姬松茸（Agaricus brasiliensis）又名巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇等，原产于巴西、秘鲁和美国等地，是一种珍贵的食药用菌。1992年，福建省农业科学院从日本引进姬松茸并栽培成功^[1]。经过30多年的发展，我国已经成为世界上姬松茸主要产地之一^[2]。姬松茸具有杏仁的香味，高蛋白、低脂肪，富含纤维素和矿物质元素，是一种营养价值丰富的食品^[3]。且随着研究的深入，研究人员发现姬松茸菌丝和子实体中含有多糖、核酸、类固醇、凝集素等多种活性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、抗突变、抗炎和抗氧化等多种药用功能^[4-5]。

姬松茸产业发展潜力巨大，但是其菌丝对镉有很强的富集能力，造成子实体中镉极易超标，危害食品安全及出口创汇。镉是毒性很强的重金属元素之一，可以蓄积于人的肾、肝等器官中，严重危害人类健康。据报道，姬松茸子实体中镉含量远远高于培养料镉含量，也远远高于其他重金属^[6-7]。子实体中镉含量超标已成为影响姬松茸产业健康发展的一个重要因素。研究表明，不同的姬松茸菌株对镉富集能力差异显著^[8-11]。所以筛选或者选育低富集镉的姬松茸菌株是解决姬松茸镉超标的有效方法之一。

本课题组前期以福建省农业科学院从日本引进的菌株J₁（福建省主栽品种之一）为出发菌株，利用辐射诱变技术选育到一株高产姬松茸新菌株J₇₇，其子实体中镉含量显著降低^[12]。本研究以添加外源镉的形式研究了不同浓度镉胁迫对J₁、J₇₇菌丝生长、产量的影响，J₁、J₇₇对镉的富集规律及差异。另据报道，真菌中半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸与镉的解毒密切相关^[13]，因此本研究还测定了不同浓度镉胁迫下J₁、J₇₇子实体中与镉富集密切相关的这3种氨基酸含量的变化规律。本研究为进一步深入研究菌株J₇₇低镉富集机制奠定基础，同时也为低富集镉姬松茸菌株选育提供依据。

本研究供试菌株为姬松茸菌株J₁与J₇₇，均保藏于福建农林大学国家菌草工程技术研究中心。

本试验分2个部分：（1）不同浓度镉对J₁、J₇₇菌丝生长的影响。在PDA优化固体培养基及液体培养基中加入一定浓度梯度的外源镉，使添加外源镉的浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、15、20、25、50 mg·L^-1，分别测定2个菌株在不同浓度镉胁迫下菌丝生长速度、菌丝鲜量、菌丝中镉含量，分析2个菌株对镉富集及耐受性差异；（2）不同浓度镉对J₁、J₇₇子实体生长发育的影响。在培养料中加入一定浓度梯度的外源镉，使添加外源镉的浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、15、20、25、50 mg·kg^-1，分别测定2个菌株在不同浓度镉胁迫下的产量、子实体中镉含量及与镉富集密切相关的半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸含量，分析2个菌株之间的差异。

PDA优化培养基：马铃薯230 g，蔗糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁0.5 g，维生素B1 10 mg，琼脂粉20 g，蒸馏水1 L，pH自然。

镉母液配制：称取2.031 4 g CdCl₂·2.5H₂O，溶于蒸馏水并定容于1 L容量瓶中，母液镉浓度为1 g·L^-1。

将镉母液替换部分PDA优化培养基中的水，配制成含有不同浓度镉的培养基（浓度见1.2），灭菌后无菌条件下倒于培养皿上。先将菌种接种于培养皿上，28 ℃培养，待菌落直径4~6 cm时，在同一直径的圆圈上用打孔器打出相同的菌丝块，接种于含有镉的培养皿上，28 ℃培养，采用平板划线法测定菌丝的生长速度^[14]，每个处理4个平行。

与平板处理相同，将不含琼脂PDA优化培养基与镉母液配制成不同镉浓度培养基，分装于三角瓶中，高压灭菌后接种，于28 ℃静置培养30 d，过滤称取菌丝鲜重，并测定菌丝中镉含量。

培养料配方：棉籽壳20%，玉米芯12.5%，牛粪35%，麸皮10%，稻草20%，CaCO₃ 1%，石灰1.5%。

栽培方法：采用熟料袋栽方式出菇。将配方中各种培养料混合均匀，按1:1.25的比例计算加水量，先按试验设计将不同镉母液加入到水中，再将水与培养料混合均匀；混合均匀的培养料分装到聚丙烯袋中，每袋装料0.8 kg，放入高压灭菌锅中，121 ℃灭菌2 h，接种后在26 ℃恒温培养室中培养，待菌丝走满袋后，移到栽培室，开袋覆土。每个菌株每个处理设20个重复。覆土后15 d左右即有菇蕾出现，出菇后统计不同浓度镉胁迫下2个菌株的产量，同时测定不同处理子实体中镉含量及半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸含量，计算镉的富集系数。

镉含量采用火焰原子吸收法进行测定^[15]，氨基酸含量采用《食品中氨基酸测定》（GB/T 5009.124—2003）方法进行^[16]。

采用SPSS 20.0对数据进行分析和处理，用T检验对2个菌株之间差异性进行分析。

随着外源添加镉浓度的增加，J₁和J₇₇菌丝生长速度均呈现先增加后减少的规律，与之对应的菌丝鲜重也呈现先增加后减少的趋势（图 1）。菌株J₁在添加外源镉浓度为1.5 mg·L^-1时菌丝生长速度最快，而J₇₇在添加外源镉浓度为2 mg·L^-1时菌丝生长速度最快；J₁在添加外源镉1 mg·L^-1时菌丝鲜重最大，J₇₇在添加外源镉2 mg·L^-1时菌丝鲜重最大。从菌丝中镉含量及镉富集系数来看（表 1）：随外源镉浓度的增加，J₁、J₇₇菌丝中镉含量均增加；J₁菌丝对镉富集系数在180~310之间，在外源镉为2 mg·L^-1时，富集系数最高；J₇₇菌丝对镉富集系数在113~193之间，在外源镉为25 mg·L^-1时，富集系数最高；相同外源镉浓度下J₁菌丝中镉含量高于J₇₇。

图 1镉对J1、J77菌丝生长的影响 Figure 1Effect of Cd in different concentration on mycelium growth rate of J1 and J77

图选项

表 1 不同浓度镉胁迫下J₁、J₇₇菌丝中镉含量及富集系数 Table 1 Effect of Cd in different concentration on Cd content and enrichment coefficient of J₁ and J₇₇ mycelium

表选项

在培养料中添加一定浓度梯度的镉，出菇后收集子实体，测定不同浓度镉对J₁、J₇₇产量的影响及子实体中镉的含量。产量统计结果表明（图 2）：随着外源镉浓度的增加，J₁和J₇₇产量均先增加后减少；且2个菌株均在1 mg·kg^-1时产量最高。子实体中镉含量检测表明（表 2）：随镉浓度的增加，J₁、J₇₇中镉含量逐渐增加，对镉富集系数逐渐减少；J₁对镉的富集系数为24~58，J₇₇对镉富集系数为19~45；在相同浓度下，J₁子实体中镉的浓度均高于J₇₇，且差异达到显著或极显著水平，J₇₇对镉富集显著降低。

图 2镉对J1、J77产量的影响 Figure 2Effect of Cd in different concentration on yields of J1 and J77

图选项

表 2 不同浓度镉胁迫下J₁、J₇₇子实体中镉含量及富集系数 Table 2 Effect of Cd in different concentration on Cd content and enrichment coefficient of J₁ and J₇₇ fruiting bodies

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对J₁、J₇₇菌丝和子实体中镉含量相关性进行分析，结果表明：J₁菌丝与子实体中镉含量相关系数为0.996，差异极显著；J₇₇菌丝与子实体中镉含量相关系数为0.971，差异极显著。此结果表明菌丝中镉含量与子实体中镉含量显著正相关，菌丝对镉的吸收能力影响子实体中的镉含量。

本研究测定了不同浓度镉胁迫下J₁、J₇₇子实体中半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸含量的变化。半胱氨酸检测结果表明（图 3）：随着外源镉浓度的增加，菌株J₁和J₇₇半胱氨酸的含量均表现为先减少后增加的规律；J₁中半胱氨酸含量变化幅度较小，J₇₇中半胱氨酸含量变化幅度较大，当外源镉浓度在25 mg·kg^-1以上时J₇₇中半胱氨酸含量急剧上升；在2 mg·kg^-1以下J₁中半胱氨酸含量大于J₇₇中的含量，且差异极显著；在15 mg·kg^-1以上时，J₇₇中半胱氨酸含量大于J₁中的含量，且差异极显著。

图 3镉对J1、J77子实体半胱氨酸含量的影响 Figure 3Effect of Cd in different concentration on Cys contents of J1 and J77 fruiting bodies

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甘氨酸检测结果表明（图 4）：不同外源镉处理下，J₁、J₇₇子实体甘氨酸含量变化较小；添加外源镉浓度在0.5~2.5 mg·kg^-1之间时，J₁中甘氨酸含量大于J₇₇中含量，而在5~50 mg·kg^-1之间，J₁、J₇₇子实体中甘氨酸含量无明显规律。

图 4镉对J1、J77子实体甘氨酸含量的影响 Figure 4Effect of Cd in different concentration on Gly contents of J1 and J77 fruiting bodies

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谷氨酸检测结果表明（图 5）：在相同浓度外源镉胁迫下，J₁、J₇₇子实体谷氨酸含量变化较小；0.5~2.5 mg·kg^-1之间，J₁中谷氨酸含量大于J₇₇中含量，而在5~50 mg·kg^-1之间，J₁、J₇₇子实体中甘氨酸含量无明显规律。进一步分析J₁、J₇₇子实体中甘氨酸与谷氨酸含量，发现二者变化规律一致。

图 5镉对J1、J77子实体谷氨酸含量的影响 Figure 5Effect of Cd in different concentration on Glu contents of J1 and J77 fruiting bodies

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姬松茸菌丝对镉有很强的富集能力，已经引起越来越多学者的关注，但是其机理还不甚清楚^[17]。本课题组前期以菌株J₁为出发菌株，经过⁶⁰Co-γ射线诱变，获得一株低富集镉的新菌株J₇₇。本研究在此基础上，采用添加外源镉的方法，进一步研究了J₁、J₇₇对镉吸收与耐受性的差异，并对两个菌株中与镉富集密切相关的氨基酸含量进行检测，初步揭示了J₇₇低富集镉的生理机制，为进一步深入研究分子机理奠定了基础。

随着镉浓度增加，J₁和J₇₇菌丝生长速度均表现为先增加后减少的趋势，表明低浓度的镉能够促进姬松茸菌丝生长，这与以前报道一致^[18]。在添加不同浓度外源镉处理下，J₇₇菌丝体与子实体中镉含量均低于J₁，表明J₇₇菌丝对镉吸收较少，导致菌丝及子实体中镉含量较低，J₇₇为低富集镉的菌株。从菌丝与子实体镉含量相关性分析结果来看，J₁和J₇₇菌丝与子实体中镉含量相关性均为极显著（97%以上），说明采用添加外源镉的形式液体培养菌丝可以作为初步筛选低镉姬松茸菌株的方法。

真菌中普遍存在对金属离子具有亲和能力的蛋白质（肽），称为金属硫蛋白（MT），可以结合进入细胞内的重金属离子，使其以不具有生物活性的无毒的螯合物形式存在，降低金属离子的活性，从而减轻金属离子对细胞的毒害作用。相关研究表明，在食用菌中的金属硫蛋白通常由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸等3种氨基酸组成^[19]。李开本等^[6]研究表明，巴西蘑菇子实体中谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸等构成富镉多肽的三种主要氨基酸含量均明显高于双孢蘑菇。江启沛^[19]分析姬松茸富镉的原因之一是细胞内特异的与Cd²⁺结合的谷氨酸含量高，并发现Cd²⁺结合蛋白的存在。江枝和等^[20]用灰色系统理论分析了姬松茸子实体中17种氨基酸含量与重金属镉含量的关系，结果表明：半胱氨酸含量与镉含量的关联系数最大，谷氨酸含量与金属镉含量两者关联系数最小^[20]。本研究结果表明，随着镉浓度增加，两个菌株中半胱氨酸含量呈明显规律性，且高浓度镉胁迫下，J₇₇中半胱氨酸显著增加，表明半胱氨酸可能对姬松茸解毒具有重要作用。

J₁、J₇₇菌株对镉富集具有明显差异性，J₇₇为低富集镉的菌株；菌丝中镉含量与子实体中镉含量显著正相关，采用菌丝液体培养的方法可以初步筛选低镉菌株；半胱氨酸的含量可能与姬松茸镉富集有关。