目前，重金属污染是全球面临的重大环境污染问题之一^[1]。其中镉（Cd）作为一种重要的重金属材料，广泛应用于电镀、冶炼、采矿、颜料以及电池等工业领域^[2]。同时，Cd又属于剧毒重金属元素，在环境中活性强，易进入食物链，可在人体肝、肾及骨骼等组织中积累从而造成严重损伤^[3-4]。近年来随着Cd工业发展，Cd环境污染问题备受关注^[5-6]。2014年公布的全国土壤污染状况调查结果表明，我国土壤中Cd污染的点位超标率达7.0%，在无机污染物中最高^[7]。土壤重金属植物修复具有高效环保、投资较少、应用潜力大等特点，是目前不断发展研究的重金属修复方法之一^[8-9]。其中筛选出具有对重金属元素富集能力强的超积累植物是研究的热点^[10-12]。

三叶草（Trifolium repens）为多年生草本，豆科、车轴草属，具有抗寒耐热、固氮能力强、生长快、寿命长、酸碱性土壤上均适应性强等特点，是常见的堤岸斜坡防护及草坪装饰草种，具有保持水土的作用，也可以作为绿肥或优良牧草等^[13-16]。近年来研究表明，三叶草在大气污染监测以及重金属环境修复等方面是理想的种质资源^[17-18]。将三叶草用于土壤Cd污染修复，可以起到环境美化、水土保持和Cd污染修复等多重作用。已有研究表明，三叶草在水培条件下对Cd胁迫具有一定耐受性，并表现出富集植物的特性^[19]。三叶草与禾本科植物协同修复Cd的效果较好，以及AM菌对三叶草富集Cd具有明显影响^[20-21]，但将其单独用作土壤Cd的修复研究比较少。本文以三叶草为研究对象，进行温室盆栽实验，参考国家菜地土壤环境质量二级标准Cd≤0.4 mg·kg^-1（GB 15618—2008），人工模拟土壤Cd污染环境，研究三叶草对土壤Cd富集特征以及土壤Cd净化能力等，以期为土壤Cd生态修复的超积累植物筛选提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

三叶草：2015年10月采集于校园周边无污染绿地，选取生长旺盛且长势基本一致的三叶草植株。

盆栽土壤：2015年10月采集于贵阳市某有机蔬菜基地的沙壤土，将土壤晾干、筛除异物、磨碎、过2 mm筛。少量土壤用玛瑙研钵研磨，过200目筛，测定土壤部分理化参数：pH值为7.1，有机质为7.6%，速效氮为67.3 mg·kg^-1，速效磷为76.8 mg·kg^-1，速效钾为57.2 mg·kg^-1，总镉为0.017 mg·kg^-1。表明土壤肥力较好且无Cd污染。

1.2 试验方法

含Cd土壤配制及植物盆栽：2015年10月采用温室（22~26 ℃）盆栽土培法，将事先处理好的土壤放入15 cm×12 cm的塑料花盆中，每盆装土1.0 kg。采用CdCl₂·2.5H₂O（AR），准确计算和配制Cd²⁺溶液，并缓慢均匀注入盆栽土（避免Cd不均匀和溶液过剩漏出花盆），充分搅拌，使土壤Cd浓度分别为：0、3、5、7、10 mg·kg^-1 5个处理水平（分别记为T1、T2、T3、T4、T5），每个处理3次重复。模拟Cd污染土壤平衡2周后进行三叶草移栽，确保每盆三叶草长势、株数（5株）及鲜重（称量记录）一致，连续培养45 d。定期浇水，含水率保持在75%，严格防止从花盆底座流出造成Cd流失。45 d后整株收获，清洗、晾干、称鲜重，并用剪刀将其分割为根、茎、叶，并称鲜重，然后105 ℃杀青30 min，60 ℃烘干至恒重，称干重，于自封袋保存备用。同时，采集盆中根际土壤25 g，测定培养后土壤中Cd，即土壤Cd残留量，该土壤经风干、研磨、过200目筛后，一并于自封袋保存备用。

样品中Cd含量测定：采用电热板加热，HCl-HNO₃-HClO₄法消解植物和土壤样品^[22]，采用岛津AA-7000型石墨炉原子吸收仪进行测定。

1.3 数据处理

采用Excel 2007和SPSS 22.0统计软件进行数据处理，利用最小显著性差异检验（LSD法）进行差异显著性检验，采用Sigmaplot 10.0作图。

2 结果与分析 2.1 三叶草生物量变化及外观特征

经过45 d培养后，不同Cd处理水平下，三叶草生长均良好，未出现明显毒害现象，其生物量均有所增加（图 1A），且随着Cd浓度升高，整株生物量增加值分别达4.8、2.0、3.3、3.7 g和2.7 g（表 1），表明三叶草具有一定土壤Cd耐受性。如图 1所示，培养后不同Cd处理下三叶草根、茎、叶各部位鲜重、干重无明显变化，但三叶草整株总生物量增加值均显著低于T1组（P＜0.05），表明Cd对三叶草生长均有一定抑制作用。不同Cd处理下三叶草整株及根、茎、叶不同部位含水率分别介于77.4%~77.7%、63.3%~64.2%、76.9%~77.9%、82.4%~85.6%，均小于T1组，且总体上随着Cd浓度升高而含水率逐渐降低（表 1），表明Cd对三叶草内部水分有一定影响，进而很可能影响其生物量变化。

2.2 三叶草各部位对Cd富集特征

随着土壤中Cd浓度的升高，三叶草根、茎、叶（均以干重计算）中Cd含量均呈现明显递增趋势，不同Cd处理下根中Cd含量介于29.3~178.6 mg·kg^-1（P＜0.05）；茎中Cd含量为9.1~101.3 mg·kg^-1（P＜0.05）；叶中Cd含量为9.2~130.9 mg·kg^-1（P＜0.05）（图 2）。当土壤中Cd投加浓度为10 mg·kg^-1时，三叶草根、茎、叶中Cd含量均超过100 mg·kg^-1这一Cd超积累植物临界含量标准^[23-24]。相同Cd处理下，三叶草各部位Cd含量表现为根＞叶＞茎，表明三叶草根对Cd富集作用最强、叶次之，茎相对较弱。由表 2可知，三叶草根、茎、叶中Cd含量高低均与土壤Cd浓度具有极显著的正相关关系，相关系数R²分别为0.971、0.936、0.928，达到极显著水平（P＜0.01），表明三叶草具有富集更多土壤Cd的可能性。综合2.1、2.2数据，表明三叶草作为地被植物适宜在Cd污染土壤环境下生长，可用于污染区域美化改造和土壤Cd污染修复。

2.3 三叶草各部位对Cd吸收量及土壤Cd残留量、Cd净化率

重金属吸收量是用以评价植物修复重金属污染土壤潜力的重要指标之一（重金属吸收量=植物重金属含量×生物量）^[25-26]。由表 3可知，三叶草整株及不同部位对Cd的吸收量均随着Cd浓度升高总体呈递增趋势。相同Cd处理下，茎吸收量最大，根次之，叶最小（除T5处理水平下根＜叶），这主要与茎生物量值相对较高有关。随着Cd浓度升高，三叶草地上部位吸Cd（占三叶草总吸Cd量）百分率分别高达68.3%、71.8%、79.3%、87.2%，呈不断增加趋势。通过计算三叶草对Cd净化率和土壤Cd残留量表明，土壤总Cd残留量均有所减小，净化率随着土壤中Cd投加浓度的升高而提高，介于1.9%~6.2%（均值约4.2%），也进一步表明三叶草具有在更高的Cd浓度土壤下富集更多Cd的潜力。

2.4 富集系数（BF）与转运系数（TF）

富集系数和转运系数是衡量植物积累重金属能力大小的重要指标，分别表征植物各部位对重金属的富集能力和重金属由地下部分（根）向地上部分（茎、叶等）的迁移能力^[27]。由表 4可知，不同Cd处理水平，三叶草根对Cd的BF值分别高达9.8、13.0、16.8、17.9（P＜0.05），茎对Cd的BF值分别达3.0、5.9、8.9、10.1（P＜0.05），叶对Cd的BF值分别达3.1、7.4、12.4、13.1（P＜0.05），且Cd浓度越高，各部位对Cd的BF值递增越明显，BF值间均差异显著（除Cd浓度为7 mg·kg^-1和10 mg·kg^-1时，叶对Cd的BF值相近）。结合前人研究^[23-24]，植物地上部分对重金属的BF值大于1是重金属超积累植物区别于普通植物的一个重要特征，表明在土壤Cd污染下三叶草具有作为Cd超积累植物的潜力，且随着Cd浓度增加，其积累Cd能力更强。不同Cd浓度下三叶草对Cd的TF值分别为0.6、1.0、1.3、1.3，除T2处理之外，TF值均≥1，表明Cd污染土壤环境中，三叶草能将Cd从根较好地转运至地上部位，且转运能力随Cd浓度升高逐渐增强。

2.5 三叶草各部位对Cd富集的相关性

由表 5可知，相同Cd处理水平下，对三叶草根、茎、叶的Cd富集特征进行相关性分析表明，三叶草不同部位对Cd的富集特征具有极显著相关性（P＜0.01），相关系数达0.992~0.996，反映了其不同部位对Cd的富集特性存在内在关联性，即随着Cd浓度升高三叶草根、茎、叶中富集的Cd量均同时增加，土壤中Cd进入植物后由根至茎最后至叶等的迁移性较好。

3 讨论

目前，Cd超积累植物筛选是土壤Cd污染修复领域重要的基础内容之一。Cd超积累植物的筛选标准一般如下：（1）植物对Cd的富集临界含量达到100.0 mg·kg^-1；（2）植物对Cd富集系数BF值大于1；（3）植物对Cd转移系数TF值大于1。然而现实中同时具备上述标准的植物很少，这是Cd超积累植物发现较少的重要原因^[28-29]。三叶草生长繁衍快速、抗逆性比较强，且其水土保持和环境美化功能较为明显，而自然环境中重金属污染区往往重金属含量高、pH值较低且大多贫瘠荒凉。本研究表明三叶草在高达10 mg·kg^-1的重度Cd污染土壤环境下仍生长较好或受到Cd的抑制作用较小，体现出其较强的Cd污染环境抗逆性，并且该浓度下三叶草根、茎、叶中Cd含量均大于100 mg·kg^-1，BF值、TF值均远大于1，因此根据本研究结果，三叶草在土壤高浓度Cd污染下具备Cd超积累植物的筛选条件。

另外，研究表明植物对重金属的富集特征同时与植物种类、重金属元素价态、物质结构及其环境中类元素共存离子浓度以及溶解度等均有关^[29]。同时，Liu等^[30]、Tang等^[31]、任珺等^[32]研究表明环境中重金属浓度的高低是影响植物中重金属富集量的主要因素，即部分植物富集重金属量要达到临界值，其生长环境中重金属浓度需达到一定量。本研究中三叶草根、茎、叶中Cd含量与土壤Cd浓度呈现正相关性，表明其具有富集更多土壤中Cd的潜力，也反映了其生长环境介质内Cd浓度是影响三叶草中Cd富集量的重要因素。本研究中三叶草对Cd的BF值远高于同样Cd浓度下杨艳等^[33]对头花蓼、王友保等^[34]对吊兰、牛之欣等^[35]对紫花苜蓿等的相关研究，表明三叶草在富集土壤Cd中具有较大优势。三叶草虽整株生物量相对较小，使得其存在一定修复局限性，但其繁殖能力强且地上部分吸Cd量占总吸Cd量的68.3%~87.2%，高于杨艳等^[33]对蓼科植物头花蓼富集Cd的相关研究（59.3%~65.1%），略低于苏德纯等^[36]对Cd的超积累植物印度芥菜的相关研究（≥87.0%），表明三叶草在原位Cd修复的后续（如收割等）处理等过程也存在优势。三叶草的Cd净化率均值约为4.2%，甚至略高于印度芥菜、油菜溪口花籽对Cd的净化率值（分别为2.5%~3.3%、3.5%~3.9%），表明其在实践中具有一定应用潜力^[36]。

4 结论与展望 4.1 结论

（1）三叶草总生物量随着Cd浓度升高，其增加量介于2.0~3.7 g（略低于对照组），表明三叶草具有Cd耐受性，但同时Cd对其生长有轻微抑制作用。不同部位含水率均随着Cd浓度升高而逐渐降低，表明Cd对三叶草内部水分产生影响，进而很可能影响其生物量变化。

（2）三叶草根、茎、叶均对Cd有较好富集性，均随着Cd浓度升高而富集作用更强，分别高达178.6、101.3、130.9 mg·kg^-1，其BF值分别介于9.7~17.9、3.0~10.1、3.1~13.1，富集能力大小表现为根>叶>茎。三叶草对Cd的TF值均≥1（除T2处理），表明三叶草能较好地将Cd转移至地上部位，且转移能力随Cd浓度升高逐渐增强。

（3）三叶草整株及根、茎、叶各部位对盆栽土Cd吸收量均随着Cd浓度增加而递增，其中地上部位（茎、叶）吸Cd百分率最高达87.2%。三叶草对Cd净化率随着Cd处理水平增加而提高，净化率最高达6.2%。

综上，三叶草具有作为超积累植物的较好潜力，可以作为良好的备选种质资源，同时可兼具Cd污染区域环境美化改造和污染修复。

4.2 展望

（1）本研究参考国家土壤环境质量二级标准（Cd≤0.4 mg·kg^-1）（GB 15618—2008），进行Cd污染模拟，尚未得出三叶草根、茎、叶不同部位对Cd的富集临界值等，下一步工作可模拟更高Cd污染环境研究三叶草生理指标变化以及对Cd富集特征。

（2）土壤Cd以不同形态存在，其中有效态Cd通常对环境危害性较大，且能被植物等吸收利用。同时，土壤Cd形态与土壤pH值存在一定关系，因此对土壤Cd形态进行分级提取，以及Cd形态之间转化与土壤pH值等参数的关系应做更为系统研究。