随着工业的发展，重金属已成为环境污染的重要因子之一。重金属对植物的伤害主要表现为植物DNA的损伤，包括碱基改变、DNA单双链断裂、与蛋白质的交联和DNA的期外合成等^[1]，这些不可逆的损伤，还可能遗传给后代，造成严重后果。重金属能够导致植物DNA甲基化的改变^[2]，这种对胁迫做出的迅速反应可以弥补高度稳定的DNA序列对逆境响应的不足^[3-5]。中华水韭（Isoetes sinensis Palm）是孑遗古老的活化石植物，因生存环境的变迁和生存区域的减少成为濒危物种，被列为国家一级重点保护野生植物^[6]。本文主要报道重金属镉和铅对中华水韭DNA甲基化的影响情况，为深入研究古老植物适应环境和响应重金属胁迫分子调控特殊机制提供材料。

试材中华水韭来自浙江大学，并由哈尔滨师范大学蕨类研究室繁殖。胁迫处理前由温室移栽至实验室。经30 d恢复培养后，分别用500 mg·L^-1（Pb-1）、2000 mg·L^-1（Pb-2）和5000 mg·L^-1（Pb-3）浓度的硝酸铅和100 mg·L^-1（Cd-1）、250 mg·L^-1（Cd-2）和500 mg·L^-1（Cd-3）浓度的氯化镉溶液直接浇灌，至第7 d和第14 d再浇灌2次，3次共计100 mL。至第28 d随机选取不同植株相同生长部位的叶片进行DNA甲基化水平测定，测定方法采用MSAP（甲基化敏感扩增多态性）技术，参考Xiong等^[7]方法进行。

结果表明，Pb-2处理组全甲基化水平略低于半甲基化水平，对照组CK、Pb-1和Pb-3处理组的全甲基化水平均明显高于半甲基化水平（图 1）。Pb-2处理组的总甲基化水平和半甲基化水平明显高于对照组，3个处理组的全甲基化水平均低于对照组。由此可以分析得出，重金属铅能够对中华水韭DNA甲基化产生影响，并且不同浓度的铅胁迫对中华水韭DNA甲基化的影响不同，其中2000 mg·L^-1浓度的铅胁迫的影响作用最大。铅胁迫对中华水韭甲基化模式的影响主要表现在半甲基化的增强。

图 1 铅胁迫下中华水韭基因组DNA甲基化水平 Figure 1 The methylation level of Isoetes sinensis DNA under Pb stress

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3种浓度镉胁迫下中华水韭基因组DNA的半甲基化水平均高于对照，但全甲基化水平均低于对照，而总甲基化水平表现为Cd-1低于对照，Cd-2和Cd-3高于对照（图 2）。在对照组中，全甲基化占优势，Cd-3处理组全甲基化略微占优势，Cd-2则半甲基化明显占优势。半甲基化在镉胁迫下中华水韭DNA甲基化的变化模式中以增强为主，而全甲基化以减弱为主。

图 2 镉胁迫下中华水韭基因组DNA的甲基化水平 Figure 2 The methylation level of Isoetes sinensis DNA under Cd stress

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对铅、镉胁迫下的中华水韭DNA甲基化水平进行比较分析（图 3），发现中华水韭DNA甲基化总体水平基本一致，分别为48.23%和48.10%，与对照46.96%相比略有增加，但全甲基化水平均明显低于对照，而半甲基化水平均明显高于对照。与对照相比，铅处理组全甲基化水平高于半甲基化水平，而镉处理组则相反，推测重金属铅、镉胁迫中华水韭后存在不同的DNA甲基化模式变化。

图 3 铅、镉胁迫下中华水韭基因组DNA甲基化水平比较 Figure 3 The comparison on methylation level of Isoetes sinensis DNA under Pb and Cd stress

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MSAP甲基化结果有4种类型^[8]，Ⅰ类型：HapⅡ和MspⅠ都有带，即（1，1）；Ⅱ类型：HapⅡ有带，MspⅠ无带，即（1，0）；Ⅲ类型：HapⅡ无带，MspⅠ有带，即（0，1）；Ⅳ类型：HapⅡ和MspⅠ都无带，即（0，0）（表 1）。分析表 2可以看出，在A型（甲基化增强）的5种甲基化模式中，所占比率最高的是对照Ⅰ型胁迫Ⅳ型（1，1；0，0），3种浓度铅和镉胁迫平均所占比率分别为15.96%和15.08%。其次是对照Ⅱ型胁迫Ⅳ型（1，0；0，0），平均所占比率分别为9.57%和7.26%。平均所占比率最低的是对照Ⅰ型胁迫Ⅲ型（1，1；0，1），分别为0.87%和2.51%。该数据说明，铅和镉胁迫下的中华水韭基因组DNA甲基化以无甲基化或内外侧胞嘧啶半甲基化向内外侧胞嘧啶全甲基化变化的模式为主，由无甲基化或内侧胞嘧啶半甲基化向仅发生内侧胞嘧啶全甲基化变化的模式最为少见。在B型（甲基化减弱）的5种甲基化模式中，所占比率最高的是对照Ⅳ型胁迫Ⅰ型（0，0；1，1），3种浓度铅和镉胁迫平均所占比率分别为16.99%和26.81%。其次是对照Ⅳ型胁迫Ⅲ型（0，0；0，1），平均所占比率分别为11.52%和16.38%。平均所占比率最低的是对照Ⅲ型胁迫Ⅰ型，分别为0.53%和2.67%。该数据说明，在去甲基化的变化模式中，还是以内外侧胞嘧啶全甲基化向无甲基化或内侧胞嘧啶半甲基化或全甲基化变化的模式为主，仅发生内侧胞嘧啶全甲基化向无甲基化或内侧胞嘧啶半甲基化变化的模式最为少见。另外，各种DNA甲基化模式所占比率与铅和镉的处理浓度没有表现出显著相关。铅和镉胁迫在导致中华水韭DNA甲基化增强所占比率方面几乎相等，而在去甲基化所占比率方面镉高于铅。

表 1 酶切类型及所代表的DNA甲基化模式 Table 1 Restriction type and represent DNA methylation patterns

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表 2 铅、镉胁迫下中华水韭基因组DNA甲基化模式分析 Table 2 The analysis of methylation status in Isoetes sinensis genomic DNA under Pb and Cd stress

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很多研究显示重金属胁迫下植物总甲基化水平有明显提高^[9-12]，但也有报道与本研究结果相似，即重金属胁迫后DNA总甲基化水平有所提高但幅度不大^[13]。有些研究还显示重金属处理后DNA甲基化水平有升高也有降低，与处理的浓度相关^[14]。所以，根据本实验结果分析认为，重金属胁迫所引起的中华水韭DNA甲基化水平的变化，主要表现为全甲基化水平的降低和半甲基化水平的升高，综合而言，在总甲基化水平上的变化不够明显。但在DNA甲基化变化的模式上，铅和镉胁迫下的中华水韭表现出显著特征，因此分析植物响应重金属胁迫的遗传可塑性机制，从DNA甲基化变化模式进行更加合理，而不是简单比较甲基化水平的变化程度^[15]。