镉是环境中具有高毒害性的重金属元素，其生物迁移性强，极易被植物吸收和积累^[1]，进而对植株产生毒害使可食用部分镉含量超标，威胁食品安全，危害人类健康。水稻是人类主要食用的粮食作物之一，同时也是易积累镉的农作物之一，有研究表明，不同基因型水稻间各部位的镉含量分配存在显著差异^[2]，镉在植株内的转运情况、存在形态以及分布特征也不相同^[3]。水稻根系及地上部主要通过细胞壁固持^[4]、细胞可溶部分区室化^[5]作用结合并束缚大量的镉^[6]，减少进入细胞器的镉含量，以减少自由态的镉紊乱植株细胞内的代谢功能^[7]，从而缓解镉对水稻的毒害作用。这是水稻细胞层面上主要的耐镉机制。

磷素是植物生长必需的营养元素之一，通过多种途径参与植物代谢过程^[8]。水稻分蘖期是植株主要的营养吸收时期。有研究发现，磷酸盐可以抑制植物对镉的吸收^[9-10]，其中镉的醋酸提取态，主要通过二代磷酸盐与重金属结合形成螯合物^[11]，以减少镉在植株内的移动性，从而降低镉对植株的毒害作用。此外，磷营养可以增加细胞壁的厚度从而固持更多的镉。但磷对植物镉积累的影响因植株基因型不同而异，因此研究磷对镉在不同水稻亚细胞的分布及化学结合形态积累的影响，为进一步阐明磷对水稻的耐镉机理提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

盆栽试验用土取自沈阳农业大学稻作所试验田耕层0~20 cm水稻土，风干后过3 mm筛用于水稻种植。取过1 mm和0.25 mm筛的土样，采用常规方法，土壤基本理化性质分析结果：pH 6.64；全氮1.43 g·kg^-1；全磷0.71 g·kg^-1；全钾15.5 g·kg^-1；碱解氮98 mg·kg^-1；速效磷12.08 mg·kg^-1、速效钾12.16 mg·kg^-1；有机质21.2 g·kg^-1；全镉0.49 mg·kg^-1。

供试水稻为沈农315（耐性）、花粳1417（敏感型），稻苗均由沈阳农业大学稻作所提供。

1.2 实验设置与处理

选用氮、磷、钾肥分别为脲、磷酸二氢钠、氯化钾；镉为氯化镉。实验设置基肥氮（N）为100 mg·kg^-1，钾（K2O）为150 mg·kg^-1，磷（P₂O₅）设4个水平分别为0 mg·kg^-1（P0）、150 mg·kg^-1（P1）、450 mg·kg^-1（P2）、900 mg·kg^-1（P3），镉为5 mg·kg^-1（Cd5），采用全因素设计，每处理6次重复。将过筛土以每盆4 kg装入口径20 cm、高25 cm的塑料盆，将Cd以溶液形式加入土壤充分搅拌混匀并淹水平衡10 d，之后将基肥氮、磷、钾肥分别以溶液形式加入土壤混匀并淹水平衡24 h。挑选长势均匀的水稻幼苗于5月29日移栽至盆中，每盆一穴，每穴2株，水面保持2~3 cm，在水稻种植25 d时追施分蘖肥（N：50 mg·kg^-1），待水稻种植45 d后选取长势均衡的植株在分蘖末期采样。每处理取3个重复用于实验室分析。

1.3 试验方法 1.3.1 植株全镉含量测定

将采集的水稻根部与地上部清洗干净，于105 ℃杀青20 min，70 ℃烘干2 h，粉碎过60目筛，并称取0.5 g，加入HNO₃-HClO₄（体积比1:4）混合酸10 mL过夜。调节沙浴逐级升温至（196±5）℃，消煮至澄清，剩余近2 mL，待冷却，润洗过滤，纯水定容至25 mL待测。将待测液用电感耦合等离子体发射光谱仪ICP-OES（VISTA-MPX，美国）测定镉含量。

1.3.2 植株亚细胞组分镉含量测定

将采集的植株鲜样用蒸馏水清洗后以纱布吸干表面水分，按料液比1:10称取根系、茎叶各1 g样品，加入配制的预冷缓冲液[蔗糖250 mmol·L^-1，Tris-HCl（pH 7.4）50 mmol·L^-1，DTT 1 mmol·L^-1] 5 mL冰浴研磨至匀浆，再加5 mL冲洗钵体，匀浆与冲洗液同置于15 mL离心管中。采用差速离心（Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000），参照Weigel等^[12]的技术，按照王芳等^[13]的方法略有改动。所有处理均在4 ℃下进行：按2400 r·min^-1离心15 min得到沉淀部分为细胞壁组分；将上清液以12 000 r·min^-1离心45 min得到沉淀部分为细胞器组分；上清液为细胞可溶部分。将细胞壁、细胞器组分于70 ℃烘干，加入混合酸10 mL，转入三角瓶放置过夜（≥10 h），消煮、润洗过滤、定容至10 mL，测定镉含量。

1.3.3 植株镉化学形态测定

将植株鲜样清洗拭干，称取1 g剪为1~2 mm²的碎片置于离心管，加入10 mL提取剂浸提，于25 ℃恒温箱内放置20 h，之后25 ℃恒温振荡2 h，以4000 r·min^-1离心10 min，倒出上清液，再加入同体积提取剂，恒温振荡2 h、离心10 min，将两次上清液同置于三角瓶备用。采用以下5种提取剂逐步浸提：80%乙醇、去离子水、1 mol·L^-1氯化钠、2%醋酸、0.6 mol·L^-1盐酸。所得上清液置于电热板蒸发至近干（1~2 mL），加酸、消煮、润洗过滤、10%硝酸定容至10 mL，测定镉含量。

1.4 数据处理

实验数据应用Excel软件进行统计整理，应用SPSS 18.0进行数据差异性分析。

2 结果与分析 2.1 不同施磷量对水稻镉含量的影响

由图 1可以看出，两品种水稻根部镉含量明显高于茎叶。在P0处理下水稻根及茎叶镉含量均最高，说明此时植株受镉的毒害作用最大。与P0相比，各施磷处理均明显降低了两品种根系的镉含量，且随施磷水平的提高镉含量显著降低，沈农315和花粳1417分别降低了16.68%~27.37%、18.27%~28.09%，在P3水平上降低幅度最大。与P1相比，随着磷的增加水稻根及茎叶中镉含量的降低幅度呈逐渐减缓趋势，且P2、P3处理之间的镉含量差异不显著，说明增施磷肥可以缓解镉对水稻的毒害，但磷对镉的抑制存在一定阈值，磷过量对镉的抑制作用不明显。两个水稻品种茎叶的镉含量在不同磷处理中的变化趋势与根部相似，同样表现出了镉含量随磷增加而逐渐降低的趋势。沈农315与花粳1417的降低幅度分别为32.20%~64.02%、33.22%~66.44%，在P3水平上降低幅度最大，但P2、P3处理之间的镉含量差异不显著。可见磷对茎叶镉含量的影响大于根部。

相较两个品种而言，沈农315根部镉含量明显高于花粳1417，而茎叶镉含量明显低于花粳1417。这可能是由于沈农315对重金属的转运能力较低，能将更多的镉富集在根部，减少了镉向地上部的迁移。花粳1417茎叶镉含量较高可能是由于其对镉的迁移能力较强，向茎叶转运镉量较多所致。这说明植株对镉的吸收积累情况受基因型的影响。

2.2 不同施磷量对水稻亚细胞镉含量的影响

由表 1可以看出，在4个磷处理中两品种根及茎叶亚细胞各组分镉含量的分配比例均呈现细胞壁＞细胞可溶部分＞细胞器的趋势，说明不同镉耐性的水稻其镉的亚细胞分布趋势是一致的。

在植株根系中，与P0相比，施磷明显降低了各亚细胞组分中的镉含量，改变了镉在亚细胞各组分中的分配比例。水稻细胞壁和细胞可溶部分的镉占比在P0水平中最少，说明缺磷时植株细胞壁及细胞可溶部分对镉的固持和束缚作用较弱，自由态镉离子数量相对较多，对植株的胁迫作用更大；而细胞器中镉含量及所占比例在P0处理中最高，沈农315和花粳1417分别达到26.67%、29.87%，细胞器是植株主要的代谢场所，若镉浓度较高会对水稻生长产生胁迫效应，说明在缺磷处理中，水稻根细胞受镉毒害作用比其他磷处理更大。与P0相比，磷的增加明显提高了两品种根部镉在细胞壁及细胞可溶部分的比例，降低了镉在细胞器中的比例，且细胞壁中镉分配率的增长和细胞器中镉分配率的降低更为明显，均在P3处理时变化最大：沈农315和花粳1417细胞壁镉分别增长了13.11和10.94个百分点，细胞器镉分别降低了15.60和14.02个百分点。这说明磷的增加主要增强了根细胞壁对镉的束缚，减少了进入细胞器的镉含量，从而减少镉与蛋白质结合干扰植株生理代谢的毒害作用，进而缓解了植株镉胁迫。

在茎叶中，两品种亚细胞组分中镉的分配比例变化规律与根部相似，在缺磷时植株受镉毒害作用最大，随磷的增加镉毒害逐渐减轻，与P0相比，在P3处理时磷对茎叶镉胁迫的缓解效果最好。两品种细胞器中镉的分配比例明显低于根部，说明镉对茎叶的毒害小于根部。在相同磷水平下，沈农315茎叶细胞壁镉的分配比例明显大于根部，达到50.09%~58.13%，细胞可溶部分镉的分配比例略有增加；而花粳1417茎叶细胞壁镉的分配比例与根部相差不大，细胞可溶部分镉的分配比例明显增加。这说明两品种茎叶中的耐镉机制存在差异。

对于两品种而言，沈农315根细胞壁对镉的固持能力比花粳1417更强，进入细胞器参与代谢的镉更少，减少了其向地上部的运输，但两品种根细胞可溶部分的镉含量及分配比例差异不显著。在茎叶中，花粳1417的细胞壁分配比例更小，细胞可溶部分分配比例更大。这说明两品种茎叶在对镉的胁迫表现上存在较大差异，可能与磷的吸收利用差异有关。

2.3 不同施磷量对水稻镉化学形态的影响

由表 2可以看出，镉形态的回收率为91.13%~97.26%，说明本实验所采用的提取方法能较好地用于镉化学结合形态的研究。两品种根部各提取态的分配比例呈现为氯化钠提取态＞醋酸提取态＞去离子水提取态＞乙醇提取态＞盐酸提取态，说明不同镉耐性的水稻其镉化学形态分布趋势是一致的。

与P0相比，增施磷明显改变了水稻镉各提取态的分配比例。镉的氯化钠提取态、乙醇提取态所占比例随磷的增加逐渐降低，以氯化钠提取态变化最为明显，沈农315和花粳1417的降幅分别为23.38%~40.11%、22.55%~39.56%，在各施磷水平间镉含量降低差异显著，P3处理降到最低，但P2、P3处理间差异不显著。镉的氯化钠提取态是镉与蛋白质结合的形态，干扰酶活性，影响作物正常生长发育，氯化钠提取态占比越多的作物，镉耐性越低；乙醇提取态迁移能力更强，毒性更高。磷的增加显著降低了镉氯化钠提取态和乙醇提取态，说明磷对植株抑制镉毒害效果显著。镉的醋酸提取态和去离子水提取态的分配比例随磷的增加而逐渐增加，其中以醋酸提取态变化最为明显，沈农315和花粳1417的增幅分别为19.70%~31.32%、10.05%~16.36%，在各施磷水平间镉含量差异显著，P3处理降到最低，但P2、P3处理间差异不显著。醋酸提取态是镉与二代磷酸盐结合的形态，磷酸盐类吸附镉，使活性态镉数量减少，降低了镉在植株内的迁移，从而提高了植株对镉的耐受性。

相对而言，相同磷水平上，沈农315的氯化钠提取态和乙醇提取态镉含量均低于花粳1417，而醋酸提取态及分配比例明显高于花粳1417，盐酸提取态略有增加但变化不明显，两品种间变化不显著。

3 讨论 3.1 施磷量对水稻植株镉含量的影响

磷是植物生长必需的营养元素之一，参与植株碳水化合物、蛋白质的合成与代谢，可促进植株生长，增强植物抗逆能力^[14-15]，从而在一定程度上缓解镉的毒害作用。在本实验中添加镉为5 mg·kg^-1，缺磷条件下植株镉含量最高，此时对植株的毒害程度最大，随施磷量增加，两品种水稻各部位的镉含量逐渐降低，说明施磷对缓解植株镉毒害有一定的作用。在磷为900 mg·kg^-1时镉含量降至最低，但与磷为450 mg·kg^-1时差异不显著。这与一些学者的研究结果不尽相同：董善辉等^[16]研究发现，当施磷量为450 mg·kg^-1时，水稻各部位镉含量均达到最低值；Singh^[17]发现常量磷供应下燕麦和油菜的镉含量不受磷影响，但在高磷水平下，植株体内的镉含量明显上升；高超等^[18]研究施用磷酸钙（SSP）和磷酸二铵（DAP）对水稻镉含量的影响，结果表明镉随磷施用量增加而减少，在磷为900 mg·kg^-1时镉含量最低。

3.2 施磷量对水稻亚细胞镉含量的影响

水稻主要通过细胞壁、细胞可溶部分束缚和固持植株中镉来达到缓解重金属毒害的作用。刘清泉等^[19]认为，在细胞壁中镉含量最高，是因为细胞壁中含有大量的负电荷基团，这些基团通过与带正电荷的重金属离子沉淀络合，使大部分镉被束缚在细胞壁中。在磷供应充足情况下，植株细胞壁多糖含量降低从而减少与重金属的结合位点^[20]，进而提高植株金属耐性。磷与镉在植株细胞壁形成金属螯合物，减少了Cd²⁺在木质部的长距离输送，降低了向地上部的迁移率^[21]。所以随着施磷量的增加植株细胞壁的镉含量所占比例也会增加。本实验得出水稻亚细胞各组分镉含量为细胞壁＞细胞可溶部分＞细胞器，与前人研究结果一致^{[3, 7, 14]}。水稻根及茎叶亚细胞镉含量变化趋势与水稻镉全量保持一致。

3.3 施磷量对水稻镉化学结合形态的影响

水稻体内的镉以不同的化学结合形态存在于植株的不同部位^[3]，其不同的化学形态可以反映镉的不同活性、毒性、迁移能力以及与基质分离的难易程度^[22]。一般而言，植株中的镉主要以氯化钠结合形态存在，因为镉对蛋白质或其他有机化合物中巯基有很强的亲和力^[23]，在本实验中也表现出镉在水稻内主要以氯化钠提取态存在。当磷浓度增加时，沈农315、花粳1417的总提取态下降，具有高迁移活性的乙醇提取态、氯化钠提取态不断降低，占比也不断减少，而迁移活性较弱的醋酸提取态及盐酸提取态有所增加；去离子水提取态的有机酸盐和金属一代磷酸盐可与镉在原生质膜表面的结合位置上形成螯合物^[24]，从而限制镉在水稻内迁移性，因此随磷酸盐增加镉去离子提取态逐渐增加。两品种间存在镉含量变化的显著差异，则可能是由于两种水稻存在基因型上的差异亦或是对磷的吸收利用效率的差异^[25]。

4 结论

（1）两品种水稻根系及茎叶的镉含量随施磷量的增加呈现逐渐降低的趋势，降低幅度逐渐减缓，当磷为900 mg·kg^-1时镉含量最低，但与磷为450 mg·kg^-1时差异不显著。沈农315主要将镉富集在根部，花粳1417的镉向地上部迁移较多。

（2）水稻根与茎叶亚细胞各组分镉的分布为细胞壁＞细胞可溶部分＞细胞器。磷浓度越高，镉在细胞壁的分配比例越多，细胞器比例越少。沈农315将更多的镉束缚在根细胞壁，减少了镉向地上部的转运。花粳1417细胞器镉比例较高。

（3）水稻镉的化学结合形态分配比例呈现为氯化钠提取态＞醋酸提取态＞去离子水提取态＞乙醇提取态＞盐酸提取态。随着磷的增加镉的氯化钠提取态、乙醇提取态比例逐渐降低，醋酸提取态、去离子水提取态比例逐渐增加，盐酸提取态比例略有增加但变化不明显。沈农315的氯化钠提取态比例显著低于花粳1417，而醋酸提取态比例显著高于花粳1417。