多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是环境中普遍存在的一类持久性有机污染物，给人类健康和生态环境造成了严重的危害^[1-2]，它是焦化厂污染土壤中的主要污染物之一，主要来源于炼焦过程中煤的不完全燃烧^[3]。李凤梅等^[4]报道沈阳某焦化厂土壤中13种PAHs质量浓度总和为5 672.00 mg·kg^-1，且以4环和5环为主，占PAHs总和的75.21%。冯嫣等^[5]报道北京某焦化厂车间土壤中PAHs质量浓度为144.81 mg·kg^-1，以3环和4环为主。近年，由于环境污染和城市规划等原因，一些市中心的焦化厂开始搬迁，而遗留的场地将被改为居住和商业用地。因此，如何有效地清除或降低焦化厂地PAHs污染风险便成为人们重点关注的问题。

针对焦化厂目前已有的PAHs修复技术包括化学淋洗、化学氧化、电动修复、微生物修复和植物修复等^[6]。其中微生物修复和植物修复方法由于低耗、经济有效且环境友好等特点，已成为目前污染土壤修复的主要方式^[7-8]。Sun等^[9]从焦化厂土壤筛选分离出菌株Kocuria sp. P10，液体培养14 d对芴、荧蒽和芘的降解率分别为83.2%、76.5%和59.6%。但由于游离降解菌难于在土壤中存活，导致单纯的微生物修复技术难以大面积推广。Smith等^[10]选取了高羊茅、紫羊茅、黑麦草、红车轴草和三叶草分别修复焦化厂污染的土壤，结果表明植物对3环和4环的PAHs具有一定的修复能力。但由于PAHs具有一定的毒性，可影响植物的生长，致使单纯通过植物修复的效率并不高，如何提高植物对PAHs毒性的抗性、提高植物的生物量、降低PAHs的浓度成为提高植物修复效率的重要途径^[11]。微生物和植物联合修复技术可弥补各自缺点，微生物可部分降解PAHs，降低土壤PAHs的浓度，减轻PAHs对植物的毒害，而植物的根际区可为共生菌提供良好的生长环境，利于菌株的存活，此外根际共生菌往往还具有促生功能，能够提高植物的生物量^[12-13]。Guo等^[12]向农田污染土壤中添加降解PAHs的分枝杆菌，可提高黑麦草对PAHs的去除率和土壤中降解PAHs功能微生物的数量。然而，目前关于焦化厂原位优势植物根际区专性降解PAHs促生菌的研究还未见报道。

笔者对沈阳某弃用焦化厂土壤PAHs进行检测，结果表明4环芘的含量最高，占PAHs总量的15.11%，故该试验选择芘为PAHs的代表模型。利用富集法，从焦化厂区优势植物地肤根际分离具芘降解能力的促生菌，研究它们的促生潜能、降解芘的能力以及对地肤种子生长的影响，以期为焦化厂土壤PAHs污染植物-微生物修复提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂

芘（纯度 > 97%）购自Fluka公司；1-氨基环丙烷-1-脱氨酶（1-amino cyclopropane-1-deaminase，ACC）、吲哚乙酸（Indoleacetic Acid，IAA）购自华中海威（北京）基因科技有限公司。

1.1.2 主要培养基

① 液体无机盐培养基（g·L^-1）：MgSO₄·7H₂O 0.2，K₂HPO₄ 0.8，（NH₄）₂SO₄ 1.0，KH₂PO₄ 0.2，NaCl 20.0，CaCl₂·2H₂O 0.1，葡萄糖0.05，调节pH至8.0。

② DF盐培养基（g·L^-1）：葡萄糖2.0，（NH₄）₂SO₄ 2.0，Na₂HPO₄ 6.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，KH₂PO₄ 4.0，葡萄糖酸2.0，柠檬酸2.0，调节pH至8.0。

③ ADF培养基：用ACC替代DF培养基中（NH₄）₂SO₄，将ACC溶于灭菌蒸馏水后，再过0.22 μm有机滤膜除菌，使其最终浓度为3.0 mmol·L^-1。

④ PKO培养基（g·L^-1）：Ca₃（PO₄）₂ 5.0，葡萄糖5.0，NaCl 20.0，KCl 0.3，（NH₄）₂SO₄ 0.5，MnSO₄·4H₂O 0.03，MgSO₄·7H₂O 0.3，FeSO₄·7H₂O 0.03，琼脂20.0，调节pH至8.0。

1.1.3 土样的采集及理化性质测定

2016年7月，在沈阳某弃用焦化厂区外（41°48′N，123°20′E）采集生长优势植物地肤，采用五点采样法取样，每点掘出面积为10 cm×10 cm，深度为10 cm的包含地肤根系的整块土壤样本，实验室无菌条件下将根际和非根际土壤刮下备用，于4 ℃冰箱保存。测定土壤有机质、pH值、速效N、速效P、速效K以及土壤和地肤中16种PAHs含量。16种PAHs的测定参考Khan等^[14]的方法。PAHs的方法检出限为0.021~0.103 mg·kg^-1（干重），土壤基质加标回收率为84.21%~108.36%。

1.2 根际土壤中具促生能力的芘降解细菌的筛选

取5 g地肤根际土加入到45 mL液体无机盐培养基中（含芘浓度为25 mg·L^-1），28 ℃、120 r·min^-1振荡培养7 d；取上述培养液5 mL再次加入到45 mL含芘的液体无机盐培养基中，28 ℃、120 r·min^-1培养7 d，重复3次，稀释平板法LB固体培养基计数芘耐受菌的数量。

吸取1 mL上述富集液加入到30 mL DF盐培养基中，28 ℃、120 r·min^-1振荡培养24 h，按上述方法再次转接1 mL至30 mL的ADF液体培养基中，28 ℃、120 r·min^-1培养24 h，重复3次，通过ADF固体培养基进行稀释分离单菌落。

1.3 芘降解细菌的鉴定

利用细菌16S rRNA通用引物（F27：5′-AGAGTT TGATCMTGGCTCAG-3′，R1492：5′-TACGYTACCTT GTTACGACT-3′）序列进行PCR扩增，具体参照宋立超等^[15]的方法。获得产物进行测序，然后将所测得序列在GenBank中进行比对。同时常规方法对分离菌的形态、革兰氏染色、芽孢以及菌落特征进行分析。

1.4 分离细菌的特点 1.4.1 促生特性测定

所分离菌株的ACC脱氨酶活性测定参照Liu等^[16]的方法，解磷能力参照张国壮等^[17]的方法，产物IAA的检测采用Salkowski方法^[18]，产铁载体能力参照Payne的^[19]方法。

1.4.2 分离菌种的降解特征

以浓度10⁸ CFU·mL^-1的投菌量和含芘25 mg·L^-1液体无机盐培养基为基础，分别投加所筛选细菌，以不加任何菌株作为对照，28 ℃、120 r·min^-1恒温振荡培养，分别在7 d和14 d取样分析芘残留量。每个处理设3次重复。溶液中芘的萃取参照宋立超等^[15]的方法，芘的测定采用液相色谱法。

1.5 芘胁迫下菌株对地肤种子的促生能力

地肤种子的前处理参照Liu等^[13]的方法，先将地肤种子用70%的酒精表面消毒2 min，然后再用1%次氯酸钠消毒10 min，最后用无菌水冲洗3遍，20粒消毒后的种子放入铺有两层滤纸的培养皿中，分别添加不同浓度的芘溶液（0、10、25 mg·L^-1）和1 mL的菌悬液（OD_600nm=0.6~0.8），28 ℃培养5 d，测定种子的发芽率和芽长。

1.6 统计分析

统计分析使用SPSS 16.0，样品均值的比较采用LSD检验（α=0.05），数据处理使用软件Origin 8.1。

2 结果与分析 2.1 供试土壤性质

地肤根际和非根际土壤理化性质见表 1，可见该地区土壤为弱碱性，地肤根际区的有机质、速效N、速效P和速效K均显著高于非根际区。根际区PAHs质量浓度与非根际区相比，减少了25.1 mg·kg^-1，而地肤中PAHs浓度却为7.69 mg·kg^-1，且根际区含有大量的PAHs耐受菌，这部分菌株具有降解PAHs的潜能，表明地肤根际区PAHs的去除可能是由植物累积和微生物降解协同作用完成。

2.2 分离菌株的鉴定

以芘和AAC为唯一碳源和氮源从地肤根际富集分离出可培养细菌7株，分别编号为KSB1、KSB2、KSB3、KSB4、KSB5、KSB6和KSB7，其菌落形态及鉴定结果列于表 2。菌株KSB2和KSB7均为芽孢杆菌属，长杆、有芽孢、革兰氏染色为阳性、白色菌落；KSB4为沙雷氏菌，短杆、革兰氏染色阴性、白色菌落。

2.3 分离菌株的促生特性

分离菌株促生特性结果列于表 3，除了菌株KSB3和KSB6以外，其余5株菌ACC脱氨酶活性均大于1.0 M α-丁酮酸mg^-1·h^-1（M α-KB mg^-1·h^-1），其中菌株KSB2、KSB4和KSB7的ACC脱氨酶活性在3.55~5.21 M α-KB mg^-1·h^-1；7株菌均具有产IAA的能力，范围为6.33~108.71 mg·L^-1；铁载体为定性检测，菌株KSB3能力最强；菌株KSB2和KSB5不具溶磷特性，菌株KSB7溶磷效果最好。综上，除了铁载体以外，在所有菌株中KSB7具有最高水平的ACC脱氨酶、IAA产物和溶磷活性。

2.4 分离菌株对芘的降解特征

筛选分离所得7株细菌，经14 d培养后其对芘降解效果如图 1所示。各菌株对芘均具有一定的降解能力，其中菌株KSB2和KSB5对芘的降解启动速率较快，在培养7 d后对芘的降解率分别为35.81%和38.57%，然而菌株KSB7在14 d后对芘的降解率却最高，达到90.23%，表明在根际区菌株KSB2和KSB5可能对芘的降解起先导作用，作为共代谢底物促进菌株KSB7对芘的降解，进而提高根际区对PAHs的降解效率。

2.5 不同芘浓度下菌株对地肤种子的影响

综合上述菌株的促生特性和对芘的降解能力，选取菌株KSB2、KSB4和KSB7，考察它们对地肤种子的促生能力。经过5 d培养后其对种子发芽率和芽长的影响如表 4所示。不添加任何菌时，发芽率和芽长随着芘浓度的增加而降低；接种后，无芘胁迫下各菌株与CK相比促生能力无显著差别，而伴随着芘浓度的增加，它们则可显著提高地肤的发芽率和芽长；菌株KSB7表现出最好的促生能力，与CK相比10 mg·L^-1芘胁迫下发芽率和芽长分别提高了14.74%和50%，25 mg·L^-1芘胁迫下提高了56.76%和88.9%（KSB7-CK/CK），表明菌株KSB7对高浓度芘胁迫下的地肤种子的萌发和生长具有显著的影响。

3 讨论

目前，国内外研究者主要通过添加功能微生物（根际促生菌、PAHs降解菌株）来强化植物对PAHs类有机污染物的吸收降解作用^[20]。Liu等^[13]在石油污染土壤高羊茅根际筛选出1株具促生能力的Klebsiella sp. D5A，接种后高羊茅对石油烃的降解率提高了16.2%，地上和地下生物量各提高了75.2%和42.2%。刘魏魏等^[11]研究表明接种PAHs专性降解菌可使紫花苜蓿对PAHs的降解率提高49.6%，而同时接种植物促生菌和PAHs专性降解菌时紫花苜蓿对PAHs的降解率提高了60.1%。基于此，利用降解PAHs的促生菌联合植物修复PAHs污染的焦化厂具有一定的应用潜力，植物和共生功能菌株的筛选是关键。地肤对环境适应性强，土壤生长范围广，具有一定耐碱特性，Moubasher等^[21]研究表明地肤能有效去除干旱地区土壤中石油烃，去除率为31.2%~57.7%，但有关其根际细菌与地肤联合修复有机污染的研究还未见报道。本研究从PAHs污染焦化厂地肤根际分离筛选出7株具芘降解特性的促生菌株，研究了菌株对芘的降解能力。结果表明，摇床培养14 d后菌株KSB1、KSB2、KSB4、KSB5和KSB7对芘的降解率均在58%以上（芘25 mg·L^-1）。分离菌株经鉴定分别属于考克氏菌属（Kocuria sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、类香味菌属（Myroides sp.）、沙雷菌属（Serratia. Sp.）、副球菌属（Paracoccus sp.）、松鼠葡萄球菌属（Staphylococcus sciuri）和芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。KSB2、KSB4、KSB5和KSB7所在属的菌株具有降解PAHs的功能已有报道，系统发育分析与KSB2亲缘关系较近的菌株Bacillus sp.SPL-4可去除土壤中35.1%的4环PAHs，53.5%的5环和6环PAHs^[22]，且有多个研究表明该属菌可产生生物表面活性剂^[22-23]。本研究中菌株KSB2培养7 d对芘的降解率最高，表明该属菌株是一类降解PAHs的优势菌群。Liu等^[24]研究表明接种菌株Bacillus sp. DZ13可提高花生植株13.8%的生物量。本研究发现菌株KSB2、KSB4和KSB7的ACC脱氨酶活性大于3.5 M α-KB mg^-1·h^-1，7株菌均具有产IAA的能力，范围为6.33~108.71 mg·L^-1，具有较强的促生潜力。

根际促生菌可提高种子的发芽率和芽长，进而提高植株的生物量。但植物对所分离的功能菌株是否具有根际效应，是菌株发挥功能的关键。Chen等^[25]发现接种Microbacterium sp. KL5和Candida tropicalis C10可提高黑麦草和东南景天的生物量和对PAHs的去除率，但黑麦草与东南景天比，具有较好的根际效应。为此，我们在促生特性和芘降解能力实验的基础上，选取菌株KSB2、KSB4和KSB7，做了促生试验，结果表明无芘胁迫下菌株的促生特性与对照相比无显著差别，然而随着芘浓度的升高，显著增加了地肤的发芽率和芽长（表 4）。菌株KSB7在芘胁迫下表现出了良好的促生能力，浓度25 mg·L^-1与10 mg·L^-1相比，其促生功能所发挥的相对作用更强，表明菌株KSB7在污染胁迫下，降解功能起先导作用，先缓解了高浓度芘对种子的毒害作用，进而达到促生的效果。关于菌株KSB7对土壤PAHs地肤修复的影响在今后工作中将做进一步的研究。

4 结论

本研究从焦化厂优势植物地肤根际土壤筛选分离出7株具PAHs降解能力的根际促生菌，其中菌株KSB7具有较高的芘降解能力和促生活性，鉴定属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.），接种该株菌可显著提高地肤种子对芘的抗性，在25 mg·L^-1芘浓度下，与对照相比地肤发芽率和芽长分别提高了56.76%和88.9%。表明菌株KSB7在焦化厂污染土壤的地肤-微生物联合修复中具有较大的应用潜力。