤质量评价、污染监测、污染土壤的生物修复以及控制植物真菌病害等方面都具有重要作用^[18]。白符跳（Folsomia candida）作为对化学物质最为敏感的跳虫之一，具有抗旱、抗冻、抗缺氧、孤雌生殖、对毒物敏感等特性，是国内外土壤生态安全评价中普遍使用的模式物种^[19]。蚯蚓约占土壤生物总量的60%~80%，其生存活动可促进有机质的分解、促进土壤养分的循环与释放、改善土壤结构和理化性状^[20]，在维持土壤生态系统功能中起着不可替代的作用^[21]。赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）对毒物敏感、体型较大，且具有标准的急毒性和亚毒性测定方法^[22]，常被作为生态毒理试验的标准物种。

本研究选择转Cry1c基因抗虫水稻1c-5及其非转基因对照吉粳88的叶片，以常用的环境指示生物白符跳和赤子爱胜蚓作为评价物种，在室内可控条件下，采用直接喂饲法，研究了转基因水稻叶片残体对白符跳存活率和体长的影响，以及对赤子爱胜蚓存活率、繁殖率和体重变化率的影响，旨在为评估转Cry1c基因抗虫水稻1c-5对土壤生态系统的影响提供参考，为转Cry1c基因抗虫水稻1c-5的安全性评价提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

本试验所用转基因水稻为我国自主研制的转Cry1c基因抗虫水稻1c-5及其非转基因亲本对照吉粳88，均由转基因水稻研发单位吉林省农业科学院提供。

本试验所用跳虫为白符跳，蚯蚓为赤子爱胜蚓大平2号，二者均取自国家转基因玉米、大豆中试与产业化基地（吉林省公主岭）、吉林省农业科学院转基因植物环境安全研究课题组培养的试验种群，试验时该种群已在实验室内稳定培养3年。

本试验所用土壤为东北黑土，取自吉林省农业科学院公主岭院区，质地为壤土，采土区土地未种植过任何转基因作物。

1.2 试验方法 1.2.1 白符跳室内生测

取水稻成熟期叶片，60 ℃烘干12 h，用植物组织粉碎机破碎后，置于-20 ℃冰箱备用^[23]。按石膏:活性炭=9:1（体积）的比例配制培养基并置于培养皿中，收集3 d内白符跳所产卵块放入其中，将培养盒放置到人工气候箱内进行白符跳的卵化及“同步化”培养。气候箱内温度为20±1 ℃，光周期为全黑夜，每周用去离子水调节1次空气相对湿度，使其接近100%。“同步化”培养时，在培养皿中添加啤酒酵母作为食物^[24]。从“同步化”培养的培养皿中选取虫龄为10~12 d的白符跳进行喂饲试验，喂饲试验环境与“同步化”培养的试验环境相同。喂饲试验中，以上述粉碎后的转基因水稻叶片作为食物，每2 d检查1次并更换食物。以喂饲转基因水稻叶片的白符跳作为试验组，以喂饲非转基因水稻叶片的白符跳作为对照组，分别设置5个重复，每个重复内放入10头长势基本一致的白符跳。分别在接虫后第10、20、30 d对白符跳存活率进行调查，然后将培养皿放回恒温气候箱内继续培养，试验结束时从中随机选取3头白符跳，测量其体长并计算平均值。

1.2.2 赤子爱胜蚓室内生测

分别取转Cry1c基因抗虫水稻1c-5及其非转基因对照吉粳88的成熟期叶片，用蒸馏水洗净后自然风干，人工粉碎，过孔径为2.0 mm的筛。采集土层深度为5~25 cm未种植过转基因作物的土壤，自然条件下风干后，用孔径为15.0 mm的筛去除植物残渣、沙石等，再过孔径为2.0 mm筛^[25]。将牛粪自然风干后打碎，过孔径为2.0 mm筛。按照土壤:牛粪:叶片的质量比为50:5:2的比例，将三者充分混合后，置于培养盒中^[25-27]。挑选出生2个月、具有生殖环、长势一致、体重180~220 mg的赤子爱胜蚓放入培养盒中。以用转基因水稻叶片培养的赤子爱胜蚓为试验组，用非转基因水稻叶片培养的为对照组，各设置5组，每组中含赤子爱胜蚓10条。在24±1 ℃、空气相对湿度65%、无光条件下培养。在培养盒顶端覆盖纱布，并用软胶套或细绳固定，以防蚯蚓逃脱并保证其呼吸通畅。分别在接虫后第7、14、21、28、35、42 d调查存活成蚓数量。将各培养盒中存活的的赤子爱胜蚓全部取出，于室温下用无菌水洗涤，滤纸干燥，称重，记录各培养盒中幼蚓及蚓茧的数量。按下式计算体重变化率：体重变化率=（成蚓检查当天质量-成蚓初始质量）/成蚓初始质量×100%。按下式计算繁殖率：繁殖率=检查当天幼蚓数/初始幼蚓数×100%。

1.3 数据处理

采用软件SPSS 18.0进行统计分析，用一般线性模型（General linear model）中的重复测量（Repeated measures）对测量数据进行方差分析，通过球形检验（Mauchly′s test of sphericity）判断数据之间是否存在相关性。如果P>0.05，说明数据之间不存在相关性，用单因素方差分析；如果P < 0.05，说明数据之间存在相关性，用多元方差分析。

2 结果与分析 2.1 对白符跳存活率与体长的影响 2.1.1 存活率

用转基因水稻1c-5的叶片喂饲白符跳10、20、30 d后，其存活率分别为98%、96%和94%，均高于非转基因对照吉粳88喂饲的白符跳存活率。方差分析结果表明，转基因水稻1c-5与非转基因对照吉粳88相比，对白符跳的存活率无显著影响（图 1）。

2.1.2 体长

试验条件下喂饲白符跳30 d后，每个重复中随机选取3头白符跳测量其体长，取平均数并进行单因素方差分析。结果表明，转基因水稻1c-5和非转基因对照吉粳88喂饲的白符跳体长均值均为1.17±0.01 mm（平均值±标准误）。方差分析结果表明，与非转基因对照吉粳88相比，转基因水稻1c-5对白符跳的体长无显著影响（图 2）。

2.2 对赤子爱胜蚓存活率、繁殖率及体重变化率的影响 2.2.1 存活率

试验表明，无论是用转基因水稻1c-5的叶片喂饲，还是用非转基因对照吉粳88的叶片喂饲，赤子爱胜蚓的存活率均随着处理时间延长而不断降低。在第7、14 d时，喂饲转基因水稻1c-5蚯蚓的存活率，与喂饲非转基因对照吉粳88的基本一致；在第21、28、35、42 d时，与后者相比，前者的下降较慢。方差分析结果表明，与非转基因对照吉粳88相比，转基因水稻1c-5对赤子爱胜蚓的存活率无显著影响（图 3）。

2.2.2 繁殖率

用转基因水稻1c-5和非转基因对照吉粳88喂饲的赤子爱胜蚓，第7 d时均未繁殖，第14 d时均开始繁殖，繁殖高峰期均出现在第28 d。虽然转基因水稻1c-5和非转基因对照吉粳88的各组间增长数量不同，但方差分析结果表明，与非转基因对照吉粳88相比，转基因水稻1c-5对赤子爱胜蚓的繁殖率无显著影响（图 4）。

2.2.3 体重变化率

从表 1可看出，用转基因水稻1c-5与非转基因对照吉粳88喂饲的赤子爱胜蚓，每7 d的体重变化率无显著差异（P>0.05）；从第28 d开始，各处理组中赤子爱胜蚓的体重开始下降，体重变化率为负值。方差分析结果表明，与非转基因对照吉粳88相比，转基因水稻1c-5对赤子爱胜蚓的体重变化率无显著影响。

3 讨论

1999年，关于转基因玉米花粉对帝王蝶的影响被报道后^[28]，转基因作物对非靶标生物的影响引起了研究人员的广泛关注。此外，研究人员还对如何选取具有代表性的种群作为非靶标效应的评价种群进行了激烈的讨论。白符跳与赤子爱胜蚓均处于食物链底端，分布较广，主要取食土壤内的植物残体，常被研究人员选作测试各种土壤污染物毒理性的模式生物。Yang等^[29]分别按300 μg·g^-1 Cry1C蛋白、600 μg ·g^-1 Cry2A蛋白的比例，将上述两种蛋白与啤酒酵母混合并喂饲白符跳，结果表明对白符跳的存活率无显著影响。本研究结果与上述研究的结果是一致的。除此之外，也有研究表明，转Bt作物不会对跳虫产生影响。Bitzer等^[30]在4个地区研究了转Bt玉米与杀虫剂对土壤表面跳虫和地下跳虫的影响，结果显示转Bt玉米对跳虫的丰度无影响，对跳虫物种多样性指数的影响也较小。肖能文等^[31]通过将不同浓度的Cry1Ac杀虫蛋白加入试验土壤处理赤子爱胜蚓，研究表明CrylAc杀虫蛋白对蚯蚓存活率、体重变化及体内总蛋白酶、过氧化氢酶、乙酰胆酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、纤维素酶活性均没有不利影响。丁帅等^[32]和冷春龙等^[33]研究了转基因棉花对赤子爱胜蚓的影响，结果表明，转基因棉花与非转基因棉花对赤子爱胜蚓体重变化的影响趋势基本一致，蚓茧数、新产生的幼蚓数及体内SOD活性均无显著差异。Ahmad等^[34]在土壤中添加转Cry3Bb1基因玉米植株残体，发现其对普通蚯蚓的生存和体重没有显著影响。Vercesi等^[35]选用欧洲地区大面积种植的表达Cry1Ab蛋白的转基因玉米叶，将其研成细粉，按不同剂量与土壤混合，没有发现转Bt基因玉米组织在降解过程中对蚯蚓的存活、生长和繁殖产生影响。进一步的研究表明陆生蚯蚓（Lumbricus terrestris）和内栖蚯蚓（Aporrectodea caliginosa）2种蚯蚓可加快土壤中转Cry1Ab基因玉米残体的降解^[36]。为了在田间较大面积中研究多年连续种植转Bt基因玉米对蚯蚓的影响，Zeilinger等^[37]在0.16 hm²土地上连续4年种植2种转Bt基因玉米（Cry1Ab和Cry3Bb1），同时设置非转基因玉米对照区，所有玉米收获后均秸秆还田。在试验区域的土壤中有4种蚯蚓生存，分别按不同种类对蚯蚓的生物量进行测试。调查数据显示，无论是幼年还是成年蚯蚓，在转基因和非转基因玉米种植区的生物量均无显著性差异，因此认为转Bt基因玉米对蚯蚓的影响很小。Merwe等^[38]进行的一项为期28 d的试验表明，Cry1Ab蛋白对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）的蚓茧量和茧孵化量没有显著影响。本研究结果与上述研究的结果是一致的。除此之外，肖能文等^[31]、冷春龙等^[33]、舒迎花等^[39]还研究了Bt毒蛋白对赤子爱胜蚓酶活性的影响，结果表明，转Bt基因玉米秸秆处理对赤子爱胜蚓总蛋白没有抑制作用，对过氧化氢酶没有诱导作用，但在短时间内能诱导超氧化物歧化酶（SOD）活性。

4 结论

（1）短期内转Cry1c基因抗虫水稻1c-5对土壤中非靶标生物的安全性无显著影响。

（2）为考察长期种植转Cry1c基因抗虫水稻1c-5对土壤中非靶标生物的安全性，在将来的研究中，应延长喂饲试验周期，测定Cry1c蛋白在试验动物体内的残留量，对代表性的分子毒理学指标进行评价分析。