2017, Vol. 36文章信息
- 赵书晗, 王海娟, 王宏镔
- ZHAO Shu-han, WANG Hai-juan, WANG Hong-bin
- 砷胁迫下吲哚乙酸对不同砷富集能力植物光合作用的影响
- Effect of indoleacetic acid on photosynthesis of arsenic-stressed plants with different arsenic-accumulating ability
- 农业环境科学学报, 2017, 36(6): 1093-1101
- Journal of Agro-Environment Science, 2017, 36(6): 1093-1101
- http://dx.doi.org/10.11654/jaes.2017-0092
文章历史
- 收稿日期: 2017-01-17
砷不是植物生长所必需的元素，但许多植物可将其从根转移到地上部，通过干扰植物重要的生理过程而对植物生长发育产生影响。自从Ma等[1]和Chen等[2]发现蜈蚣草（Pteris vittata）能超富集砷以来，超富集植物的理论和应用研究成为国内外关注的热点。但是，超富集植物叶片在富集重金属的同时，如何保持光合作用以完成正常的生长发育，是一个必须加以深入研究的科学问题。
植物的光合作用经常受到各种逆境的干扰，例如砷胁迫会导致植物叶片光合色素含量下降和细胞超微结构的改变[3]。叶绿素荧光动力学方法可以简捷、灵敏、无损伤探测各种逆境条件对植物光合作用的影响。Wang等[4]研究发现，在高浓度砷胁迫下，地瓜藤（Ficus tikoua）叶片的光系统Ⅱ（PSⅡ）潜在活性（Fv/F0）、最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSII）和光化学淬灭系数（qP）显著下降，非光化学淬灭系数（qN）显著增加。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBPC）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是卡尔文循环中重要的调节酶，研究发现，砷超富集植物大叶井口边草（Pteris cretica var. nervosa）和蜈蚣草（P. vittata）在高浓度砷（200 mg·kg-1）胁迫下GAPDH依然保持较高活性，但非超富集植物半边旗（Pteris semipinnata）和剑叶凤尾蕨（Pteris ensiformis）在低浓度砷（50 mg·kg-1）胁迫时GAPDH活性便明显受到抑制。随着砷胁迫浓度增加，RuBPC活性在砷超富集或非超富集植物中均未发生明显抑制[5]。红萍（Azolla filliculoides）的叶绿体超微结构则随砷浓度增加受害严重，在高浓度砷处理时，其叶绿体变形，类囊体杂乱无章并解体[6]。
植物激素在很低浓度下就表现出对植物生长发育的调节作用，许多植物激素不但有助于植物生长，而且还可促进植物对重金属的吸收并提高耐受性[7]。玉米叶片喷施吲哚乙酸（IAA）后，植物生长和干重显著增加，同时对铅的吸收和转运能力也显著增强[8]。此外，IAA对植物光合作用也有一定的促进作用。晚秋草莓叶面喷施IAA后显著提高了叶片净光合速率和叶绿素含量，同时显著增加了植物茎和根的干重[9]。可见重金属对植物生长和光合作用虽有一定的抑制，但外源IAA不仅可以促进植物的生长和光合作用，还能促进植物富集重金属。然而，在砷胁迫下外源IAA如何调节植物的光合作用，目前文献报道尚少。
本研究以砷超富集植物大叶井口边草（P. cretica var. nervosa）和同属的非超富集植物剑叶凤尾蕨（P. ensiformis）为实验材料，通过室内水培实验，在2 mg·L-1砷（Ⅴ）胁迫下，添加不同浓度梯度IAA（0、10、20、40 mg·L-1），对比研究2种植物株高、生物量、叶片砷含量、光合色素（叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素）、叶绿素荧光参数（Fv/Fm、ΦPSII、qP和qN）、暗反应酶活性（RuBPC和GAPDH）以及叶绿体超微结构的变化，旨在为进一步研究重金属胁迫下生长素对植物光合作用的影响机理提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 供试植物供试植物为砷超富集植物大叶井口边草和同属非砷超富集植物剑叶凤尾蕨。先在野外无污染地区采集2种植物幼苗，带回温室后进行修剪，种植在清洁土壤中进行适应性培养，2个月后筛选出长势良好、大小一致的健康植株进行水培实验。
1.2 植物培养采用室内水培法，首先对选取的植物进行适应性水培驯化。水培溶液为1/2改进的Hoagland配方营养液，适应性水培结束后，将植物移栽到容积为2.5 L的塑料小桶中，培养液含有1/10的Hoagland营养液和不同浓度的IAA。经过文献查阅与预实验结果确定砷（Ⅴ）浓度为2 mg·L-1，以砷酸钠（Na2HAsO4·7H2O）的形式添加，砷离子浓度以纯砷计。生长素浓度设定为对照（0 mg·L-1）、低（10 mg·L-1）、中（20 mg·L-1）和高（40 mg·L-1）4个浓度梯度。每一处理重复3次，每3 d更换一次营养液，连续充氧。培养实验在温室自然光照下完成，室温20~25 ℃，植物在培养14 d后收获。
1.3 样品处理与测定植物收获后，先用自来水清洗，用滤纸吸干植物表面水分，测定株高。将植物分为两部分：一部分用1%盐酸浸泡10 min以去除植物表面附着的砷，然后再用自来水和超纯水反复冲洗干净，于烘箱105 ℃杀青30 min，在70 ℃下烘干至恒重，用于植株干重和砷含量的测定；另一部分先用超纯水冲洗干净，再用滤纸吸干植物表面水分，装入自封袋，放入冰箱中，-18 ℃保存备用。
植物叶片砷含量的测定方法：称取0.2 g左右烘干样品，用HNO3-H2O2（5:1，V/V）加热消化，测定砷含量前待测液加入60 g·L-1的硫脲和抗坏血酸混合液还原至少30 min，并用5% HCl按一定稀释倍数进行定容。运用原子荧光光谱仪（北京瑞利仪器公司，AF-610D）测定植物砷含量。测定砷的工作曲线为：
式中：y为荧光强度；x为标样砷浓度，μg·L-1。
砷的加标回收率为93%~98%，符合砷含量测定质量控制要求。
光合色素的测定采用95%乙醇提取-分光光度法[10]；叶绿素荧光参数的测定参照Burzyński等[11]方法，选择外界光强一致的时间，每盆选取同一叶位的功能叶（从上向下第4片完全展开的健康叶片），用超便携式调制叶绿素荧光仪（Mini-PAM，Walz，德国）测定Fv/Fm、ΦPSII、qP、qN等叶绿素荧光参数；暗反应酶活性的测定参照Wang等[5]的方法。
叶绿体超微结构的观察采用透射电镜法。首先植物叶片用3.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，酒精、丙酮逐级梯度脱水，环氧树脂618渗透、包埋，半薄切片，光镜定位，修块，然后用Leica-R型超薄切片机切片，柠檬酸铅-醋酸铀双染色，最后用JEM-1011透射电镜观察。
1.4 数据处理数据先用Microsoft Excel 2013进行简单处理，再用SPSS 20软件进行单因素或双因素方差分析，并用Tukey法进行多重比较。显著性差异水平取0.05，极显著差异水平取0.01。用Origin 9.0软件绘图。
2 结果与分析 2.1 砷胁迫下IAA对植物生长的影响砷胁迫下，不同浓度梯度的IAA处理后，砷超富集植物大叶井口边草的株高与对照（0 mg·L-1 IAA）相比无显著差异（P>0.05）；非超富集植物剑叶凤尾蕨在20 mg·L-1 IAA处理下株高显著增加（P < 0.05），但在10、40 mg·L-1 IAA处理下株高与对照无显著差异（图 1A）。
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| 图中小写字母表示同一植物在砷胁迫下，不同IAA处理浓度之间的显著性差异程度：字母相同表示差异不显著（P>0.05），字母不同表示差异显著（P < 0.05）。下同 The same letters indicate insignificant difference (P>0.05), and different letters indicate a significant difference (P < 0.05) in plant height or dry weight among different IAA concentration in the same plant species. The same below 图 1砷胁迫下不同浓度IAA对植物生长的影响 Figure 1Effect of IAA concentration on plant growth under As (Ⅴ)stress |
在20 mg·L-1 IAA处理下，与对照相比，2种植物的干重均显著增加，在10、40 mg·L-1 IAA处理下，2种植物干重与对照相比无显著差异（图 1B）。双因素方差分析表明，植物种类之间、IAA浓度之间对植物株高和干重均有极显著影响（P < 0.01，图 1）。
2.2 砷胁迫下IAA对植物叶片砷吸收的影响由表 1可知，与对照相比，10、20 mg·L-1 IAA处理使砷胁迫下大叶井口边草叶片中的砷含量分别显著增加56.70%和69.63%，但40 mg·L-1 IAA处理下，叶片中砷含量与对照相比无显著变化。在20 mg·L-1 IAA处理下，剑叶凤尾蕨叶片砷含量显著增加7.83%，其他处理则与对照无显著差异。在各浓度梯度的IAA处理下，大叶井口边草叶片砷含量均显著高于剑叶凤尾蕨。
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由表 2可知，砷胁迫下，20 mg·L-1 IAA处理使大叶井口边草叶片的光合色素含量与对照相比无显著差异，10、40 mg·L-1 IAA处理则显著下降（除10 mg·L-1 IAA处理下类胡萝卜素无显著变化外）。剑叶凤尾蕨叶片中光合色素含量在20、40 mg·L-1 IAA处理下显著下降，在10 mg·L-1 IAA处理下则与对照相比无显著差异。大叶井口边草叶片叶绿素a/b值随IAA浓度增加无显著变化，而剑叶凤尾蕨在40 mg·L-1 IAA处理时与对照相比显著下降。
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砷胁迫下，随IAA浓度增加，大叶井口边草叶片Fv/Fm和ΦPSII与对照相比无显著差异，剑叶凤尾蕨叶片在20 mg·L-1 IAA处理时则显著下降（图 2A，图 2B）。除20 mg·L-1 IAA处理与对照无显著差异外，10、40 mg·L-1 IAA处理时大叶井口边草叶片qP与对照相比显著增加，但剑叶凤尾蕨在所有IAA处理浓度下qP均显著下降（图 2C）。随IAA浓度增加，大叶井口边草叶片qN与对照相比无显著差异，剑叶凤尾蕨在10 mg·L-1 IAA处理时叶片qN与对照相比无显著差异，而在20、40 mg·L-1 IAA处理下，qN则显著下降（图 2D）。双因素方差分析表明，植物种类之间、IAA浓度之间和两者交互作用对Fv/Fm和qN有极显著影响（P < 0.01），但植物种类对ΦPSII和qP影响不显著（P>0.05）。
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| 图 2砷（Ⅴ）胁迫下IAA对植物叶片中叶绿素荧光参数的影响 Figure 2Effect of IAA on chlorophyll fluorescence parameters in fronds of plants under As (Ⅴ)stress |
砷胁迫下，与对照相比，大叶井口边草叶片中的RuBPC活性在10 mg·L-1 IAA处理时显著下降，在20 mg·L-1 IAA处理时则显著增加，后又维持在对照水平；剑叶凤尾蕨叶片中的RuBPC活性随IAA浓度增加呈显著下降趋势（图 3A）。
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| 图 3砷（Ⅴ）胁迫下IAA对暗反应酶活性的影响 Figure 3Effect of IAA on the activities of two dark reaction enzymes under As (Ⅴ)stress |
砷胁迫下，10~20 mg·L-1 IAA处理时大叶井口边草叶片GAPDH活性与对照相比呈显著增加趋势，并在20 mg·L-1 IAA处理时达到最大值，后在40 mg·L-1 IAA处理时显著下降，但与对照无显著差异。剑叶凤尾蕨在10~40 mg·L-1 IAA处理下呈先增后减的趋势，在10 mg·L-1 IAA处理时达到最大值，后开始下降，但20 mg·L-1 IAA处理时仍显著高于对照，至40 mg·L-1时与对照持平（图 3B）。双因素方差分析表明，植物种类之间、IAA浓度之间以及两者交互作用对植物2种暗反应酶活性均有极显著影响（P < 0.01）。
2.6 砷胁迫下IAA对植物叶绿体超微结构的影响叶绿体超微结构显示，大叶井口边草在单一砷胁迫下对叶绿体无明显影响，叶绿体呈椭圆形或梭形，双膜结构完整，基粒和基质片层排列整齐，具有典型的健康叶绿体结构特征（图 4a）；在10 mg·L-1 IAA处理下，叶绿体膜系统发生变化，细胞收缩，质壁分离，基粒数量减少，基粒类囊体变薄并且排列松散，淀粉粒和嗜锇颗粒出现（图 4b）；在20 mg·L-1 IAA处理下，叶绿体结构与对照相似，仅出现淀粉粒和少量嗜锇颗粒（图 4c）；在40 mg·L-1 IAA处理下，叶绿体数量减少，双层膜边界模糊，大部分叶绿体肿胀，基粒排列紊乱，基粒类囊体肿胀扭曲，并有嗜锇颗粒出现（图 4d）。
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| a~d：大叶井口边草。e~h：剑叶凤尾蕨。a，e：As 2 mg·L-1+IAA 0 mg·L-1；b，f：As 2 mg·L-1+IAA 10 mg·L-1；c，g：As 2 mg·L-1+IAA 20 mg·L-1；d，h：As 2 mg·L-1+IAA 40 mg·L-1。GR：基粒Grana；GT：基粒类囊体Grana thylakoid；SG：淀粉粒Starch grains；OS：嗜锇颗粒Osmiophilic particles；CH：叶绿体Chloroplast 图 4砷（Ⅴ）胁迫下IAA对叶绿体超微结构的影响 Figure 4Effect of IAA on chloroplast ultrastructure of plants under As (Ⅴ)stress |
剑叶凤尾蕨在单一砷胁迫下叶绿体就受到伤害，呈圆形，双层膜边界模糊，基粒类囊体小且少，排列杂乱无章，淀粉粒大且多，少量嗜锇颗粒出现（图 4e）；在10 mg·L-1 IAA处理下，叶绿体肿胀，比对照稍好，但基粒类囊体结构发生改变，出现融合现象（图 4f）；在20 mg·L-1 IAA处理下，叶绿体双层膜结构几乎消失，基粒类囊体甚少，也出现融合现象，有少量嗜锇颗粒（图 4g）；在40 mg·L-1 IAA处理下，叶绿体双层膜结构消失，基粒类囊体也几乎消失，出现的基粒也很模糊，有淀粉粒出现，嗜锇颗粒增多（图 4h）。
3 讨论砷会扰乱植物形态学特征，并改变一些生理生化过程[12]。胡拥军等[13]发现在砷胁迫下，砷超富集植物大叶井口边草内源IAA和砷含量均上升。IAA通过促进细胞的分裂分化，进而促使植物生长[14]。本研究发现在砷胁迫下，20 mg·L-1 IAA处理使2种不同砷富集能力植物的生物量和叶片砷含量均显著增加，其他报道也证实IAA具有减轻胁迫的作用。例如，在超富集和非超富集2种生态型的东南景天（Sedum alfredii）中，IAA处理显著增加了铅在地上部的积累，并且超富集生态型植物的累积量是非超富集生态型植物的2.7倍[15]。F?覿ssler等[16]报道，10-10 mol·L-1 IAA处理有效增加了向日葵根和地上部的生长，同时叶片中铅和锌含量显著增加。然而，并不是在某个部位、组织或结构中的生长素含量越多，对植物生长和吸收重金属就越有利，因为生长素过量会破坏植物细胞的膜结构[17]。适当浓度的IAA通过增加地上部和根系生长，提高植物生物量，从而促进更多重金属累积。
砷会影响植物的光合作用，最终导致植物生长发育的改变。光合作用受到抑制表现在叶绿素含量降低和叶片PSⅡ的损害[18]。砷进入植物体后，能取代叶绿素分子中的镁离子，干扰叶绿素合成酶的活性，导致叶绿素合成受阻，同时增加叶绿素分解酶的活性，使叶绿素分解加快[19]。本研究中，10~40 mg·L-1 IAA处理下，大叶井口边草叶片叶绿素a/b值无显著变化，而剑叶凤尾蕨叶绿素a/b值在40 mg·L-1 IAA处理时显著下降，并且在单一砷胁迫下（不添加IAA），超富集植物大叶井口边草a/b值高于非超富集植物剑叶凤尾蕨。较高的叶绿素a/b值与光合器官的色素成分改变有关，这种改变使其具有较低的捕光叶绿素蛋白，而捕光叶绿素蛋白减少被认为是叶绿体面对不利条件下的一种适应性防御机制[20]，因此外源添加IAA使大叶井口边草光合器官产生了防御功能。大量研究表明，外源添加生长素可以促进植物的光合作用。Aldesuquy[21]发现在25 mg·kg-1 IAA处理下，小麦旗叶生长、鲜重、干重和叶面积均增加，这种刺激效应主要是由于IAA增加了色素形成，进而增加了旗叶光合活性；在高剂量50 mg·kg-1 IAA处理下，旗叶的生长和光合活性减弱，抑制叶片鲜重、干重、叶面积、色素、糖、蛋白质形成以及CO2同化作用。本研究中，砷胁迫下，在20 mg·L-1 IAA处理时，大叶井口边草叶片光合色素含量与对照相比无显著差异，而剑叶凤尾蕨叶片光合色素含量显著下降，表明IAA在促进大叶井口边草叶片富集大量砷的同时对色素的形成有一定的保护作用；在40 mg·L-1 IAA处理下，两种植物光合色素均显著减少，表明高剂量IAA对光合作用反而产生抑制。
叶绿素荧光参数可以用来监测PSⅡ的性能。本研究中，10~40 mg·L-1 IAA处理下，大叶井口边草叶片Fv/Fm和ΦPSII均无显著变化，而剑叶凤尾蕨在20 mg·L-1 IAA处理下则显著下降。Fv/ Fm和ΦPSII减少表示PSⅡ的光活化受到砷毒性抑制，这是天线色素受到破坏以及电子从PSⅡ到PSⅠ传递的局部阻塞限制了PSⅡ初始“稳定”电子受体（QA）的再次氧化[22]。因此外源添加IAA对大叶井口边草PSⅡ具有保护作用。虽然大叶井口边草Fv/Fm与对照相比无显著变化，但Araus等[23]认为，类囊体膜肿胀或破坏后，即使Fv/Fm变化很小或无变化，叶片的结构状态也会对原初始荧光参数产生影响。本研究中，10~40 mg·L-1 IAA处理下，大叶井口边草qP呈增加趋势，qN无显著变化，而剑叶凤尾蕨qP和qN均显著下降，并且不添加IAA时，超富集植物大叶井口边草qN高于非超富集植物剑叶凤尾蕨。外源添加IAA使大叶井口边草叶片PSⅡ电子传递活性增加，并且PSⅡ天线系统充分利用非光化学淬灭机制将吸收的过量光能以热形式耗散掉。这也是一种光合机构的自我保护机制。
大叶井口边草叶片中的RuBPC活性在20 mg·L-1 IAA处理下显著增加，随后虽然有所降低，但依然与对照持平，而剑叶凤尾蕨随IAA浓度增加则呈下降趋势。RuBPC的活性位点位于镁离子周围，而砷进入植物体内会取代镁离子，使剑叶凤尾蕨叶片RuBPC活性降低。C3植物在重金属胁迫下为了维持或恢复RuBPC活性，会更高效地利用三磷酸腺苷（ATP）[24]，而大叶井口边草保持较高的RuBPC活性，可能是IAA提高了其对ATP的利用效率或是抑制了砷对镁离子的取代。此外，2种植物叶片中的GAPDH活性在10~20 mg·L-1 IAA处理时与对照相比显著增加，后虽有所下降，但仍维持在对照水平。不同的是大叶井口边草叶片中GAPDH活性最大值出现在20 mg·L-1 IAA处理下，而剑叶凤尾蕨则出现在10 mg·L-1 IAA处理下，说明2种植物的GAPDH活性对IAA的敏感度有所差异。Wang等[5]发现土培条件下，超富集植物在高浓度砷（200 mg·kg-1）处理下，其叶片中的GAPDH活性依然维持在较高水平，而非超富集植物叶片中的GAPDH活性即使在低浓度砷（50 mg·kg-1）处理下也会受到抑制。因此，外源添加IAA有助于GAPDH活性的增加，进而提高植物对非生物胁迫的耐受能力。
叶绿体是植物进行光合作用的场所。植物对砷的敏感性和毒性不仅受到污染物浓度和类型的影响，也与生长阶段或生物过程有关。Li等[25]研究发现，在砷浓度高达800 mg·kg-1时，对蜈蚣草幼嫩羽片叶绿体超微结构未造成明显影响，而成熟羽片叶绿体膜系统则发生肿胀。研究发现，IAA可能通过增加小麦旗叶质体的生物合成，随后增加前质体数量或是新的叶绿体发育直接影响光合作用[26]。本研究中，不添加IAA时，超富集植物大叶井口边草叶绿体超微结构和功能完好，而非超富集植物剑叶凤尾蕨叶绿体超微结构和功能受损严重；在20 mg·L-1 IAA处理下，大叶井口边草叶绿体超微结构和功能保持完好，与对照相似，在10、40 mg·L-1 IAA处理下，大叶井口边草叶绿体超微结构和功能有所损害，原因可能是在低浓度10 mg·L-1 IAA处理下，大叶井口边草叶片中砷含量显著增加，但较低浓度的IAA尚未将植物体的解毒机制发挥至最佳状态。He等[27]在2 mg·L-1砷（Ⅴ）胁迫下对大叶井口边草添加不同浓度IAA（10~50 mg·L-1）研究表明，在10 mg·L-1 IAA处理下，仅超氧化物歧化酶（SOD）活性比对照显著上升，而过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）均无显著变化；在40 mg·L-1 IAA处理下，可能由于IAA浓度过高，超过了植物对其耐受范围，损害了植物细胞；而20 mg·L-1 IAA处理下植物最为适应，有效缓解了砷对植物超微结构的损害，发挥了保护作用。从叶绿素荧光参数看，尽管10、40 mg·L-1 IAA处理下大叶井口边草的qN值与对照相比无统计学差异（图 2d），但有下降的趋势。有研究表明，qN下降的同时，叶绿体超微结构也受到了损害[28]。同理，非超富集植物剑叶凤尾蕨在20~40 mg·L-1 IAA处理下，在叶绿体超微结构和功能受损严重的同时，qN也显著降低。因此，适当浓度IAA对砷胁迫下大叶井口边草叶片叶绿体结构具有保护作用，类囊体结构的完整性和有序性对于叶绿体在光合作用中进行正常而有效的光能转换是非常必要的[29]。
4 结论（1）20 mg·L-1 IAA处理下，2种不同砷富集能力植物的生物量和叶片砷含量显著增加，并且大叶井口边草叶片砷含量显著高于剑叶凤尾蕨。
（2）砷胁迫下，添加20 mg·L-1 IAA，砷超富集植物大叶井口边草在富集大量砷的同时光合色素含量、叶绿素a/b值、叶绿素荧光参数与对照相比无显著变化，并且RuBPC活性显著增加。这些特征可能是大叶井口边草富集和耐受As的关键所在。非超富集植物剑叶凤尾蕨除叶绿素a/b值与对照相比无显著变化外，其他指标却显著降低。
（3）从叶绿体超微结构看，超富集植物大叶井口边草在单一砷胁迫下依然保持叶绿体结构和功能的完整性，尤其在添加20 mg·L-1 IAA时，虽然叶片富集了大量砷，但叶绿体超微结构并未受到明显影响，与对照相似；而非超富集植物剑叶凤尾蕨叶绿体超微结构则在单一砷胁迫和添加IAA后均受害严重。
致谢 衷心感谢美国麻省大学Saikat Ghosh博士协助修改润色英文摘要。| [1] | Ma L Q, Komar K M, Tu C, et al. A fern that hyperaccumulates arsenic[J]. Nature, 2001, 409(6820): 579. DOI:10.1038/35054664 |
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