磷是植物生长发育三大营养元素之一，植物所需的磷素主要来自土壤中的无机磷^[1]。无机磷可占到农田土壤全磷含量的60%~80%^[2]，其含量及有效性受作物生理活动的影响^[3]。土壤中无机磷的形态较多，不同磷效率作物对不同形态无机磷的活化吸收效率也不同^[4]。相比于常规作物品种，磷高效转基因作物可从土壤中吸收较多的磷素，从而满足自身生长发育^[5]。

磷高效转基因水稻OsPT4是将磷酸盐转运蛋白Pht1家族成员OsPT4基因导入日本晴获得的超表达材料，其在水培条件下正常供磷时，根部全磷含量平均增加10%~20%，地上部平均增加36%~50%^[6]，盆栽试验表明磷高效转基因水稻OsPT4的单株总磷积累量高于亲本水稻日本晴4.01%^[7]。有研究表明磷高效基因型小麦CD1158-7也具有较高的磷素吸收和累积能力，对难溶性无机磷Ca-P、Al-P和活性有机磷的活化吸收能力强于磷低效基因型，二者的根际土壤磷组分特征存在显著差异^[4]。于崧^[8]利用盐碱土种植耐盐碱转甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）大豆，发现转基因大豆无机磷、有效磷含量在花期均显著高于非转基因亲本黑农35。由此推断，磷高效转基因水稻也可能影响到土壤中不同无机磷形态的转化平衡及生物有效性。

目前，有关养分高效转基因作物生态安全的研究报道较少，磷高效转基因水稻对土壤磷形态的影响更是不得而知。本研究采用小区试验探讨了磷高效转基因水稻OsPT4和磷高效突变水稻PHO2及非转基因亲本日本晴在分蘖期、孕穗期、灌浆期和成熟期土壤不同形态无机磷含量的差异特征，分析了磷高效转基因水稻OsPT4在施磷和不施磷条件下对土壤中不同形态无机磷含量的影响，以期为磷高效转基因水稻的土壤养分安全风险评估提供理论依据和技术支撑。

供试水稻品种：磷高效转基因水稻OsPT4、磷高效突变体水稻PHO2及其非转基因亲本水稻日本晴（Nipponbare），均由南京农业大学资源与环境学院植物营养分子生物学实验室提供。

试验在农业部环境保护科研监测所网室内进行。种植小区为混凝土结构，内部长、宽、高均为1 m，土壤采自天津市津南区未种植过作物的荒地。供试土壤部分理化性质如下：pH 8.21，有机质24.55 g·kg^-1，全氮0.96 g·kg^-1，全磷1.19 g·kg^-1。

水稻种子于2014年5月20日播种在育秧苗盘，7月1日移苗至1 m²水泥池，每池30株。每个品种设不施磷和施磷15 g·m^-2两种处理（磷源为KH₂PO₄），每个处理5次重复。施用氮肥20 g·m^-2，氮源为尿素；钾肥18 g·m^-2，钾源为硫酸钾。氮肥50%用作基肥，50%用作追肥，磷、钾肥全部作基肥施用。在水稻分蘖期（TS）、孕穗期（BS）、灌浆期（FS）和成熟期（MS）采集土样。用取土器紧贴水稻根部采集土壤，每个小区取样3点，混合后风干，将土块砸碎，去除石块后分成两份：一份研磨过100目筛，用于土壤全磷、无机磷组分含量测定；一份研磨过20目筛，用于土壤有效磷含量测定。

土壤全磷：H₂SO₄-H₂O₂消煮，钼锑抗比色法测定^[9]。

土壤有效磷：0.5 mol·L^-1 NaHCO₃提取，钼锑抗比色法测定^[9]。

土壤无机磷组分：0.25 mol·L^-1 NaHCO₃浸提Ca₂-P；继而0.5 mol·L^-1 CH₃COONH₄浸提Ca₈-P；用0.5 mol·L^-1 NH₄F浸提Al-P；0.1 mol·L^-1 NaOH+0.1 mol·L^-1 1/2 Na₂CO₃浸提Fe-P；用0.3 mol·L^-1 Na₃C₆H₅O₇·2H₂O+Na₂S₂O₄浸提O-P；用0.25 mol·L^-1 H₂SO₄浸提Ca₁₀-P。均采用钼锑抗比色法测定^[9]。

所有数据用Excel 2010软件进行统计分析及柱状图的绘制。试验检测数据采用SPSS 17.0统计软件进行差异显著性分析，采用完全随机设计的单因素方差分析法（One-way ANOVA），多个均值间的差异性比较采用Duncan新复极差法。柱状图中用正偏差误差线表示标准误差。

在施磷和不施磷条件下，PHO2、OsPT4、日本晴3种水稻土壤全磷含量均表现为分蘖期>孕穗期>灌浆期>成熟期，同一水稻品种土壤全磷含量在灌浆期、成熟期均显著低于分蘖期，同一生长期的3种水稻土壤全磷含量无显著差异（图 1）。

图中不同小写字母表示同一施磷处理下同一生育期不同水稻品种间差异显著性（P < 0.05）。下同 Different letters mean the different significances(P < 0.05) among different rices under the same P application treatment at the same growth stage. The same below 图 1 不同生育期水稻土壤全磷含量 Figure 1 Total phosphorus content in soils of rice plants at different growth stages

图选项

两种施肥处理下，3种水稻土壤有效磷含量均随生长期的推进而下降，PHO2、OsPT4土壤有效磷含量低于日本晴。不施磷时，OsPT4土壤有效磷含量在孕穗期、成熟期显著低于日本晴；施磷时，OsPT4土壤有效磷含量在灌浆期、成熟期显著低于日本晴。PHO2土壤有效磷含量在两种施肥处理下均显著低于同一生长期的日本晴（图 2）。

图 2 不同生育期水稻土壤有效磷含量 Figure 2 Available phosphorus content in soils of rice plants at different growth stages

图选项

不施磷时，OsPT4土壤无机磷总量仅在灌浆期显著低于日本晴，其余生育期与日本晴无显著差异；施磷时，OsPT4土壤无机磷总量在成熟期显著低于日本晴，其余生育期虽低于日本晴，但差异不显著。在施磷和不施磷条件下，PHO2土壤无机磷总量在4个生育期均显著低于日本晴（图 3）。

图 3 不同生育期水稻土壤无机磷总量 Figure 3 Inorganic phosphorus content in soils of rice plants at different growth stages

图选项

在施磷和不施磷条件下，3种水稻在4个生育时期土壤无机磷各组分浓度一致表现为O-P>Ca₁₀-P>Ca₈-P>Al-P>Fe-P>Ca₂-P，各形态无机磷组成百分比最高的是O-P和Ca₁₀-P，均达到40%左右，占比最小的磷形态是Ca₂-P，仅为2%左右（图 4）。

图 4 不同生育期水稻土壤不同形态无机磷含量 Figure 4 Inorganic phosphorus fractions in soils of rice plants at different growth stages

图选项

3种水稻土壤Ca₂-P含量与全磷、有效磷、无机磷含量的变化趋势一致，即在两种施肥处理下均随水稻生长期的推进而下降（图 4A）。不施磷时，OsPT4土壤Ca₂-P含量在灌浆期、成熟期显著低于日本晴，在分蘖期、孕穗期与日本晴无显著差异；施磷时，OsPT4土壤Ca₂-P含量在孕穗期显著低于日本晴，其他生长期则与日本晴无显著差异。

在两种施肥处理下，OsPT4土壤Ca₈-P含量在孕穗期、灌浆期、成熟期低于日本晴，在分蘖期高于日本晴；在分蘖期、孕穗期差异不显著，在灌浆期、成熟期差异显著；PHO2土壤Ca₈-P含量在孕穗期、灌浆期、成熟期均显著低于日本晴（图 4B）。

在施磷和不施磷条件下，3种水稻土壤Al-P含量均随水稻生长期的推进先上升再下降；OsPT4土壤的Al-P含量在灌浆期、成熟期显著低于日本晴，在分蘖期、孕穗期差异不显著；同一生长期的PHO2土壤Al-P含量均显著低于日本晴（图 4C）。

OsPT4土壤Fe-P含量在两种施肥处理下均低于日本晴。不施磷时，OsPT4土壤Fe-P含量在孕穗期、成熟期显著低于日本晴；施磷时，OsPT4土壤Fe-P含量在灌浆期、成熟期显著低于日本晴（图 4D）。

不施磷条件下，OsPT4土壤O-P含量在灌浆期显著低于日本晴，在分蘖期、孕穗期、成熟期与日本晴没有显著差异；施磷条件下，4个生长期OsPT4的土壤O-P含量与日本晴均无显著差异（图 4E）。

3种水稻土壤Ca₁₀-P含量在两种施肥条件下均随着生长期的推进先下降再上升、随后又下降，4个生长期OsPT4的土壤Ca₁₀-P含量与日本晴均无显著差异（图 4F）。

转基因作物的环境释放效应可能威胁到土壤生态系统的稳定，对土壤养分的释放和有效性等产生影响^[10]。土壤全磷含量反映土壤磷库大小，作物对土壤磷素的吸收利用与土壤全磷下降关系密切^[11]。郑加为等^[12]发现转植酸酶基因（phyA2）玉米根际土壤全磷含量与非转基因亲本蠡玉35相比没有显著差异，吴凡等^[13]发现转酸性磷酸酶基因（AtPAP15）大豆对土壤全磷含量产生的影响与受体相比没有实质性的差别，本试验也发现同一生长期的PHO2、OsPT4与日本晴土壤全磷含量相比均没有显著差异。磷高效基因型水稻PHO2、OsPT4虽然对土壤磷素高效吸收，但与对照相比，在短期内可能不会对土壤磷库产生显著影响。

土壤有效磷含量反映土壤供磷水平^[14]。吴凡等^[13]发现转酸性磷酸酶基因大豆对土壤有效磷含量没有显著影响，侯文通等^[15]利用水稻土对转植酸酶基因（phyA2）玉米根际土壤有效磷含量的研究也未发现其与阴性对照有显著差异。但本研究发现OsPT4的土壤有效磷含量在个别生育期，尤其是成熟期显著低于日本晴，与上述研究有明显的不同。这可能是由于转酸性磷酸酶基因大豆通过增强酸性磷酸酶活性来提高对土壤中有机磷的活化利用^[16]，未对转基因大豆根际土壤有效磷含量产生显著影响。转植酸酶基因玉米的单株磷积累量显著高于对照，其根系大量分泌植酸酶，催化土壤中部分有机磷分解为有效磷，增加了对有机磷的利用，减缓了根际土壤有效磷的亏缺，导致转基因植株根际土壤有效磷含量与对照相比无显著差异^[15]。OsPT4基因超量表达可编码大量原生质膜上的磷转运蛋白^[17]，从而加强植株对土壤中磷酸根离子直接高效的吸收利用，导致土壤中有效磷浓度显著低于对照。低磷胁迫条件下，磷高效基因型甘蓝型油菜也拥有较强的磷素获取能力，与本研究的结果一致，磷高效基因型97081根际土壤的有效磷含量显著低于磷低效基因型97009^[18]。

磷高效基因型甘蓝型油菜根际和非根际土壤的无机磷总量在施磷和不施磷条件下均低于磷低效基因型^[18]。本研究中除了不施磷时OsPT4土壤无机磷总量在分蘖期高于日本晴外，其他3个生育期以及在施磷条件下的4个生育期OsPT4土壤无机磷总量均低于日本晴，PHO2土壤无机磷总量在4个生育期两种处理条件下均显著低于日本晴。这两个研究结果都说明磷高效基因型作物对土壤无机磷的活化吸收能力强于磷低效型或常规作物。

石灰性土壤的6种无机磷形态中Ca₂-P是有效磷源，对植物的有效性最高，Ca₈-P、Al-P和Fe-P是植物的缓效磷源，对植物的有效性较低，O-P、Ca₁₀-P是潜在磷源，植物较难吸收利用^[19]。本研究发现不施磷条件下，OsPT4土壤Ca₂-P、Ca₈-P、Al-P含量在灌浆期和成熟期显著低于日本晴，Fe-P含量在孕穗期、成熟期也显著低于日本晴，说明OsPT4对Ca₂-P、Ca₈-P、Al-P、Fe-P的吸收能力较强。这与蔡秋燕等^[20]对磷高效基因型野生大麦的研究一致，她发现磷高效基因型野生大麦活化吸收Ca₂-P、Ca₈-P、Al-P的能力较强。梁宏玲等^[18]采用根箱试验进一步证明低磷胁迫下，磷高效基因型甘蓝型油菜在蕾薹期也具有较强的吸收积累磷素能力，对根际土壤Al-P和Ca-P的高效吸收更加显著。另外，本研究发现在施磷和不施磷条件下4个生育期OsPT4的土壤Ca₁₀-P含量与日本晴均无显著差异，蔡秋燕等^[20]对磷高效基因型野生大麦Ca₁₀-P含量的研究也证明了这个结果。虽然上述研究采用的土壤和作物各不相同，但研究结果基本一致，即在不施磷肥或土壤中磷素相对缺乏时，磷高效作物对有效磷源和缓效磷源的活化吸收能力强于磷低效品种或常规品种，磷高效作物种植土壤的有效磷源和缓效磷源会表现出更大的亏缺。杨慧等^[21]对比岩溶区的棕色石灰土不同形态无机磷组分含量发现：Ca₁₀-P>O-P>Fe-P>Al-P>Ca₈-P>Ca₂-P。杨毅等^[22]采用石灰性褐土证明在不同施肥条件下，土壤中不同形态无机磷浓度表现为Ca₁₀-P>O-P>Ca₈-P>Fe-P>Al-P>Ca₂-P。本研究在施磷和不施磷条件下，3种水稻土壤在4个生育期无机磷组分含量均表现为O-P>Ca₁₀-P>Ca₈-P>Al-P>Fe-P>Ca₂-P。尽管同为石灰性土壤，不同形态无机磷浓度高低顺序并不一致，但符合潜在磷源浓度>缓效磷源浓度>有效磷源浓度这一规律。

磷高效转基因水稻OsPT4在第一年种植就对土壤中的Ca₂-P、Ca₈-P、Al-P、Fe-P产生了显著影响，但Ca₂-P、Ca₈-P、Al-P、Fe-P含量占全磷比例很低，这4种磷组分含量在不同磷效率基因型水稻土壤之间的显著差异没有引起全磷含量的显著性差异。影响土壤中无机磷组分含量的因素还有很多，如土壤pH值、土壤有机质含量、气候条件、栽培措施等^[23]，这些因素之间的互作也会对土壤无机磷组分含量产生影响。本研究仅是对第一年种植磷高效转基因水稻的土壤无机磷组分浓度进行的，要探究磷高效转基因水稻对土壤无机磷形态的影响还需要长期持续进行研究。

在水稻4个生长期内，PHO2、OsPT4、日本晴土壤均为潜在磷源>缓效磷源>有效磷源，无机磷组分含量表现为O-P>Ca₁₀-P>Ca₈-P>Al-P>Fe-P>Ca₂-P。

OsPT4对土壤中有效磷源及缓效磷源Ca₂-P、Ca₈-P、Al-P、Fe-P的吸收能力强于其亲本日本晴，但在提高土壤对植株磷素供应水平的同时未对土壤全磷含量造成显著影响，所以本研究不能判定磷高效转基因水稻OsPT4会对土壤磷素养分安全构成威胁。