氧氟沙星（OFL）是第三代喹诺酮类抗菌药物，由于具有抗菌谱广、抗菌活性强、生物利用率高、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，但同时导致了滥用和动物源食品中的残留^[1-2]。OFL具有促进大鼠结肠粘膜分泌Cl^-的作用^[3]，并且在质量浓度为其临床治疗质量浓度的八分之一以上时，能通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡对HCEP细胞产生显著细胞毒性^[4]；OFL可能通过影响关节软骨细胞的β1整合素功能而抑制了ERK/MAPK信号通路，从而最终导致凋亡^[5]。重金属在环境中普遍存在，动物饲料中通常添加Cu²⁺。重金属Cu²⁺对细胞的毒性研究较多，过量的Cu²⁺可导致Caco-2细胞氧化损伤，从而引起更广泛的细胞毒性效应^[6]。在众多研究中，单一OFL或Cu²⁺污染对细胞毒性效应的研究较多，而两者复合污染对细胞毒性效应的研究报道较少，仅见OFL与Cu²⁺复合形成的配位体的特性、DNA结合特征、生物活性与细胞毒性的研究^[7-9]。关于OFL与Cu²⁺复合污染对Vero细胞产生毒性效应的研究未见报道^[10]。在自然界中，动物细胞受到的胁迫以复合污染居多^[11-13]，如动物疾病控制时使用抗生素，而饲料中添加Cu²⁺，就构成了两者之间的复合污染。在复合污染体系中，几种污染物导致的风险通常不是单一污染物风险的简单累加，而可能是受到污染物间物理或化学作用结果的影响。OFL、左氧氟沙星等属喹诺酮类药物，其3位羧基和4位羰基的氧原子均有很强的配位作用，容易与Cu²⁺结合，形成复合污染物。不同类型的Cu²⁺与喹诺酮类抗生素在DNA和蛋白质上的结合具有明显的区别^[11]。这种复合污染物对细胞的影响值得特别关注^[2]。Vero细胞作为细胞毒理实验的模式细胞，被广泛应用于生产人用病毒疫苗，可用作生物制品生产时的候选细胞基质。复合污染物对Vero细胞毒性效应的研究较少，仅见Andrews等^[14]报道了重金属和螯合物对Vero细胞的生物毒性。而OFL与Cu²⁺对Vero细胞复合污染的研究未见报道。本研究选用抗生素OFL与Cu²⁺作为污染物代表，对非洲绿猴肾细胞进行毒性实验，研究单一污染和复合污染对非洲绿猴肾细胞生长的抑制特征及细胞毒性，对了解自然条件下抗生素与重金属复合污染物对动物细胞的影响具有重要的参考价值。

Vero细胞即非洲绿猴肾细胞由昆明理工大学生命科学与技术学院提供。试剂为三水合硝酸铜（Cu（NO₃）₂·3H₂O，Alfa Aesar Company，分析纯）、氧氟沙星（OFL，沈阳新马药业有限公司，分析纯）、DMEM高糖培养基（HyClone Company，DMEM/High Glucose）。

Vero细胞按常规方法^[15]，用DMEM高糖培养基在培养瓶中培养，置于37 ℃、CO₂浓度为5%的CO₂恒温培养箱中维持生长。传代及细胞完全贴壁后均使用DMEM高糖培养基维持培养。

将5% CO₂、37 ℃培养的Vero细胞，以2.5×104/孔接种于96孔培养板内，培养12~24 h，待细胞长成单层后，吸弃培养液，分别加入浓度为2.75、6.88、859、1718、3437、6875、13 750 mg·L^-1的Cu²⁺溶液（以Cu（NO₃）₂·3H₂O配制），浓度为0.63、1.25、2.5、5.0、10 mg·L^-1的OFL溶液。2.75 mg·L^-1和6.88 mg·L^-1 Cu²⁺分别与OFL形成复合物（OFL浓度分别为0.63、1.25、2.5、5.0、10 mg·L^-1），同时设正常细胞及空白对照，每处理3个重复。将培养板置于5% CO₂、37 ℃培养箱中培养1 h后，每孔补加MTT液10 μL，在5%CO₂、37 ℃培养箱中反应4 h，吸弃上清液。

用显微镜观察不同处理条件下的Vero细胞形态变化。

每孔加入DMSO（二甲基亚枫）100 μL，于振荡器上振荡10 min，用酶标仪于492 nm波长下测定光吸收值（OD），然后计算细胞抑制率。

细胞抑制率=1-（污染物处理细胞存活率/对照细胞存活率）×100%

采用SPSS 10.0统计软件进行t检验，P < 0.05为显著差异，具有统计学意义。采用Excel 2007软件进行数据处理、图形绘制。

在细胞密度稳定和未加入污染物时，Vero细胞呈现出正常细胞形态，细胞完整，均匀分布。在加入OFL、Cu²⁺及其复合物之后，不论污染物是何种类型与浓度，均可观察到Vero细胞形态变化（细胞破碎，贴壁率降低），表明添加不同污染物后Vero细胞形态发生改变。

随着Cu²⁺浓度的增加，Vero细胞生长抑制率逐渐上升。当Cu²⁺浓度为2.75 mg·L^-1和6.88 mg·L^-1时，Vero细胞生长抑制率分别为32.4%和31%；当Cu²⁺浓度为6875 mg·L^-1时，Vero细胞生长抑制率为87.5%，且开始呈现稳定趋势。最高Cu²⁺浓度下Vero细胞生长抑制率比最低浓度时高56.5%。因此，后续实验使用的Cu²⁺浓度为2.75 mg·L^-1和6.88 mg·L^-1（图 1）。

图 1 Cu2+对Vero细胞生长抑制率的影响 Figure 1 The inhibiting rate of Cu2+ on growth of Vero cell

图选项

在OFL浓度为0.63~2.5 mg·L^-1时，Vero细胞生长的抑制率呈现负值，说明Vero细胞的生长得到了促进；而当OFL浓度逐渐增加到5 mg·L^-1后，Vero细胞生长的抑制率为正值，说明高浓度OFL对细胞生长产生抑制，且在浓度为5 mg·L^-1时达到峰值，为14.75%（图 2）。

图 2 OFL对Vero细胞生长的抑制率 Figure 2 The inhibiting rate of OFL on growth of Vero cell

图选项

2.75 mg·L^-1 Cu²⁺与不同浓度OFL复合物对细胞生长的抑制率如图 3所示。在OFL浓度为0.63 mg·L^-1和1.25 mg·L^-1时，OFL与Cu²⁺的复合物对细胞的抑制率与OFL、Cu²⁺单一抑制率之和没有显著差异；当OFL浓度为2.5、5、10 mg·L^-1时，Cu²⁺与OFL的复合物对细胞的抑制率与OFL、Cu²⁺单一抑制率之和有显著差异。OFL浓度为2.5 mg·L^-1时，OFL与Cu²⁺的复合物对细胞的抑制率比OFL、Cu²⁺单一抑制率之和高11.8%；OFL浓度为5 mg·L^-1和10 mg·L^-1时，OFL与Cu²⁺的复合物对细胞的抑制率又比OFL、Cu²⁺单一抑制率之和分别低了11.3%和9.8%。并且，在此Cu²⁺浓度下，OFL与Cu²⁺的复合物对细胞的抑制率在30%~36%之间，但随OFL浓度的变化没有显著差异。

图 3 2.75 mg·L-1 Cu2+与不同浓度OFL复合物对细胞生长的抑制率 Figure 3 The inhibiting rate of Cu2+-ofloxacin complex on growth of Vero cell under 2.75 mg·L-1 Cu2+

图选项

图 4显示了6.88 mg·L^-1 Cu²⁺与不同浓度OFL复合物对细胞生长的抑制率。OFL浓度为1.25、2.5 mg·L^-1时，OFL与Cu²⁺的复合物对细胞抑制率的实测值与OFL、Cu²⁺单一抑制率之和之间没有显著差异；而当OFL浓度为0.63、5、10 mg·L^-1时，OFL与Cu²⁺的复合物对细胞抑制率的实测值显著低于OFL、Cu²⁺单一抑制率之和。OFL与Cu²⁺的复合物对细胞的抑制率随着OFL浓度的增加而增加。

图 4 6.88 mg·L-1 Cu2+与不同浓度OFL复合物对细胞生长的抑制率（%） Figure 4 The inhibiting rate of Cu2+-ofloxacin complex on growth of Vero cell under 6.88 mg·L-1 Cu2+

图选项

本研究表明抗生素OFL与重金属Cu²⁺的复合物对Vero细胞产生了毒性效应，并表现为抑制细胞生长，OFL与Cu²⁺的复合物会对细胞产生复合污染。实验表明Vero细胞在污染物毒性作用下出现了破碎的现象，污染物使Vero细胞的形态发生了改变，抑制了细胞生长。这与石艳玲等报道的细胞形态毒性响应主要以贴壁细胞减少为主^[10]，具有明显的差别。OFL与Cu²⁺复合污染和OFL、Cu²⁺单一污染对Vero细胞抑制率都具有显著差异，且复合污染对Vero细胞的抑制率并不是OFL、Cu²⁺单一污染对Vero细胞抑制率之和。在OFL与Cu²⁺复合形成的配位体特性、DNA结合特征、生物活性与细胞毒性研究的基础上^[7-9]，深入研究OFL与Cu²⁺复合污染对Vero细胞产生的毒性效应是十分新颖的^[10]，值得探索，具有重要的理论意义。

OFL与Cu²⁺的复合物与OFL、Cu²⁺单一污染均会对细胞生长产生抑制，对细胞产生毒性效应。在复合物浓度较低时，受OFL的影响，复合物溶液会使污染物对细胞生长抑制率降低。在OFL浓度较低时，OFL对细胞生长的抑制率是负值，说明OFL作为抗生素，在合理浓度范围内可能对细胞生长的影响较小且会促进部分细胞生长^[3]。OFL与Cu²⁺的复合物对细胞抑制率与OFL、Cu²⁺单一抑制率之和具有显著差异，OFL与Cu²⁺的复合物对细胞的抑制率比OFL、Cu²⁺单一抑制率之和低，表明OFL与Cu²⁺对细胞生长的复合污染表现出拮抗作用，导致OFL与Cu²⁺的复合物比OFL、Cu²⁺单一污染时毒性降低。OFL与Cu²⁺的复合物中，除了游离的Cu²⁺与游离的OFL外还存在两者的复合物，如络合反应产生的络合物，以及OFL与Cu²⁺和DMEM培养液中其他物质发生反应生成的产物，都可能影响细胞的生长，所以OFL与Cu²⁺的复合物对细胞的影响并不单纯的等于两种污染物毒性之和^[16-18]；同时，低浓度Cu²⁺条件下，OFL与Cu²⁺的复合物对细胞的抑制率随OFL浓度的变化没有显著差异。由此可见，在DMEM培养液中，OFL与Cu²⁺的络合反应受其他因素影响较大^[19]。

在自然环境中，抗生素的滥用和饲料中金属元素的过度添加，使得动物细胞受到复合污染的情况增多^[11-13]，且在复合污染体系中，受污染物间物理或化学作用的影响，复合污染体系的风险并不能简单的认为是单一污染物风险的累加。为了进一步探讨复合污染对细胞生长的影响，构建复合物反应体系具有重要的意义。在不同环境体系中，由于受不同环境的影响，复合污染物各组分间浓度配比会发生改变^[20-21]，进一步探讨在不同背景下各组分之间的配比，构建系统的污染物配比方案，进一步确定复合污染物的复合污染特征，系统阐明复合污染对细胞生长的影响及其机理，是十分必要的。针对OFL与Cu²⁺复合物对非洲绿猴肾细胞（Vero）的毒性效应，我们获得的知识仍然相当有限，应该引起高度关注，开展更加深入的研究。

本文研究了氧氟沙星与Cu²⁺对细胞生长复合污染的毒性效应。结果表明，氧氟沙星与Cu²⁺对细胞生长的复合污染的抑制率小于氧氟沙星与Cu²⁺单独对细胞生长抑制率之和，表明氧氟沙星与Cu²⁺对细胞生长的复合污染表现出拮抗作用。