离子液体（Ionic Liquids，ILs）是由有机阳离子和无机或有机阴离子组成、室温下呈液体状态的盐。由于具有导电性强、化学性质稳定、不挥发、不易燃等特性，使其在电化学、化学反应和分离过程等领域被广泛应用^[1-2]。伴随着ILs的大规模应用，其不可避免的通过水循环等途径进入生态系统，对环境和生物体造成不同程度的影响。咪唑类ILs为目前应用最广泛的一类ILs，并且越来越多的研究表明，咪唑类传统ILs的生物降解性较差，对分子（酶）、细胞、微生物、藻类和动植物等均有较显著的毒性^[3-4]。

有关ILs的毒性研究主要集中在以下两方面：一是ILs对生态系统中各类生物的毒性作用情况；二是ILs的阴、阳离子组成及结构对其毒性之影响^[5]。相关研究以生物个体水平的毒性试验为主，并有一些分子、细胞水平的毒性研究。其毒性机理主要与细胞膜结构的破坏以及氧化胁迫有关，例如：Hartmann等^[6]从基因水平研究了季鏻离子液体对构巢曲霉的毒性，发现离子液体毒性作用的主要机制是损坏细胞壁以及增大细胞膜透性；Du等^[7]分析了离子液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[Omim]PF6）对斑马鱼Danio rerio的抗氧化酶活性、DNA损伤等的影响，结果表明离子液体可诱导氧化应激反应和DNA损伤，并且程度随时间而累积；牧辉等^[8]研究发现ILs对普通小球藻的生长和叶绿素a的产生均有显著的抑制作用；Liu等^[9]在水稻中的研究也发现ILs对光合作用及叶绿素代谢具有显著的抑制作用。在所研究的生物类群方面，以对水生生物（如藻类、鱼类等）影响的研究居多，对陆生植物的相对较少。

玉米（Zea mays L.）是目前我国播种面积最大的农作物，在农田生态系统中具有重要地位。本研究以玉米为实验材料，探究三种不同烃链长度咪唑类ILs：1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（[C₄mim]Cl）、1-己基-3-甲基咪唑氯盐（[C₆mim]Cl）和1-辛基-3-甲基咪唑氯盐（[C₈mim]Cl）对玉米幼苗的毒性效应，为综合评价ILs对生态环境的潜在危害提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

本试验以目前我国广泛种植的玉米品种郑单958为材料（北京德农种业）。[C₄mim]Cl、[C₆mim]Cl和[C₈mim]Cl均购自兰州中科凯特科工贸有限公司。

1.2 玉米幼苗培养

幼苗的培养全部在恒温光照培养箱中进行。挑选均一饱满的玉米种子，用75%酒精溶液消毒5 min，蒸馏水多次冲洗后，28 ℃（暗）浸种催芽12 h，在发芽盒底部铺上双层滤纸，30 mL蒸馏水浸湿，28 ℃发芽48 h^[9]。选取发芽均匀一致的种子，每20粒一组培养于带孔水培盒上，将种子初生根浸入培养液中培养，培养液为含不同浓度ILs的Hoagland营养液（pH=6.0）^[10]，无曝气装置。培养条件：光照强度10 000 lx，温度28 ℃，光照/黑暗周期为16 h /8 h^[9]，培养6 d，每隔1 d更换一次培养液。

1.3 实验设计

玉米幼苗根、茎干重抑制率测定，依据预实验结果（数据未提供）设置：[C₄mim]Cl，0、75、200、400、600、800、1000 mg·L^-1；[C₆mim]Cl，0、10、20、50、100、150 mg·L^-1；[C₈mim]Cl，0、5、10、25、50、75、100 mg·L^-1。

玉米幼苗抗氧化酶系和MDA含量测定，参照根、茎生物量抑制情况设置：[C₄mim]Cl，0、200、400、600、800 mg·L^-1；[C₆mim]Cl，0、10、20、30、40 mg·L^-1；[C₈mim]Cl，0、2、4、6、8 mg·L^-1。

以不含ILs的Hoagland营养液为对照，每处理设3组重复。

1.4 测定方法

ILs对玉米幼苗根、茎重的影响：取培养第7 d的玉米幼苗进行测定，根、茎重均为干重（80 ℃烘干48 h），根据测定结果计算根、茎重抑制率，每处理10株重复。采用Logistic模型^[11]拟合根/茎干重抑制率-浓度曲线，并计算各处理的EC₅₀值。

抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量的测定：称取0.3 g玉米根/茎鲜样并匀浆，用于酶液的提取，参照李忠光等^[12]的方法进行测定。本研究中所测定的酶活力为比活力，即每毫克可溶性蛋白所含的酶活力单位。可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G250染色法^[13]；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用NBT还原法^[13]；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法^[14]；过氧化氢酶（CAT）活性测定参照Kang等^[15]的方法；APX活性参照李忠光等^[12]的方法；MDA含量测定参照邹琦等^[13]的方法。

1.5 数据统计与分析

用Orgin 7.5对抑制率进行拟合，模型为Losgitic模型y=（A1-A2）/[1+（x/x₀）p]+A2，采用单因素方差分析（ANOVA）并用LSD法进行显著性检验。

2 结果与分析 2.1 三种烃链长度ILs对玉米幼苗生长的影响

不同浓度[C₄mim]Cl、[C₆mim]Cl和[C₈mim]Cl培养6 d后，玉米幼苗根、茎生长均受到明显抑制，表现为植株细弱、侧根不生长等（图 1）。生物量积累是反映植株生长状况的重要指标，对不同浓度的三种ILs处理下玉米根、茎生物量进行测定发现，随着ILs浓度的增加，其对玉米幼苗根、茎生长的抑制率也逐渐升高。分别对不同浓度下[C₄mim]Cl、[C₆mim]Cl和[C₈mim]Cl处理6 d后玉米根、茎重抑制率做曲线，建立玉米幼苗根、茎生长与离子种类及液体浓度的关系，并用Logistic模型进行拟合（图 2），计算三种ILs分别对玉米根、茎干重抑制的EC₅₀值。结果表明，[C₄mim]Cl、[C₆mim]Cl和[C₈mim]Cl抑制玉米根生长的EC₅₀分别为194、38.4、2.97 mg·L^-1，抑制玉米茎生长的EC₅₀分别为369、52.9、23.3 mg·L^-1。不同烃链长度ILs对玉米根、茎生长的抑制情况表现为[C₄mim]Cl < [C₆mim]Cl < [C₈mim]Cl，即三种ILs对玉米幼苗根、茎生长的抑制作用随着烃链长度的增加而增大，且对根的抑制作用大于茎。

2.2 三种烃链长度ILs对玉米幼苗根、茎部抗氧化酶活性的影响

经不同浓度三种ILs处理6 d后，玉米幼苗根、茎部抗氧化酶活性均发生变化，结果如表 1至表 3所示。玉米幼苗根部SOD活性受到显著抑制，SOD活性随ILs浓度的升高而逐渐下降。[C₆mim]Cl处理组茎部SOD活性表现为先激活后抑制，30 mg·L^-1[C₆mim]Cl处理组SOD活性比对照显著提高，随后逐渐下降，而[C₈mim]Cl处理组茎部SOD活性被显著抑制。与对照相比，800 mg·L^-1[C₄mim]Cl处理组根部SOD活性下降40.4%；50 mg·L^-1[C₆mim]Cl处理组根部SOD活性下降42.2%；8 mg·L^-1[C₈mim]Cl处理组根、茎部SOD活性分别下降了50.8%和45.8%。

玉米幼苗根、茎部POD活性均受到显著抑制，表现为随ILs浓度的升高逐渐下降。与对照相比，800 mg·L^-1[C₄mim]Cl处理组根、茎部POD活性分别下降53.7%和54.7%；50 mg·L^-1[C₆mim]Cl处理组根、茎部POD活性分别下降58.8%和37.5%；8 mg·L^-1 [C₈mim]Cl处理组根、茎部POD活性分别下降54.8%和18.5%。

随着ILs浓度的增加，三种ILs处理下玉米幼苗根、茎部CAT和APX活性均呈逐渐下降趋势。同对照相比，800 mg·L^-1 [C₄mim]Cl处理组根、茎部CAT活性分别降低16.7%和18.6%；50 mg·L^-1[C₆mim]Cl处理组根、茎部CAT活性分别降低79.3%和12.6%；8 mg·L^-1[C₈mim]Cl处理组根、茎部CAT活性分别降低72.7%和49.7%；800 mg·L^-1[C₄mim]Cl处理组根、茎部APX活性分别降低8.4%和54.2%；50 mg·L^-1 [C₆mim]Cl处理组根、茎部APX活性分别降低21.0%和67.0%；8 mg·L^-1 [C₈mim]Cl处理组根、茎部APX活性分别降低29.1%和88.1%。

2.3 三种烃链长度ILs对玉米幼苗根、茎部MDA含量的影响

三种ILs处理组对玉米幼苗根、茎部MDA含量的影响列于表 4和表 5。玉米幼苗根、茎部MDA含量均随ILs处理浓度的增加而上升。800 mg·L^-1 [C₄mim]Cl处理组根、茎部MDA含量为对照组的6.2倍；40 mg·L^-1 [C₆mim]Cl处理组根、茎部MDA含量为对照组的5.5倍；8 mg·L－1 [C₈mim]Cl处理组根、茎部MDA含量为对照组的5.1倍。三种ILs处理组MDA含量均显著高于对照组。

3 讨论

ILs毒性与其种类及阴阳离子结构有关。在分子结构上，ILs可能是某些抗生素或除草剂的类似物，从而产生相似的毒性效应^[16-18]。侧链基团是影响ILs毒性的重要因素。Bubalo等^[19]通过建立定量结构-毒性关系（QSTR）模型，探讨14种带有功能侧链的咪唑类ILs对斑点叉尾鮰卵巢细胞（CCO）的毒性，发现细胞毒性主要与阳离子基团的形状和疏水性相关。Ma等^[20]探讨了阴阳离子组成对海洋发光菌费氏弧菌Vibrio fischeri的定量结构-毒性关系，发现阳离子的尺寸、亲脂性及三维分子结构是影响ILs毒性的主要因素。在不同生物中的研究表明，ILs毒性随侧链取代基长度增加而增加^[21-24]。究其原因，取代基链长度增加意味着更高的亲脂性，因此更容易破坏膜结构，对生物体产生不利影响^[25]。本研究取得了相似的结果，三种ILs对玉米根茎生长的抑制作用表现为[C₄mim]Cl < [C₆mim]Cl < [C₈mim]Cl，即侧链取代基链越长，毒性越高。

ILs对生长的影响并非完全不利。Chen等^[26]发现[C2mim][OAc]添加可以对小麦Cd²⁺胁迫起到明显的缓解作用，原因是[C2mim][OAc]能够与Cd²⁺结合而使其钝化。Pernak等^[18]发现ILs因具有与植物生长调节剂矮壮素（CCC）类似的结构而使其具有相似的生物活性。段炼等^[27]研究[C₄mim]Cl对藻类的毒性作用时发现，在较低浓度情况下，[C₄mim]Cl在处理最开始的一段时期内对斜生栅藻的生长表现为轻微的促进作用，之后逐渐转为抑制，这暗示了ILs对生物生长的影响可能具有更复杂的生理机制。

植物在正常生理代谢过程或不良逆境胁迫下均存在活性氧（ROS）类物质的释放，包括H₂O₂、-OH、O₂^-·等，ROS通常来源于线粒体、叶绿体和过氧化物体，一般为代谢副产物^[17]。植物在干旱、盐碱、冷冻、病虫害等不良逆境条件下，均可发生ROS的过量积累，引起细胞发生中毒反应，如对生物大分子的破坏及生物膜的过氧化等^{[25, 28]}。正常情况下，植物通过抗氧化酶系统（如SOD、POD、CAT和APX等）或一些抗氧化物质（如谷胱甘肽、抗坏血酸等）清除自身代谢产生的ROS，使其维持在较低的水平^[9]。逆境胁迫会对植物ROS代谢产生双重不利影响：一方面，逆境胁迫会刺激ROS的大量产生；另一方面，逆境胁迫下植物自身生理机能衰退，ROS清除能力亦受到限制^[29]。

抗氧化酶系统在植物ROS清除过程中发挥着重要作用，其中SOD参与将O₂^-·转化为O₂和H₂O₂^[30]，而POD、CAT则参与将H₂O₂分解为O₂和H₂O，APX参与将抗坏血酸作为电子供体消除H₂O₂的过程^[4]。在本研究中，随着三种ILs处理浓度的增加，根/茎SOD、POD、CAT和APX比活力总体呈逐渐下降趋势。可见，尽管三种ILs毒性大小不同，但对玉米幼苗可能具有相同的毒性机理，即引起抗氧化酶活性降低。上述变化趋势与Bubalo等^[25]在小麦中以及Liu等^[9]在水稻中的研究一致。此外，[C₆mim]Cl处理下茎部SOD活性随浓度增加呈现先上升后下降的规律。这可能与低浓度下ROS积累引起SOD活性的“刺激作用”有关^[31]，类似的趋势在其他文献中也有报道^[11]。

抗氧化酶活性下降可能会引起植物体内ROS的大量积累，这些活泼ROS极易对生物膜上的重要结构——脂肪酸分子造成破坏，导致质膜过氧化，同时产生有毒的醛类物质。MDA是膜脂过氧化的最终产物，在植物中，MDA的积累通常作为反映质膜过氧化程度或植物遭受胁迫程度的重要指标。本研究中，三种ILs处理均引起玉米幼苗根、茎MDA含量显著增加，表明ILs处理引起玉米质膜过氧化，对根、茎造成伤害。质膜过氧化很可能与ROS的过量积累有关，而这也与抗氧化酶系统活性下降的结果相符。综上所述，三种咪唑类ILs对玉米幼苗的毒性机理很可能与抗氧化酶活性下降，以及膜脂过氧化有关，反映出ILs对植物的影响与干旱、高盐、冷冻或病虫害等环境胁迫具有相似的作用特点。考虑到不同ILs间特殊分子结构及其在工业生产中的重要作用，有关ILs对农业生物的综合影响还有待更详尽和深入的探讨。

4 结论

（1）三种ILs（[C₄mim]Cl、[C₆mim]Cl和[C₈mim]Cl）对玉米幼苗根、茎生长具明显抑制作用，表现为侧链取代基越长，毒性越高；同一种ILs处理下对根重的抑制率大于茎重。

（2）总体而言，随浓度增加三种ILs对抗氧化酶系统（SOD、POD、CAT和APX）活性在根、茎中均表现为抑制趋势，且根、茎部MDA含量显著增加。