随着我国城市化、工业化进程加快，以及农药、化肥的不合理施用，土壤重金属污染日益严重，已成为影响我国社会、经济发展的重要环境问题。土壤重金属污染物具有移动性差、滞留时间长、不易被微生物降解等特点，因此治理和修复难度大^[1-2]。2016年5月28日，国务院印发了《土壤污染防治行动计划》，要求加强涉重金属行业污染防控。重金属污染土壤修复方法包括物理修复、化学修复和生物修复，其中生物修复中的植物修复技术以其成本低廉、环境扰动小、二次污染小、不破坏景观、可激发微生物活动等优点而成为研究热点^[3-4]。无法直接实施植物修复的重金属重度污染区，可通过施加外源改良剂，减少重金属对植物的毒害作用^[5]，最终建立“改良剂-植物”综合修复体系。

Cu是动植物生长必需的微量元素，同时也是重要的重金属污染物，土壤Cu污染严重影响植物、土壤微生物的生长发育，甚至通过饮用水或食物链危害人类健康。本研究选取冶炼厂周边的Cu污染田块，通过为期一年的盆栽试验，建立“石灰-黑麦草”联合修复体系，进而考察联合修复对黑麦草生长、黑麦草Cu吸收、土壤Cu形态转化以及土壤微生物群落变化等的影响，评估石灰与黑麦草对Cu污染土壤的修复效果。

1 材料与方法 1.1 供试材料

土壤：采集自江西省贵溪市滨江乡一处污染田块（28°12′N，116°55′E）的表层土壤（0~20 cm）。该区域常年受到某冶炼厂排放的含重金属废水、废渣、废气的污染，且有明显沙化现象，田块已废弃多年。土壤采集后，自然风干，去除植物碎片、根系、石子等杂物，过筛备用并测定其理化指标。供试土壤基本理化性质如表 1所示。

改良剂：石灰，购自郑州建材大市场，pH 12.4，Cu含量1.09 mg·kg^-1，粒径0.25 mm。

植物：“冬牧70”牌黑麦草（Secale cereale），能够耐受并积累Cu、Zn等重金属，购自河南秋乐种业科技股份有限公司。

复合肥：河南“心连心”牌，（N、P₂O₅、K₂O各为15%，总养分45%），购自河南新乡心连心化肥有限公司。

1.2 试验设计

选取石灰为Cu污染土壤改良剂，以黑麦草为修复植物进行盆栽试验研究，试验共设置4个处理，每个处理设置3次重复。不添加改良剂的对照处理记为CK，添加低、中、高剂量石灰（石灰占试验土壤质量百分比分别为0.1%、0.2%和0.4%）的处理分别记为SH1、SH2和SH3。

2015年11月12日开始装盆（塑料花盆直径32 cm，高23 cm），每盆称取风干土4.00±0.01 kg，复合肥2 g，施入相应剂量石灰后充分混匀。隔天浇水至土壤田间持水量的70%并平衡1周。2015年11月20日，每盆数取催芽1 d后的黑麦草种子50粒，均匀种植于土壤表层0.5 cm左右。此后，根据土壤干湿情况适时浇水，每盆浇水量保持一致。2016年4月24日，在黑麦草刚开始抽穗时，采集黑麦草地上部和根系，同时采集根际土壤样品并装入无菌自封袋中。植物样品按照杜志敏等^[6]的方法进行处理，土壤样品一部分去除杂物并过尼龙筛后测定土壤微生物功能多样性，另一部分风干后过筛并测定其pH值及各形态Cu含量。

1.3 样品分析

土壤样品分析采用鲁如坤^[7]的方法。土壤pH值按土水质量比1:2.5，酸度计（pH S-2C，上海康仪公司）测定。黑麦草植株Cu含量采用硝酸-高氯酸消煮，土壤Cu化学形态分级及提取采用朱嬿婉等^[8]修改后的Tessier连续提取法，原子吸收分光光度计法（WFX110A，北分瑞利）测定。

1.4 数据处理

采用Microsoft excel 2010和Windows SPSS 19.0进行数据的统计分析，采用CANOCO 4.5对Biolog微平板吸光度进行主成分分析（PCA）。

2 结果与讨论 2.1 石灰对黑麦草生物量及其Cu吸收的影响

表 2显示了施用不同剂量石灰对黑麦草生长及其Cu吸收的影响。各处理黑麦草均能出苗，1周后对照处理的部分黑麦草嫩苗失绿、发黄、根部腐烂直至死亡，为典型的Cu中毒症状^[9]。2016年4月24日，对照处理黑麦草的地上部和根系生物量均最低，施入低、中、高剂量石灰后均显著提高了黑麦草生物量。其中SH2处理黑麦草地上部和根系生物量增加效果最显著，分别达到对照处理的47.3倍和32.4倍。同一处理下黑麦草不同部位Cu含量分布规律为根系>地上部。这是由于植物受Cu毒害的最初部位是根^[10]，Cu进入植物体后与体内有机组分结合生成稳定的配位化合物，其中很大部分富集于根部，不易向地上部运输^[11]。施用低、中、高剂量石灰均显著降低了黑麦草地上部和根系Cu浓度，表明石灰对土壤中Cu的钝化效果明显。不同处理间黑麦草地上部或根系Cu浓度均表现为CK>SH1>SH3>SH2，其中SH2处理黑麦草地上部和根系Cu浓度与对照处理相比降幅最大，分别降低了68.4%和49.7%。石灰常作为重金属污染土壤改良剂，具有降低重金属毒性，减少植物对重金属吸收的作用^{[6, 12]}。施用低、中、高剂量石灰后，黑麦草地上部及根系Cu吸收量均显著高于对照处理，大小顺序均表现为SH2>SH3>SH1>CK，其中SH1、SH2和SH3处理间地上部Cu吸收量无显著差异，而SH1、SH2和SH3根系Cu吸收量两两之间均有显著性差异。以对照处理自然修复过程黑麦草地上部分和根系Cu吸收量总和为1，不同处理与对照处理黑麦草Cu吸收量总和的比值即为其吸收量相对值，添加低、中、高剂量石灰处理的Cu吸收量相对值分别为对照处理的18.2、37.6、30.9倍。

2.2 石灰对土壤pH值及Cu化学形态的影响

石灰等改良剂对土壤重金属化学形态的影响除吸附解吸、氧化还原等作用外，改变土壤pH值是其重要的机制。土壤pH值增加，一方面降低了土壤溶液中氢离子的浓度，氢离子与重金属离子的竞争能力减弱，土壤中碳酸盐、有机质、铁锰氧化物等与重金属离子的结合更加牢固，土壤中生物有效性低的碳酸盐结合态、有机结合态和铁锰氧化物结合态等重金属含量增加；另一方面，增加了土壤胶体表面的可变负电荷，促进土壤胶体对带正电荷的重金属离子的吸附，并降低吸附态重金属的解析量^[13-14]。施用石灰后Cu污染土壤pH值的变化情况如图 1所示。对照处理土壤pH值较低，施用石灰后土壤pH值显著增加，且增幅随添加剂量增加而增大，其中SH2、SH3处理土壤pH值较对照分别增加了0.9、1.1个单位。Tessier逐级提取法^[15]将土壤重金属划分为可交换（EX）态、碳酸盐结合（CAB）态、铁锰氧化物结合（OxiB）态、有机结合（OrgB）态和残渣（ResB）态，土壤中重金属形态分布与其毒性及生物有效性密切相关^[16]。由图 2可知，对照处理土壤EX态Cu含量占总量20.2%，显著高于其他处理，结合对照处理黑麦草生物量最低，进一步验证EX态Cu的生物有效性高，对植物的毒害性大。施用石灰显著降低了土壤EX态Cu含量，并显著增加了土壤CAB态Cu含量，即石灰促进Cu由生物有效性高的形态向低的形态转化。与对照处理相比，SH1、SH2、SH3处理土壤EX态Cu含量分别降低了58.5%、87.7%和74.8%，而CAB态Cu含量分别增加了36.3%、93.4%和56.1%。与对照处理相比，SH2和SH3处理显著增加了土壤OxiB态Cu含量，并降低了ResB态Cu含量。

土壤EX态Cu含量与黑麦草生物量及Cu吸收相关性分析结果表明，土壤EX态Cu含量与黑麦草地上部、根系Cu浓度均达到极显著正相关关系，相关系数分别为0.833、0.919（n=12，P < 0.01）；土壤EX态Cu含量与黑麦草地上部、根系生物量均达到极显著负相关关系，相关系数分别为0.904、0.890（n=12，P < 0.01）。这进一步验证了土壤EX态Cu含量的生物有效性高，极易被植物吸收，其对植物毒害作用很大，严重影响植物生长发育^[17-18]。

2.3 石灰对污染土壤微生物功能多样性的影响

Biolog法是研究微生物功能多样性的有效方法^[19]，已被应用于土壤重金属污染监测与修复等环境微生物生态学研究^[20-23]。不同处理土壤微生物在168 h培养时间内的AWCD值（每孔平均吸光度变化）如图 3所示。在培养初期的24 h里，土壤微生物AWCD值增加不明显，且不同处理间没有显著差异，随着培养时间延长，4种处理AWCD值有不同程度增加，120 h之后增幅逐渐减缓，并于144 h附近趋于稳定。在48~168 h的培养时间里，不同处理AWCD值大小均表现为SH2>SH3>SH1>CK，且两两处理间均达到显著差异水平。

BIOLOG ECO板在培养72 h时数据主要表现为细菌的增长，且增长速度通常最高^[24-25]，故本研究选取72 h时的BIOLOG测试数据进行微生物群落功能多样性指数计算（表 3）及主成分分析（图 4）。土壤微生物多样性指数种类很多，但不同指数反映了群落组成的不同方面。Shannon指数是评估微生物群落丰富度和均匀度的综合指标，种类数目越多，种类间个体分配均匀性越大，则多样性越高；Simpson指数用于评估群落内最常见种的优势度；McIntosh指数则用于衡量群落中物种的均一性^[26-27]。本研究选用Shannon、Simpson和McIntosh指数来对试验设计中土壤微生物群落进行评价。

由表 3可知，SH1、SH2、SH3处理的基质丰富度指数S与对照相比分别增加了2.66、4.66、3.66个单位，其中SH2与对照达到了显著差异水平，表明石灰不同程度地增加了土壤微生物可利用碳源的种类。石灰不同程度地增大了土壤微生物Shannon、Simpson和McIntosh指数，整体表现为SH2>SH3>SH1>CK。与对照处理相比，SH1、SH2、SH3处理的Shannon指数分别提高了0.31、0.68、0.61，且均达到显著差异水平；SH2、SH3处理的Simpson指数分别提高了15.81、12.48，且均达到显著差异水平；SH1、SH2、SH3处理的McIntosh指数分别提高了0.94、4.61、4.28，且均达到显著差异水平。

土壤微生物是土壤系统中活性最高的组分之一，对环境变化极为敏感。表 4是土壤微生物功能多样性指数（72 h）与黑麦草生物量、土壤Cu形态的相关性系数，结果表明土壤微生物AWCD值、基质丰富度指数S、Shannon、Simpson和McIntosh多样性指数与黑麦草地上部及根系生物量均呈极显著正相关关系，与土壤EX态Cu含量均呈极显著负相关关系。石灰处理后土壤微生物多样性的增加，一方面归因于黑麦草生物量的增加，植物残体进入土壤后可作为营养物质促进微生物生长繁殖，此外植物根系还可分泌细胞脱落物和裂解物、高分子量的凝胶状物、低分子量的有机化合物等根系分泌物，这些均可促进土壤微生物生长繁殖^[28-29]；另一方面则由于石灰降低了土壤Cu生物有效性，减少了重金属Cu对微生物生长的毒害作用。这与前人^{[21, 30]}的研究结果一致。

2.4 土壤微生物碳源利用主成分分析

BIOLOG数据分析中的AWCD值、群落功能多样性指标等主要在“量”的角度对碳源利用模式进行解读，要从“质”的角度对数据进行深入分析解读，常用主成分分析（PCA）方法^[31]。BIOLOG数据主成分分析所提取出的主成分是原始变量的线性组合，能够代表大部分原始数据的信息。主成分分析可将大量的复杂数据通过二维或三维的图标表现出来，相似的样点分布位置相近，能够直观地体现微生物群落的差异。将土壤微生物碳源代谢72 h的BIOLOG数据进行主成分分析，分析提取的前4个主成分因子的贡献率及累积贡献率如表 5所示。变换后前4个主成分可以解释82%以上原变量的特征。取第一主成分（PC1，可解释变量总方差的45.43%）和第二主成分（PC2，可解释变量总方差的20.42%）作主成分分析图，以表征微生物的代谢特征（图 4）。

在主成分分析图中，不同样点之间的距离代表样点在碳源利用方面的相似性^[32]。如图 4所示，本试验4种处理样点均能不同程度地聚类，表明同一处理的重复样点之间的重现性较好，碳源利用模式相似；此外，CK和SH1处理的样点投影点较分散，而SH2和SH3处理样点相对比较集中，反映出中、高剂量石灰处理对重金属Cu毒性的降低效果好，微生物群落结构也呈现出稳态发展。主成分分析图中不同处理的投影点之间有明显差异，除SH1分布在第二、第三象限外，其余CK、SH2、SH3处理分别处于第三、第四、第一象限，表明不同处理下的土壤微生物群落在碳源利用上有明显差异。

主成分分析图中样点到表征碳源因子箭头的投影点，可以表示样点对该碳源的利用情况^[32]。结果显示CK处理能够利用的碳源种类最少，且利用程度很低；SH1处理能够利用的碳源种类较少，主要有H2、D1、E3、H3，但利用程度均较低；SH3处理可以利用的碳源主要分布在第一象限，主要包括H2、D1、H1、G2、A3、E2等；SH2处理可以利用的碳源种类和数量最多，分布在第一象限和第四象限的碳源绝大多数能被较好地利用，其中F2、D3、C2、G4、A4、E1、F3、D2、H4、F1、B4等碳源的利用程度最高。SH2处理土壤中毒性较高的EX态Cu含量最低，一方面降低了对土壤微生物的直接毒害作用，另一方面通过增加黑麦草根系分泌物及凋落物残体间接促进了土壤微生物的生长繁殖。

3 结论

（1）重金属Cu污染土壤施用石灰能显著提高黑麦草地上部和根系的生物量，增加黑麦草地上部及根系的Cu吸收量，SH1、SH2、SH3处理的Cu吸收量相对值与对照相比分别提高了18.2、37.6、30.9倍，其中SH2处理的修复效果最好。

（2）施用石灰显著提高了土壤pH值，并使土壤Cu由生物有效性高的EX态向生物有效性低的CAB态、OxiB态和OrgB态转化。与对照处理相比，SH1、SH2、SH3处理土壤EX态Cu含量分别降低了58.5%、87.7%和74.8%，而CAB态Cu含量分别增加了36.3%、93.4%和56.1%。

（3）石灰处理后土壤微生物AWCD及Shannon、Simpson和McIntosh指数较对照均有所提高，整体表现为SH2>SH3>SH1>CK，表明石灰提高了土壤微生物对碳源的利用能力，增加了土壤中能利用相应单一碳源的微生物种类和数量。

（4）主成分分析结果表明，石灰处理后土壤微生物群落的碳源利用模式发生了明显变化，4种处理土壤微生物群落在碳源利用上出现明显差异，SH2处理可利用的碳源种类、数量最多，其次是SH3处理，SH1和CK处理可利用的碳源种类与数量最少。

（5）以植被恢复、植物吸收、化学提取和微生物群落恢复作为修复效果评价指标，本试验设置的中剂量石灰（质量分数0.2%）和黑麦草的联合修复方法对Cu污染土壤修复效果最好，适宜在酸性Cu污染土壤上推广应用。