镉(Cd)是我国污染土壤中最常见的重金属元素。Cd在植物体内积累到一定程度后，会对光合作用、呼吸作用、营养元素吸收和水分平衡等生理过程产生负面影响，不仅抑制植物的生长发育，甚至导致植物死亡^[1-2]。水稻是Cd积累能力最强的大宗谷类作物，Cd既可以通过根系的吸收和转运到达地上部的叶片和稻米中，也可以通过叶面污染进入叶肉细胞，在籽粒灌浆期转运到稻米中^[3-4]。水稻积累的Cd能通过食物链迁移到动物和人体内，严重危害动物和人体健康^[5]。

随着水稻产量的不断提高，其对微量元素的需求量也在增加。叶面喷施微量元素肥料能有效提高水稻产量和品质^[6]。锰(Mn)和锌(Zn)是水稻生长发育所必需的微量元素。Mn在维持叶绿体稳定中发挥着重要作用，能刺激生长素合成，并且可作为酶的催化剂来调节酶活性^[7]。在Cd污染环境中，增施Mn能显著降低水稻根系和地上部的Cd含量，并能提升水稻细胞壁中Cd的分配比率和降低胞液中Cd的分配比率，显著缓解Cd对水稻生长发育的抑制作用^[8-9]。增施Zn也能缓解Cd对水稻的毒害作用，促进根系发育、提高地上部生长量^[10]。叶面喷施Zn可以降低稻米对Cd的积累^[11-12]，提高产量和稻米Zn营养品质，进而改善人类Zn营养状况^[13-14]。

苹果酸(MA)是将植物不同细胞器的多种代谢联系起来的小分子有机酸，在植物生长调节、气孔孔径、营养元素平衡和有毒金属耐性等方面起着重要作用^[15-16]。植物受到Cd胁迫时，细胞中的苹果酸积累量会显著增加^[17]，外源添加苹果酸能显著提高植物生长量、增加净光合速率、减少H₂O₂的积累、增强根系活性等，进而减轻Cd的毒害作用^{[15-16, 18-19]}。

水培试验和盆栽试验结果证明：Mn和Zn对水稻幼苗Cd吸收转运特性有显著影响^[8-10]；苹果酸和柠檬酸等对向日葵、早熟禾、高狐草的Cd含量有显著影响^[15-16]。但在田间自然条件下，这些小分子化合物对水稻生殖生长阶段的Cd积累特性有何影响，尚未见相关研究报道。本研究以植物体内最常见的小分子酸苹果酸和微量元素Mn、Zn为试剂，采用水稻开花末期叶面喷施的方法，对它们调控水稻生殖器官Cd积累特性的效果和机理进行了探讨，旨在为降Cd叶面调理剂的筛选和研发提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料与地点

以早稻品种Y两优143为材料，在广西壮族自治区河池市选择土壤和稻米Cd含量超标的水稻田进行试验。试验田为水稻土，其基本理化性质为：pH 6.53，有机质34.38 g·kg^-1，全氮0.164%，全磷0.024%，全钾1.20%，速效钾84.96 mg·kg^-1，速效磷17.1 mg·kg^-1，阳离子交换量7.82 cmol·kg^-1，Cd含量0.69 mg·kg^-1，Mn含量1 157.0 mg·kg^-1，Zn含量114.1 mg·kg^-1。以分析纯ZnCl₂、MnCl₂·4H₂O、L-苹果酸为原料配制叶面调理剂。

1.2 试验方法

每种叶面调理剂的田间喷施面积为10.0 m²(长4.0 m，宽2.5 m)。试验共分1个对照组(CK)和3个处理组，通过前期试验确定处理液浓度，水稻齐穗开花期向叶面均匀喷施处理液1次，为保证喷施条件一致，每个小区喷施2 L处理液，处理液均由田间灌溉水配制。其中，对照组喷施2 L灌溉水，处理1组喷施10 mmol·L^-1 MnCl₂，处理2组喷施10 mmol·L^-1 ZnCl₂，处理3组喷施5 mmol·L^-1苹果酸，每组设3次重复。水稻采用旱育秧方式，于2016年5月10日移栽。施肥方法依照水稻测土配方施肥技术，每公顷施用的氮、磷、钾总量分别为：尿素405 kg、普钙600 kg、氯化钾225 kg，其中基肥占总量的64%，分蘖肥占总量的25%，穗粒肥占总量的11%。整个生育期各处理无明显病虫害发生。

1.3 样品采集与处理

水稻成熟期，选取各小区中心长3.0 m、宽1.5 m处喷施较均匀的水稻，收获稻穗及穗下节部分装入网袋，自然风干后，将籽粒磨粉，用剪刀把穗轴、穗颈和旗叶剪碎混匀，分别收集于自封袋中，以备消解。

1.4 Cd及6种水稻矿质元素测定方法

参照Liu等的方法^[5]，分别称取0.5 g籽粒、穗轴、穗颈、旗叶样品于消解管中，加入7 mL HNO₃摇匀，室温下静置12 h。将消解管放入电热消解仪ED54上进行消解，温度110 ℃，加热2.5 h后，冷却至室温，再在消煮管内加入1 mL H₂O₂摇匀，110 ℃继续加热1.5 h。将消解管内的液体于170 ℃下赶酸至1 mL以内。再将消解液稀释并转移至25 mL容量瓶定容，用ICPMS测定样品中Cd、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn含量。

1.5 数据统计及分析

采用Microsoft Excel进行相关数据的计算、统计与处理。用SPSS 17.0进行统计分析，新复极差法(Duncan′s)作多重比较、差异显著性检验，并用Origin 8.6作图。

转移因子为相邻器官间Cd含量的比值^[20]：

2 结果与分析 2.1 苹果酸和微量元素对稻米Cd积累特性及分配比例的影响

我国的食品安全标准(GB 2762—2012)和FAO/WHO规定的稻米Cd最大限量标准分别为0.2 mg·kg^-1和0.4 mg·kg^-1。在土壤pH 6.53、Cd含量0.69 mg·kg^-1的轻度污染农田中，早稻品种Y两优143稻米中的Cd含量高达0.63 mg·kg^-1，比国家限量标准高2.15倍。水稻开花期喷施苹果酸、MnCl₂和ZnCl₂对水稻籽粒中的Cd含量均有显著抑制效果，且不同处理间存在差异，降Cd效果依次为苹果酸＞ZnCl₂＞MnCl₂(图 1)。在苹果酸的作用下，旗叶、穗颈、穗轴和籽粒中的Cd含量大幅度下降；而Mn和Zn主要是抑制了籽粒中的Cd含量。和CK相比，MnCl₂、ZnCl₂和苹果酸处理分别使籽粒Cd含量降低了23.84%、55.44%、58.86%，穗轴Cd含量分别下降19.52%、34.86%、75.77%，穗颈Cd含量分别下降20.90%、24.20%、59.84%，旗叶Cd含量分别下降29.53%、48.11%、50.71%。

2.2 叶面喷施苹果酸和微量元素对水稻各器官营养元素含量的影响

Mg、K、Ca、Mn、Fe和Zn等营养元素在水稻籽粒、穗轴、穗颈和旗叶中的含量差异非常明显。Mg含量分布高低依次为旗叶最高，籽粒次之，穗轴和穗颈最低(图 2A)。K含量分布高低依次为穗颈最高，旗叶和穗轴次之，籽粒最低(图 2B)。Ca、Mn、Fe含量分布高低依次为旗叶最高，穗轴和穗颈次之，籽粒最低(图 2C至图 2E)。Zn含量在器官间的差异较小。喷施苹果酸、MnCl₂和ZnCl₂对籽粒中的Mg、K、Zn含量没有显著影响，喷施MnCl₂对籽粒中微量元素的含量无显著影响，喷施苹果酸使籽粒中Ca、Mn含量显著降低，喷施ZnCl₂使籽粒中Ca、Fe含量显著升高。

喷施苹果酸使各器官中的Mn含量均显著下降(图 2D)，穗轴、穗颈的Mg含量显著升高，籽粒、穗轴、旗叶的Ca含量显著降低，穗颈Fe含量显著升高，穗轴Zn含量显著降低。喷施MnCl₂和ZnCl₂对籽粒、穗轴、穗颈和旗叶中的微量元素含量的影响总体上不大，少数微量元素含量影响达到5%的显著水平。喷施MnCl₂使穗颈Mg、K含量显著升高，穗轴Ca、Mn含量显著升高，穗轴K含量显著降低。喷施ZnCl₂使籽粒中Ca、Fe含量显著升高，旗叶Mn含量显著降低。喷施ZnCl₂显著提高了各器官中的Zn含量，但喷施MnCl₂和苹果酸对各器官中的Zn含量没有显著影响(图 2F)。

2.3 叶面喷施苹果酸和微量元素对水稻各器官营养元素转移因子的影响

喷施苹果酸、MnCl₂和ZnCl₂不仅影响各器官中必需营养元素的含量，也影响营养元素在相邻器官间的转移(表 1)。苹果酸处理下Cd的TF_{籽粒/穗轴}是CK的1.7倍，TF_{穗轴/穗颈}较CK显著降低。ZnCl₂处理Cd的TF_{穗颈/旗叶}较CK显著提高。MnCl₂对Cd的转移因子无显著影响。苹果酸对Cd的转移因子影响较大。

叶面喷施苹果酸能促进Mg、K、Ca、Mn、Fe、Zn从旗叶向穗颈中转移，其中Mg和Fe的TF_{穗颈/旗叶}与CK差异达到显著水平，分别为CK的1.8倍和2.1倍；抑制了K、Ca、Mn、Fe、Zn从穗颈向穗轴的转移，但对转移因子的影响差异不显著；促进了K、Ca、Mn、Fe、Zn从穗轴向籽粒中转移，其中K、Mn、Zn的TF_{籽粒/穗轴}显著提高。叶面喷施MnCl₂能促进Mg、K、Mn、Fe、Zn从旗叶向穗颈中转移，其中Mg和K的TF_{穗颈/旗叶}与CK差异达到显著水平，分别为CK的1.6倍和1.5倍；同时促进了Ca、Mn、Zn从穗颈向穗轴的转移，其中Ca从穗颈向穗轴的转移因子显著增加；显著抑制K从穗颈向穗轴的转移，显著促进K从穗轴向籽粒中的转移。叶面喷施ZnCl₂能促进Mg、K、Mn、Fe从旗叶向穗颈中转移，Mg的TF_{穗颈/旗叶}显著提高，Zn的TF_{穗颈/旗叶}显著降低；同时抑制了Mg、K、Fe在穗轴和穗颈间的转移，显著促进Zn在穗轴和穗颈间的转移，Zn的TF_{穗轴/穗颈}为CK的4.3倍；抑制Ca、Mn、Zn从穗轴向籽粒中的转移，其中Zn的TF_{籽粒/穗轴}显著降低。

苹果酸对Cd的转移因子影响较大，表现为显著促进Cd从穗轴向籽粒转移，显著抑制Cd从穗颈向穗轴的转移，ZnCl₂处理下只显著促进Cd从旗叶向穗颈的转移，而MnCl₂对水稻相邻器官间的转移因子无显著影响。

3 讨论

水稻收获期稻穗中60%~90%的总碳来自开花后的光合作用，其他许多储存在营养体中的营养元素和重金属Cd也会在籽粒发育过程中转运到籽粒中^[21-22]。高Cd积累品种开花后叶片中的Cd输出率和穗轴中的Cd浓度显著高于低Cd积累品种^{[4, 23]}。因此，通过喷施叶面调理剂来抑制茎叶中Cd向籽粒转运的过程，就有可能提高旗叶、穗颈、穗轴对Cd的阻控作用，在不影响籽粒正常发育的前提下，降低稻米中的Cd含量。本研究发现，水稻开花期喷施ZnCl₂和苹果酸能使稻谷中Cd含量从0.63 mg·kg^-1降到0.26~0.28 mg·kg^-1，达到国际食品安全标准。喷施MnCl₂也能降低稻米中的Cd含量，但降Cd效果不如ZnCl₂和苹果酸。不同叶面调理剂降Cd效果的差异可能与各自独特的调控机理有关。微量元素Mn和Zn可能主要通过拮抗作用来抑制Cd从营养器官向稻米中的转移^{[8, 24]}；而苹果酸可能与Cd发生螯合作用，使其转变成低毒或无毒的螯合态存贮在营养体中^[25]。由于节、老叶和基部茎秆中的Cd含量显著高于旗叶^[22-23]，喷施苹果酸可能促进了基部营养体对Cd的固定，抑制了Cd从基部营养体向穗颈和穗轴的转运，进而抑制了Cd向稻米的转运。

苹果酸是植物叶片和根系中最丰富的小分子酸，能通过呼吸作用对许多代谢过程产生调控作用^[26]。本研究发现，叶面喷施苹果酸，不仅对水稻籽粒、穗轴、穗颈和旗叶中的Cd含量产生了显著抑制作用，而且显著降低了各器官中的Mn含量(图 2D)，但Mg和Fe从旗叶向穗颈的转移以及K、Mn、Zn从穗轴向籽粒的转移效率显著提高。这可能是因为苹果酸通过叶片进入植株后，与Cd在细胞内或胞间隙形成的高稳定Cd复合物不易解离，降低了水稻Cd的活度，从而抑制茎叶中的Cd向稻米的转运^[27]。与此同时，苹果酸通过促进Mg、K、Fe等必需元素向水稻穗颈的转运，降低了Cd²⁺和Mn²⁺与相关离子通道和载体蛋白结合的几率^{[8, 28]}，于是显著降低了稻穗各部位以及稻米中的Cd含量。

水稻开花期叶面喷施ZnCl₂，不仅对水稻籽粒、穗轴、穗颈、旗叶中的Cd含量产生了显著抑制作用，而且籽粒中的Cd含量分配比例从12.55%降至8.66%，提高了各器官中的Zn含量。这可能是因为Cd与Zn为同族元素，具有相似的化学性质，当Cd²⁺与Zn²⁺竞争相同的转运蛋白时，膜蛋白优先结合水稻生长发育必需的Zn²⁺，从而抑制了Cd²⁺从旗叶向籽粒的转运。Cd从穗颈向穗轴转移的过程中，大部分的Cd被拦截在穗颈中，导致Cd的TF_{穗轴/穗颈}显著下降。喷施ZnCl₂促进了Mg、K、Mn从旗叶向穗颈的转移，必需营养元素中的阳离子与Cd²⁺争夺离子通道，从而降低了Cd在水稻中的转运，降低了籽粒的Cd含量。叶面喷施ZnCl₂后，籽粒、穗轴、穗颈中Fe含量均有所增加，与索炎炎等^[29]的研究相似。植物从土壤中主要吸收氧化态的铁，通常为Fe³⁺，经NAD(P)H还原后转变为Fe²⁺再进入细胞内。Cd²⁺能和Fe²⁺竞争相同的膜转运蛋白，因此喷施ZnCl₂来提高植株中Fe²⁺，间接减少了Cd在水稻中的转运^[30]。因此，叶面喷施ZnCl₂，可以通过增加Zn²⁺浓度，与Cd²⁺竞争通道，直接影响Cd的吸收和转运，也可以通过影响其他必需元素的含量，间接抑制Cd的吸收和转运。

大量的研究表明，Mn²⁺与Cd²⁺对相关离子通道和载体蛋白的结合存在竞争关系，Mn²⁺能优先结合细胞膜上的载体蛋白和通道蛋白，与Cd²⁺产生拮抗作用^{[8, 28, 31]}。本研究发现，叶面喷施MnCl₂，不仅对水稻籽粒、穗轴、穗颈、旗叶中的Cd含量产生了显著抑制作用，而且对K在相邻器官间的转移有很大影响。MnCl₂显著促进K从穗轴向籽粒中的转移，同时还促进了Mg、K、Mn、Fe、Zn从旗叶向穗颈、Ca从穗颈向穗轴的转移。这些必需元素在穗颈和穗轴中的富集，大幅度降低了Cd与转运蛋白结合的机会，通过拮抗作用有效抑制了Cd进入水稻籽粒的过程。

4 结论

(1) 水稻开花期喷施苹果酸、MnCl₂和ZnCl₂能显著降低成熟期籽粒、穗轴、穗颈和旗叶中的Cd含量，喷施苹果酸的降Cd效果高达58.86%，其次是ZnCl₂，喷施MnCl₂仅使稻米中的Cd含量下降了23.84%。

(2) 叶面喷施苹果酸、MnCl₂和ZnCl₂对水稻籽粒、穗轴、穗颈、旗叶中矿质元素的含量均有不同程度的影响。苹果酸能显著降低各器官中的Mn含量；苹果酸、MnCl₂和ZnCl₂都能促进Mg、K、Mn、Fe从旗叶向穗颈中的转移。

(3) 与10 mmol·L^-1 MnCl₂、10 mmol·L^-1 ZnCl₂相比，喷施5 mmol·L^-1苹果酸能显著抑制Cd从旗叶向穗颈的转移，使穗颈和穗轴中的Cd浓度大幅度下降。