文章信息
- 丁婷婷, 张瑾, 董欣琪, 洪桂云, 鲍立宁
- DING Ting-ting, ZHANG Jin, DONG Xin-qi, HONG Gui-yun, BAO Li-ning
- 磺胺类抗生素对青海弧菌Q67的浓度比依赖性拮抗作用
- Concentration-ratio-dependent antagonism of sulfonamide antibiotics towards Vibrio qinghaiensis sp.-Q67
- 农业环境科学学报, 2017, 36(11): 2199-2206
- Journal of Agro-Environment Science, 2017, 36(11): 2199-2206
- http://dx.doi.org/10.11654/jaes.2017-0722
文章历史
- 收稿日期: 2017-05-17
- 接受日期: 2017-07-05
2. 清华大学新兴有机污染物控制北京市重点实验室, 北京 100084
2. Beijing Key Laboratory for Emerging Organic Contaminants Control, Tsinghua University, Beijing 100084, China
磺胺类抗生素药物(SAs)是应用最早的一类人工合成抗菌药,主要作为饲料添加剂或治疗动物疾病广泛应用于畜牧和水产养殖业中[1]。SAs药物的大量生产和应用已导致该药物进入大气、水体以及土壤等环境中[2]。据报道,在我国畜禽养殖场粪便中普遍存在磺胺类抗生素的残留,残留的抗生素随动物粪便施肥进入土壤后,有的被植物吸收积累,有的对土壤中的生物产生毒害效应,甚至破坏植物根际周围的微生态平衡[3-4]。在我国河流及湖泊等天然水环境中,约158种药物和个人护理产品(Pharmaceuticals and personal care products,PPCPs)被调查出来,其中报道次数较多的20种PPCPs中,磺胺类抗生素被报道次数最多[5]。薛保铭等[6]发现4种磺胺类抗生素和甲氧苄氨嘧啶(TMP)在钦州湾近海及汇海河流均有不同程度存在,其中磺胺类抗生素在钦州湾的海水养殖区均呈现出较高的浓度水平。Li等[7]研究发现白洋淀湖泊中普遍存在喹诺酮类、大环内脂类和磺胺类抗生素,其中磺胺类物质浓度最高(0.9~1563 ng·L-1),同时也发现残留的抗生素对微生物和水生生物均产生了很强的生态毒性。此外,太湖、武汉城市湖泊等不同湖泊水体中都检出磺胺类抗生素[8-9]。
然而,进入环境中的抗生素又以各种形式和浓度共存于环境中,形成复杂的各种混合污染物,进而对环境生物产生联合毒性效应[10-11]。混合污染物所产生的累积毒性与相互作用(协同与拮抗作用)具有更大的潜在风险。因此,系统考察磺胺类抗生素及其混合污染物对暴露生物的毒性具有更重要的现实环境意义。越来越多的研究表明,污染物的毒性是随暴露时间的延长而逐渐发生发展的[12]。然而,目前大多数的研究只考虑用短时间暴露的急性毒性来评价污染物的毒性效应,很少考虑到长时间暴露条件下,污染物对生物体的干扰,因而不能准确地评定化合物毒性的真实情况。要想深入了解SAs污染物的毒性作用机制,正确评价其生态风险,长期暴露也是一个重要的考虑因素。
在绝大多数的水生生态系统中,细菌尤其是弧菌类是食物链中最重要的一个环节,在生态系统的物质循环和能量流动中发挥着重要的作用[13]。对生态系统中细菌的任何外源性干扰都可能对生态系统产生有益或有害的影响。因此,在生态毒理学的研究中,细菌如发光菌费氏弧菌(Vibrio fisher,V. fisheri)和青海弧菌(Vibrio qinghaiensis sp.-Q67,Q67)常作为化学污染物水体毒性的一个重要指示生物[14]。发光菌毒性测试中应用最广泛的是V. fisheri,但在进行环境样品生物毒性测试时需要人为加入一定量的NaCl(2%~3%),在淡水体系样品的检测中存在一定的局限性[15]。青海弧菌Q67是一种淡水发光菌,克服了V. fisheri的这一缺点,且能够在很宽的pH值范围内(6.5~11)生长良好,对毒物的反应敏感。
本文以5种磺胺类抗生素磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺吡啶(SPY)、磺胺甲恶唑(SMX)和磺胺二甲嘧啶(SM2)为研究目标,以青海弧菌Q67为指示生物。采用直接均分射线法(Equ-Ray)设计二元混合物,采用长期微板毒性分析法(L-MTA)系统测定磺胺类抗生素及其混合物在长期暴露条件下对Q67的毒性效应,并应用经典加和参考模型分析混合物的毒性相互作用,研究结果将为科学、客观地评价磺胺类抗生素的环境风险提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器试剂:5种磺胺类抗生素:磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺吡啶(SPY)、磺胺甲恶唑(SMX)和磺胺二甲嘧啶(SM2)均购自上海原叶生物科技有限公司,其基本理化性质见表 1。采用milli-Q水配制抗生素储备液,保存在棕色瓶中,并置于4 ℃冰箱中保存,备用。
主要实验仪器:Synergy 2 Multi-Mode微板光度计(美国BioTek伯腾仪器有限公司)、超净工作台(三发仪器有限公司)、FA1004型五位电子天平(天津天马衡基仪器有限公司)、YX280A手提式压力蒸汽灭菌器(上海三申医疗器械有限公司)、SC-242型透明门立式冷藏柜(青岛海尔电冰柜有限公司)、BS-2E数显振荡培养箱(上海梅香仪器有限公司)、DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)和Dragon-lab单道可调移液器(10~100 μL,大龙兴创实验仪器有限公司)。
1.2 混合物实验设计采用直接均分射线法(Equ-Ray)[16]设计磺胺类抗生素的二元混合物体系,共10组。每组抗生素混合物体系均安排5条具有不同组分浓度配比的射线,共50条混合物射线,其组分构成以及浓度配比见表 2。
1.3 菌种的培养、长期微板毒性分析法青海弧菌Q67(Vibrio qinghaisense sp. -Q67,Q67)购自北京滨松科技公司,其培养配制参照文献[12, 17]。
预实验表明,磺胺类抗生素对Q67在12 h内几乎没有毒性,只有在12 h后才逐渐出现毒性,在16 h出现明显的毒性效应,16 h后毒性开始减弱。因此,本研究只需测定5种抗生素对发光菌在暴露时间为16 h的浓度-效应数据,分析方法采用长期微板毒性分析方法(L-MTA)[18],但在参考文献的基础上有所改进,即调整了菌种的初始培养时间:将事先已培养至对数生长期(即相对发光单位值RLU≥9×106)的Q67,转入等体积的浓缩培养基,并置于22 ℃培养箱,培养时间缩短为0.5 h(以使其在微孔板中在培养16 h后仍处于对数生长期),加入事先已加入毒物的96孔微板中,在暴露16 h时取出测定微孔板中各孔的发光强度,余下过程同参考文献[18]。毒物对Q67在不同暴露时间的发光抑制毒性表达为发光抑制率(E)[19],计算公式如下:
式中:I0为24个空白对照孔的RLU的平均值;I为不同浓度处理组3个平行浓度孔的RLU的平均值。
1.4 浓度-效应数据拟合对于浓度-效应曲线(CRC)为S型的污染物,其在不同暴露时间下的所有浓度-响应数据都需要在APTox软件程序[20]上进行非线性拟合,同时计算出与CRC模型相对应95%可信度的观测效应置信区间。化学计量学默认的优化原则是1个优化模型使用的样本数至少应是该模型参数的5倍,考虑到L-MTA法测定12个数据点的事实,所获得的浓度-毒性效应数据,主要选择2个参数的CRC模型,例如Logit(2)和Weibull(3)两参数函数进行非线性模拟,其中E表示效应(0≤E≤1),c表示单个化合物或者混合物浓度,α和β都是参数。
由于毒性实验的固有误差,评估化合物或混合物毒性时必须考察置信区间的范围,特别是观测值的置信区间(OCI)。本论文中,OCI是基于实测毒性效应,在显著性水平为0.05情况下,化合物实验浓度的可信范围,即化合物产生某一效应x%时的95% OCI,并且本文是在整个浓度-效应区域内建立整条观测CRC的OCI曲线[21]。
1.5 混合物毒性相互作用分析通常,混合物毒性相互作用的分析基于某一个标准加和参考模型如浓度加和(CA)基础上进行的[22],其计算公式如下:
式中:ci表示混合物产生总效应为x%时第i种组分的浓度;ECx, i为i组分单独存在时产生等效应x%时的效应浓度。
如果由CA模型预测的混合物浓度-效应曲线(CRC)位于混合物实际观测毒性的95% OCI内、95% OCI上限的上方或95%OCI下限的下方,则称该混合物组分间分别是加和作用即没有毒性相互作用、拮抗作用或协同作用[23-24]。
2 结果与讨论 2.1 5种磺胺类抗生素对Q67的单一毒性Logit函数能较好地拟合抗生素污染物的浓度-效应数据[25],故本文采用Logit函数对数据进行拟合。将通过MTA法采集的5种抗生素对Q67的浓度-效应数据拟合到非线性函数Logit,其拟合结果及相关统计量见表 3,其浓度-效应数据及拟合CRC绘于图 1。从表 3可以看出,Logit函数可以很好地拟合5种抗生素的浓度-效应实验数据(R>0.95,RMSE<0.024)。以半数效应浓度(EC50)的负对数pEC50为毒性大小指标[26-27],5种抗生素对Q67的毒性差异不大,pEC50值在3.21~3.95之间,毒性最大的是SMX,最小的是SM2。5种抗生素的毒性顺序为:SMX(pEC50=3.95)>SCP(pEC50=3.65)>SPY(pEC50=3.41)>SD(pEC50=3.36)>SM2(pEC50=3.21)。图 1是5种抗生素对发光菌的浓度-效应曲线(CRCs),从图中可看出其对Q67的CRCs在实验观测的浓度范围内呈现S型,但不平行,说明这5种抗生素对发光菌的毒性大小不同或参数β的大小不同(表 3)。
2.2 磺胺类抗生素二元混合物对Q67的毒性将10组抗生素的二元混合物体系对Q67的浓度-效应数据及拟合CRCs绘于图 2。可以看出,除了SD-SM2和SD-SMX两个混合物体系的5条射线随着浓度比有明显的变化外,其余混合物体系的射线没有完全分开甚至是重叠的,表明磺胺类抗生素的二元混合物体系的毒性没有明显差异,可能是由于这5种抗生素对Q67的毒性在3.21~3.95范围内,差异不是非常明显。由于其混合物毒性的复杂性,具体的原因尚需要进一步研究。
2.3 磺胺类抗生素二元混合物毒性作用基于加和参考模型CA对磺胺类抗生素10组二元混合物体系的评估,结果显示:10组混合物体系中有7条混合物射线呈现经典的加和作用,即CA线全部位于95% OCI的置信区间内,而3组混合物体系(SCP-SPY、SCP-SM2和SCP-SMX)呈现明显的拮抗作用(图 3),即CA预测线位于95%OCI上限的上方。这可能是由于混合物中各组分的毒性比较接近,或作用于同一个作用位点,导致了相互之间竞争作用位点造成的[28-29]。
混合物毒性相互作用可能具有组分浓度比依赖性[29-30]。本研究中发现,具有拮抗作用的3组混合物体系的拮抗作用从R1到R2呈逐渐减弱或逐渐增强的趋势。不同的混合物体系,拮抗作用随组分浓度比(表 2)的变化规律不同:混合体系SCP-SPY和SCP-SMX中的每条射线的拮抗作用从R1到R2逐渐明显,R3、R4和R5拮抗作用程度接近,而SCP-SM2混合物体系中5条射线的拮抗作用从R1到R2增强,而后从R2至R5逐渐减弱,R5在较高浓度区甚至出现了协同作用。通过进一步分析发现,具有拮抗作用的3组混合物体系虽然具有共同的组分SCP,且其浓度比均从R1至R5逐渐减小,但3组混合物体系却呈现拮抗作用随组分浓度比(表 2)的不同变化规律也不同。这可能是由于3组混合物体系中另一个组分造成的。在这3组混合物体系中,5条射线(R1至R5)的组分SPY、SM2和SMX的浓度比均是逐渐增大的,说明混和物的组分构成及其浓度配比可能是影响混合物体系的拮抗作用发生发展的重要因素,具体的原因尚需进一步研究。
3 结论(1)Logit函数能很好地拟合5种磺胺类抗生素及其混合物对Q67的浓度-效应数据,5种抗生素对Q67的毒性差异不大,其毒性顺序为:SMX(pEC50= 3.95)>SCP(pEC50=3.65)>SPY(pEC50=3.41)>SD(pEC50= 3.36)>SM2(pEC50=3.21)。
(2)依据加和参考模型CA,10组二元混合物体系中,7组混合物体系呈经典的加和作用,3组混合物体系SCP-SM2、SCP-SMX和SCP-SPY呈现出明显的拮抗作用。
(3)具有拮抗作用的3组混合物体系均含有共同的组分SCP,但拮抗作用随组分浓度配比变化而呈现出不同的变化规律:从R1至R5,3组混合体系中的SCP浓度比逐渐减小,SPY、SMX和SM2的浓度比逐渐增大,而SCP-SPY和SCP-SMX中的拮抗作用从R1到R2逐渐明显,从R2到R5几乎不变,而SCP-SM2混合物体系中5条射线的拮抗作用从R1到R2逐渐明显,从R2到R5,拮抗作用逐渐变得不明显,R5在较高浓度区甚至出现了协同作用。
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