2017, Vol. 36文章信息
- 黄勃铭, 吕小慧, 王秋丽, 朱小山, 周进, 蔡中华
- HUANG Bo-ming, LÜ Xiao-hui, WANG Qiu-li, ZHU Xiao-shan, ZHOU Jin, CAI Zhong-hua
- 富勒烯对大型蚤的急性毒性和慢性毒性效应
- Toxicity assessments of fullerene to Daphnia magna: Acute toxicity and chronic toxicity
- 农业环境科学学报, 2017, 36(4): 620-624
- Journal of Agro-Environment Science, 2017, 36(4): 620-624
- http://dx.doi.org/10.11654/jaes.2016-1570
文章历史
- 收稿日期: 2016-12-07
2. 清华大学深圳研究生院, 广东 深圳 518000;
3. 哈尔滨工业大学深圳研究生院, 广东 深圳 518000;
4. 辽宁省环境监测实验中心, 沈阳 110161
2. Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518000, China;
3. Shenzhen Graduate School, Harbin Institute of Technology, Shenzhen 518000, China;
4. Liaoning Environmental Monitoring & Experiment Center, Shenyang 110161, China
富勒烯 (nC60) 作为一种典型的人工纳米材料, 以其优良的性质, 被人们越来越多地利用, 相关产品遍布人类生产、生活的方方面面[1]。尽管人们对nC60和其他纳米材料应用的研究日益丰富、宽泛, 但对它们的毒理学和环境效应所知甚少。大量证据表明nC60会对人类细胞、细菌和动物产生毒害[2-4], 毒性影响包括改变革兰氏阴性菌和阳性菌细胞膜组分, 引起细胞死亡等[5-6]。此外, nC60引起人类淋巴细胞的DNA损伤和小鼠肺毒性也已被科学家证实。然而, 关于nC60对水环境生态效应的研究目前仍较少。
大型蚤是水生浮游动物的代表, 是连接水生食物链的重要中间体, 对净化水体有重要作用, 其初级生产量直接影响水生生态系统的结构和功能[7-8]。由于大型蚤具有的普遍性、敏感性和生命周期短等特点, 使其成为国内外水生生物毒理学研究的标准测试生物, 广泛用于水生生物风险评估测试。目前, 国内外学者对nC60的水生态毒理学做了初步研究。Tao等[9]对出生24 h的幼蚤进行急性毒性实验, 结果表明nC60暴露48 h的LC50为0.44 mg·L-1, 在极低的浓度即产生明显急性毒性; 其实验还发现延长暴露时间不仅对母蚤产生毒性, 而且对其后代产生不利影响。Tervonen等[10]研究了不同浓度下大型蚤对nC60的生物富集情况, 发现在不同暴露浓度下nC60均能被大型蚤迅速摄入, 却很难被排出体外, 这使得nC60在肠道内形成大量累积。Tao等[11]还发现斜生栅藻长期暴露在nC60中, 其叶绿素含量减少, 光合作用受到抑制, 从而使多糖、蛋白和脂质等光合产物的合成量降低。Britto等[12]发现在紫外光照射下, nC60和低浓度藻毒素 (50 μg·L-1) 共同作用会使锦鲤的抗氧化能力受到损伤。nC60与现有污染物的联合毒性不容忽视。另外, nC60长期暴露对大型蚤所产生的慢性毒性效应仍不清楚。
本文较为全面地考察了nC60对大型蚤的急性和慢性毒性, 分别从抑制率、死亡率、跳跃频率和心跳频率等方面展开对急性毒性的研究, 从21 d的总产蚤量和日产蚤量两方面对慢性毒性进行评估, 旨在为评估nC60的水环境风险提供基础数据。
1 材料与方法 1.1 实验生物模式生物大型蚤由南开大学赠送, 体长为 (3.7±0.2) mm, 并按照Tao等[13]方法进行培养。培养温度为 (21±1) ℃, 溶解氧为6 mg·L-1, 光暗周期16 h/8 h, 每天定时投喂斜生栅藻 (Scenedesmus obliquus)。斜生栅藻的培养参照赵丽红[14]的方法。
1.2 实验试剂nC60购于南京先丰纳米材料有限公司, 杂质包含C70、C60的氧化物, 以及微量溶剂和极少量高富勒烯, 纯度大于99.5%。其余试剂均为国产优级纯或分析纯, 纯度均高于99.0%。玻璃仪器在使用前均用10.0%浓硝酸浸泡48 h, 并用去离子水冲洗干净。
1.3 储备液的制备试验体系是曝气3 d的自来水, pH7.4, 总有机碳 (TOC) 为1.6 mg·L-1, 水中Ti、Cu、Cd和Pb的质量浓度分别为0、60、70、9 ng·L-1 (ICP-MS)。取20 mg nC60溶于100 mL曝气3 d的自来水中, 连续超声24 h, 直至形成橙黄色液体, 然后配成200 mg·L-1的nC60储备液待用[15]。用曝气3 d的自来水稀释nC60储备液, 分别制备5、20、40 mg·L-1的nC60悬浮液待用, 现用现配。
1.4 实验方法 1.4.1 急性毒性实验配备浓度为0、1、5、10、20、40 mg·L-1的悬浮液200 mL, 在100 mL小烧杯中分别加入各个浓度悬浮液50 mL, 每个烧杯加入10头大型蚤 (蚤龄5 d)。每个浓度设置3个平行样, 静水放置72 h。大型蚤活动抑制和死亡的判断标准如下:反复转动烧杯, 15 s内失去活动能力即视为活动抑制; 将大型蚤在显微镜下观察, 心脏停止跳动即视为死亡。每24 h观察抑制数和死亡数[8]。另外, 分别在0、2、4、8、12、24、48、72 h时将1头蚤依次转入装有10 mL对应浓度的悬浮液的比色管中, 肉眼计数其在30 s内的跳跃次数, 每头蚤数2次, 共数5头, 求取平均跳跃频率[10]。在上述相同暴露时间下, 取3头蚤依次在光学显微镜下观察其心跳并拍摄视频, 计数其在30 s内的心跳次数, 计算平均心跳频率[10]。
1.4.2 慢性毒性实验实验单元为100 mL的烧杯内含50 mL的nC60水溶液。实验设置0、0.1、1.0 mg·L-1三个浓度处理组, 每个浓度组设置三个平行。每个实验单元包含10头7 d蚤龄的大型蚤, 每天计数新生小蚤的个数, 并将小蚤从实验单元分离后更换暴露液。大型蚤每天以斜生栅藻喂食, 并保证暴露液中藻细胞浓度为2×104个·mL-1, 持续记录21 d后, 计算每头成蚤21 d内的日均产蚤数。为确保水的质量, 每4 d对水的温度、溶解氧、pH、电导率和碱度进行监测。
1.5 数据分析采用EPA提供的专业软件Probit计算nC60对大型蚤的48 h和72 h的EC50和LC50, 采用SPSS对数据进行方差分析 (One Way ANOVA) 及Turkey's Test分析, P < 0.05表示有显著性差异。
2 结果与分析 2.1 急性毒性实验如图 1和图 2所示, 大型蚤的抑制数和死亡数随着nC60浓度的增加而增加, 对于蚤龄为5 d的大型蚤, nC60对其的48 h和72 h的EC50和LC50如表 1所示。与暴露48 h相比, nC60对大型蚤的72 h EC50和LC50值均显著降低, 表明暴露时间越长, nC60对大型蚤的毒性越强, 说明暴露时间对于评价污染物毒性具有关键性作用。
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| 图 1 nC60对大型蚤的活动抑制 Figure 1 Immobilization of D. magna after exposure to nC60 |
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| 图 2 nC60对大型蚤的致死率 Figure 2 Mortality of D. magna after exposure to nC60 |
如图 3所示, 单一浓度组在实验开始的阶段, 大型蚤的跳跃频率不断增加, 与暴露时间呈正相关; 但是随着暴露时间的延长, 大型蚤的跳跃频率逐渐降低, 游动变得迟缓。对于不同的浓度组, 大型蚤跳跃频率的变化趋势基本相同, 只是跳跃频率的峰值和达到峰值的时间有所不同:0、1、5、10、20、40 mg·L-1浓度组在实验结束时的跳跃频率分别为116、116、105、71、22、0次·min-1, 跳跃频率分别在暴露48、24、12、8、2、2 h达到峰值, 分别为124、154、156、152、152、142次·min-1。
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| 图 3 nC60对大型蚤跳跃频率影响 Figure 3 Effect of nC60 on hop frenquency of D.magna |
如图 4所示, 对于单一浓度组在实验开始的阶段, 大型蚤的心跳频率不断增加, 与暴露时间呈正相关; 但是随着暴露时间的延长, 大型蚤的心跳频率逐渐降低。对于不同的浓度组, 大型蚤跳跃频率的变化趋势基本相同, 但实验结束时的心跳频率、达到峰值的时间和峰值有所不同:0、1、5、10、20、40 mg·L-1浓度组的心跳频率分别在暴露48、12、8、8、4、4 h达到峰值, 分别为150、200、198、219、204、220次·min-1。
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| 图 4 nC60对大型蚤心跳频率影响 Figure 4 Effect of nC60 on heartbeat frenquency of D. magna |
如表 2所示, 大型蚤暴露于nC60 21 d后, 0.1 mg·L-1浓度组中大型蚤的总产蚤数下降, 1.0 mg·L-1浓度组中大型蚤的平均产蚤数和总产蚤数均显著下降, 且在暴露5 d后, 出现大型蚤死亡现象。21 d慢性实验表明, nC60在较低浓度下 (1 mg·L-1) 仍能对大型蚤产生明显毒性效应, 再一次说明暴露时间对评价毒物毒性的关键性。
本实验测定了自来水体系中TOC和几种主要有毒金属的含量, 结果表明其浓度都很低, 不会对大型蚤急性和慢性毒性实验产生影响。
急性毒性是评价污染物毒性的基本指标。本研究中nC60对蚤龄为5 d的大型蚤48 h的EC50和LC50分别为25.3 mg·L-1和28.5 mg·L-1, Tao等[9]和Zhu等[16]研究表明nC60对大型蚤48 h的LC50分别为0.4 mg·L-1和0.8 mg·L-1。实验结果的差异可能与大型蚤的蚤龄有关 (后者所用蚤均为蚤龄小于24 h的幼蚤), 也可能与储备液的制备方法有关。传统的急性毒性实验一般将暴露时间设置为48 h, 但由于nC60在大型蚤体内的高度累积, 本实验将暴露时间延长至72 h, 以探究nC60的毒性指标是否出现明显变化。实验结果显示其72 h的EC50和LC50都出现显著降低, 表明将暴露时间延长至72 h也许对评估nC60的毒性更有意义。慢性毒性是评价污染物长期毒性的指标。在本研究中, 1 mg·L-1浓度的nC60短时间内并未对大型蚤产生明显毒性效应, 但是21 d慢性实验表明nC60在较低浓度下 (1 mg·L-1) 仍能对大型蚤产生明显毒性效应。晏晓敏等[17]发现nC60在浓度低至0.5 mg·L-1时能显著降低大型蚤14 d暴露的孵化幼蚤数, 在种群水平对大型蚤产生影响。与传统的污染物相比, nC60的慢性毒性低于Ni和壬基苯酚, 但是高于两种主要树脂酸:脱氢乙酸和松香酸[18-20]。
其他人工纳米材料对大型蚤的毒性先前已有报道。朱小山等[21]研究发现单壁碳纳米管 (SWCNTs) 和多壁碳纳米管 (MWCNTs) 对大型蚤活动的48 h EC50值分别为1.3 mg·L-1和8.7 mg·L-1; 李轶等[22]实验表明纳米二氧化钛对大型蚤72 h LC50和EC50分别为22.7 mg·L-1和16.7 mg·L-1。毒性的大小可能与纳米材料的性质有关。
已有文献表明, nC60也会对其他水生模式生物产生急、慢性毒性。晏晓敏等[17]研究发现, nC60浓度达8 mg·L-1时尽管不影响青鳉 (Oryziaslatipes) 胚胎孵化率, 但增加孵化幼鱼的畸形率。朱小山等[21]研究表明nC60对斜生栅藻生长的96 h的EC50值为13.1 mg·L-1。本研究对nC60的水生生物毒性数据进行了一定补充。
nC60进入水体会发生团聚[23], 很容易被大型蚤吸入肠道内并难以排出体外[10], 据此我们推测nC60对肠道粘膜的物理损伤是使大型蚤致毒的主要原因之一。
由于动物的行为是联系生态过程和生物生理机能的纽带, 其对研究污染物的毒性效应具有重要意义。行为指标比死亡率对于评价污染物毒性更加敏感。对于大型蚤而言, 跳跃、心跳和摄食行为是几个易于观察的行为指标, 因此本文选择其二来评价nC60对大型蚤的毒性。Tao等[13]研究了nC60对大型蚤跳跃频率的影响, 其研究结果表明大型蚤的跳跃频率与暴露时间呈正相关。在本研究中, 实验初期的现象与Tao等研究基本一致, 但是随着暴露时间的延长, 大型蚤的跳跃频率逐渐降低, 游动变得迟缓。对这种实验现象的出现可以作出推测:大型蚤在摄入nC60的初始阶段, 由于纳米颗粒在大型蚤体内的累积使大型蚤做出应激行为, 表现为猛烈地跳动以排出体内的nC60颗粒; 但是随着时间延长, nC60的毒性作用显现, 大型蚤逐渐出现中毒症状, 活动变得迟钝。在本研究中, 心跳频率的变化趋势与跳跃频率的变化趋势一致。心跳在一定程度上反映机体的能量供给情况, 心跳频率的变化在一定程度上对跳跃频率的变化作出了解释。
4 结论(1) nC60暴露下大型蚤的跳跃和心跳活动会受到抑制, 浓度越高抑制越明显。
(2) nC60对大型蚤的48 h急性毒性指标EC50和LC50分别为25.3 mg·L-1和28.5 mg·L-1, 72 h的EC50和LC50分别为14.9 mg·L-1和16.3 mg·L-1。
(3) 在1 mg·L-1浓度下, nC60对大型蚤的繁殖产生影响, 具有明显慢性毒性。
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