近年来，随着工业的快速发展，人们对矿产资源的需求与日俱增，从而导致土壤重金属污染现象十分严峻^[1]，全国土壤污染超标率达16.1%^[2]。土壤中的重金属被植物吸收、转运后，会使植物的生理代谢活动发生紊乱，从一定程度上影响植物的正常生长发育，甚至可能导致植物的死亡^[3]。重金属污染土壤的研究在环境科学领域仍然面临着巨大的挑战^[4]。富集植物与作物间作可促进富集植物吸收土壤中的重金属，抑制作物体内重金属的累积量，同时不需中断农业生产，具有良好的实施性和发展潜能^[5-7]。

重金属进入植物体内后，会以不同的化学结合形态存在于不同的组织器官中，从而影响重金属在植物体内的迁移转化^[8-10]。植物体内的重金属与磷酸盐、硝酸盐、蛋白质、草酸盐、果胶酸盐、氨基酸盐等结合后会形成不同的化学形态，不同结合形态的重金属在植物体内的迁移能力不同，这是植物耐重金属的重要机理^[11-12]。Cd在小麦、水稻和卷心菜体内以活性较低的NaCl提取态、醋酸提取态和盐酸提取态为主^[13-14]；Pb在小麦、水稻、玉米和结缕草体内以活性较低的醋酸提取态和盐酸提取态为主^[15-16]。Cd富集植物长柔毛委陵菜体内的NaCl提取态、去离子水提取态、乙醇提取态Cd的含量占总Cd的86%~96%，Cd浓度的增加促使活性较高的化学形态Cd向活性较低的形态转变^[17]。随着Zn处理浓度的增加，再力花体内乙醇提取态Zn的比例显著性降低，而氯化钠提取态、水提取态Zn的比例则提高^[18]。

莎草是云南本土的重金属富集植物，具有生长快、生物量大等特点。盆栽和大田试验均表明，莎草对土壤Pb、Cd有较强的吸收和转运能力^[19]。但是对于间作体系中，两种植物体内不同化学形态的重金属含量的生理机制仍不太清楚。本研究的内容是：(1)间作对莎草和蚕豆生物量和生理指标的影响；(2)间作对莎草与蚕豆根际有效态重金属含量与体内不同化学形态重金属含量的差异与变化规律；(3)根际有效态重金属含量与莎草和蚕豆体内不同化学形态的重金属的相关性。其目的是探讨间作模式下莎草与蚕豆体内Pb、Cd、Zn的累积机制，从而为利用间作技术对重金属污染土壤的修复提供有益的参考依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试植物：莎草(Cyperus glomeratus L.)种子采自于云南会泽铅锌矿区，于3月初育苗，播种前用10%的H₂O₂对种子消毒30 min，使用烤烟基质和漂盘育苗，待苗长到6~7 cm高时，选择长势良好、大小均一的幼苗进行盆栽试验。蚕豆(Vicia faba L.)品种为“马尼拉”，购自会泽县者海镇某农贸市场，播种前用10%的H₂O₂对种子进行消毒10 min，然后播种到土壤中进行盆栽试验。

供试土壤：将云南农业大学后山山地红壤与铅锌矿矿渣土按1：1比例混匀，其理化性质为：pH 7.69，有机质26.12 g·kg^-1，全N 1.73 g·kg^-1，全P 1.92 g·kg^-1，全K 6.55 g·kg^-1，速效P 27.6 mg·kg^-1，速效K 211.9 mg·kg^-1，碱解N 56.61 mg·kg^-1，总Pb 3 427.2 mg·kg^-1，总Cd 40.0 mg·kg^-1，总Zn 825.1 mg·kg^-1。

1.2 试验设计

盆栽试验于2016年4—7月在云南农业大学东校区温室大棚中进行，采用莎草单作、蚕豆单作、莎草/蚕豆间作3种种植方式，每种种植方式设3个重复。试验用盆长、宽、高分别为50、30、30 cm，每盆装风干过2 mm筛的土壤5 kg。单作莎草和蚕豆留苗2株，株距均为20 cm；莎草/蚕豆间作留苗2株，一株莎草、一株蚕豆，莎草与蚕豆的株距为20 cm，保证与单作的密度相同。每2 d浇一次水，每次浇水以不渗漏为准。移栽后种植90 d，在植物生长旺期收获植物，收获的同时采用抖土法采集植物根际土壤，混合均匀后取适量土样带回实验室分析。

1.3 样品处理与分析

将莎草和蚕豆分成地上部和地下部(根部)两部分，先分别用自来水冲洗，然后再用去离子水冲洗干净，自然晾干后在105 ℃条件下杀青30 min，再于70 ℃烘干至恒重，分别测定干物质量。烘干样品用粉碎机全部粉碎、混匀，过0.25 mm筛并装袋备用。植物体内丙二醛的含量采用硫代巴比妥酸法测定^[20]，可溶性糖含量采用蒽酮法测定^[20]，叶绿素含量采用乙醇浸提，分光光度法测定^[20]。

土壤有效态Pb、Cd、Zn含量用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)提取(m：m=1：2)，原子吸收分光光度法测定^[18]。植物体内不同化学形态Pb、Cd、Zn的测定：准确称取鲜样0.500 0 g，严格按照以下顺序加入相关试剂：

(1) 加入80%乙醇20 mL，提取醇溶性蛋白质、氨基酸盐等为主的物质(F_E)。

研磨匀浆后转入50 mL的塑料离心管，在25 ℃恒温振荡22 h后，5000 r·min^-1离心10 min，倒出上清液。再加入10 mL 80%的乙醇，25 ℃恒温振荡1 h，5000 r·min^-1离心10 min，倒出上清液。合并两次上清液。

(2) 向(1)中第2次离心得到的沉淀中加入去离子水，主要提取水溶性有机酸盐、重金属的磷酸二氢盐[M(H₂PO₄)₂]等(F_W)。

(3) 按上法依次再加入1 mol·L^-1氯化钠，用于提取以果胶酸盐、与蛋白质呈结合态或吸着态的重金属等(F_NaCl)；加入2%醋酸，用于提取难溶的重金属磷酸盐等(F_HAc)；加入0.6 mol·L^-1盐酸，主要提取草酸盐等(F_HCl)。

经5次提取后的残渣(F_R)用少量去离子水转移至三角瓶中，于电热板蒸干，加入2 mL浓硝酸和几滴高氯酸，消煮至澄清，定容至50 mL。提取液中3种重金属形态的测定以提取剂为对照，火焰原子吸收法测定。

植物Cd、Pb、Zn累积特征用富集系数(Enrichment coefficient，EC)、转移因子(Transfer factor，TF)和生物转移因子(Biological transfer factor，BTF)表示：

1.4 数据处理

采用Duncan氏新复极差法对数据进行差异显著性分析，采用Microsoft Excel软件进行常规分析，利用Origin 9.0作图软件绘图，并采用SPSS软件进行相关性分析。

2 结果与分析 2.1 间作对莎草、蚕豆生物量与生理指标的影响

与蚕豆间作后，莎草地上部和根部生物量与单作相比显著减少(图 1)，地上部减少了54.55%(P＜0.05)，根部减少了41.67%(P＜0.05)。无论单作还是间作，莎草生物量均表现为地上部>根部。与莎草间作后，蚕豆地上部生物量相比于单作显著增加了11.71%(P＜0.05)，而根部无显著变化(图 1)。无论单作还是间作，蚕豆生物量均表现为地上部＞根部。

与单作相比，间作蚕豆后莎草叶片可溶性糖含量显著减少了36.39%(P＜0.05)，叶绿素含量显著减少了33.33%(P＜0.05)，丙二醛含量无明显变化(图 2)。与莎草间作后，蚕豆叶片的叶绿素含量、丙二醛含量与可溶性糖的含量相比于单作而言均无显著变化(图 2)。

2.2 间作对土壤有效态Pb、Cd、Zn含量的影响

与蚕豆间作后，莎草根际土壤有效态Pb的含量与单作相比显著增加了9.45%(图 3)，而Cd和Zn含量均无显著性变化。与莎草间作后，蚕豆根际土壤有效态Pb、Cd和Zn含量与单作相比均显著降低(图 3)，分别降低了14.88%、24.50%和12.38%。

2.3 间作体系中植物体内各化学提取态Pb、Cd、Zn的含量 2.3.1 Pb化学提取态含量

单作莎草地上部Pb提取态分布为F_NaCl(37.84%)＞F_R(21.21%)＞F_HAc(15.73%)＞F_HCl(12.77%)＞F_E(10.56%)＞F_W(1.89%)；间作莎草地上部Pb提取态分布为F_NaCl(33.60%)＞F_R(22.27%)＞F_E(13.90%)＞F_HAc(12.86%)＞F_HCl(12.44%)＞F_W(4.93%)。与单作相比，莎草地上部F_E-Pb的含量显著增加了23.43%，F_NaCl-Pb、F_HAc-Pb和F_HCl-Pb的含量显著减少了20.11%、30.54%、8.64%(图 4)。无论单作还是间作，莎草根部Pb提取态分布为F_NaCl(34.49%)＞F_R(18.33%)＞F_HCl(16.31%)＞F_E(13.42%)＞F_HAc(12.56%)＞F_W(4.88%)，与单作相比，间作使莎草根部F_E、F_NaCl、F_HAc、F_HCl和F_R Pb的含量显著增加了6.92%、15.48%、14.37%、17.80%、9.06%(图 4)。

单作蚕豆地上部Pb提取态分布为F_NaCl(37.15%)＞F_R(21.21%)＞F_HAc(16.21%)＞F_E(11.99%)＞F_HCl(9.67%)＞F_W(3.78%)；间作蚕豆地上部Pb提取态分布为F_NaCl(42.32%)＞F_R(23.93%)＞F_E(11.66%)＞F_HCl(10.81%)＞F_HAc(8.74%)＞F_W(2.51%)，与单作相比，间作蚕豆地上部F_E-Pb、F_W-Pb和F_HAc-Pb的含量显著减少了16%、42.6%和53.42%(图 4)。无论单作还是间作，蚕豆根部Pb提取态分布为F_NaCl(36.88%)＞F_R(20.39%)＞F_HCl(14.93%)＞F_E(12.46%)＞F_HAc(11.79%)＞F_W(3.55%)，与莎草间作后，蚕豆根部F_E-Pb、F_W-Pb、F_HAc-Pb和F_HCl-Pb的含量显著减少了23.78%、16.02%、14.35%、44.76%(图 4)。

2.3.2 Cd化学提取态含量

无论单作还是间作，莎草地上部和根部F_E-Cd均未检出。单作莎草地上部Cd提取态分布为F_NaCl(48.40%)＞F_HCl(23.39%)＞F_W(14.08%)＞F_HAc(8.97%)＞F_R(5.26%)；间作后莎草地上部Cd提取态分布为F_NaCl(49.06%)＞F_HCl(24.35%)＞F_W(15.52%)＞F_R(8.84%)＞F_HAc(2.22%)；与单作相比，间作使莎草地上部F_HAc-Cd的含量显著减少了78.92%，F_R-Cd的含量显著提高了43.45%(图 5)。无论单作还是间作，莎草根部Cd提取态分布为F_NaCl(37.69%)＞F_HCl(33.77%)＞F_W(18.86%)＞F_R(5.00%)＞F_HAc(4.67%)；与蚕豆间作后，莎草根部F_NaCl-Cd、F_HCl-Cd和F_R-Cd的含量显著增加了291.67%、30.01%和26.14%(图 5)。

无论单作还是间作，蚕豆地上部和根部F_E-Cd均未检出。蚕豆地上部Cd提取态分布为F_HCl(45.46%)＞F_W(24.87%)＞F_NaCl(16.15%)＞F_HAc(8.82%)＞F_R(4.70%)。与单作相比，间作使蚕豆地上部F_HCl-Cd的含量显著降低了10.76%(图 5)。单作蚕豆根部Cd提取态分布为F_NaCl(31.68%)＞F_HCl(31.26%)＞F_W(17.63%)＞F_HAc(13.63%)＞F_R(5.80%)；间作后蚕豆根部Cd提取态分布为F_HCl(44.63%)＞F_NaCl(24.75%)＞F_W(19.26%)＞F_HAc(8.66%)＞F_R(2.70%)。与莎草间作后，蚕豆根部F_W-Cd、F_NaCl-Cd和F_HAc-Cd的含量显著减少了25.59%、46.80%和56.74%(图 5)。

2.3.3 Zn化学提取态含量

无论单作还是间作，莎草地上部Zn提取态分布为F_HAc(28.92%)＞F_W(22.19%)＞F_NaCl(19.68%)＞F_HCl(18.94%)＞F_E(7.23%)＞F_R(3.05%)；与单作相比，间作使莎草地上部F_E-Zn的含量显著增加了12.5%，而F_NaCl-Zn和F_HAc-Zn的含量显著减少了46.37%和29.49%(图 6)。单作莎草根部Zn提取态分布为F_HAc(26.79%)＞F_NaCl(24.18%)＞F_W(23.16%)＞F_HCl(15.85%)＞F_E(6.82%)＞F_R(3.21%)；间作莎草根部Zn提取态分布为F_HAc(27.54%)＞F_W(22.69%)＞F_NaCl(22.11%)＞F_HCl(17.31%)＞F_E(7.07%)＞F_R(3.28%)。与蚕豆间作后，莎草根部F_E-Zn、F_HAc-Zn和F_HCl-Zn的含量显著增加了17.22%、16.24%和23.54%(图 6)。

单作蚕豆地上部Zn提取态分布为：F_HAc(27.93%)＞F_W(22.06%)＞F_NaCl(21.79%)＞F_HCl(18.75%)＞F_E(6.63%)＞F_R(2.84%)；间作蚕豆地上部Zn提取态分布为：F_HAc(30.29%)＞F_W(22.37%)＞F_HCl(19.20%)＞F_NaCl(16.74%)＞F_E(8.05%)＞F_R(3.34%)。与单作相比，间作使蚕豆地上部F_NaCl-Zn和F_HAc-Zn的含量显著减少了44.64%和21.86%(图 6)。单作时蚕豆根部Zn提取态分布为F_HAc(27.94%)＞F_NaCl(24.75%)＞F_W(19.22%)＞F_HCl(18.03%)＞F_E(7.00%)＞F_R(3.07%)；间作蚕豆根部Zn的提取形态分布为：F_HAc(36.02%)＞F_HCl(19.71%)＞F_NaCl(17.44%)＞F_W(16.89%)＞F_E(8.31%)＞F_R(1.62%)。与莎草间作后，蚕豆根部F_E-Zn、F_W-Zn、F_NaCl-Zn、F_HCl-Zn和F_R-Zn的含量显著减少了14.90%、37.05%、49.52%、21.68%和62.31%(图 6)。

2.4 间作对莎草和蚕豆重金属累积特征的影响

由表 1可以看出，蚕豆与莎草间作后，Cd、Pb和Zn的富集系数与蚕豆单作相比显著减少了43.75%、53.33%和39%，Zn的生物转移因子显著降低了17.39%，而转运系数均无显著性变化。莎草与蚕豆间作后，Cd的富集系数与生物转移因子与莎草单作相比显著增加了51.92%和39.23%。

2.5 土壤有效态Pb、Cd、Zn与植物体内Pb、Cd、Zn含量的回归分析

土壤有效态Cd的含量与蚕豆根部总Cd、F_NaCl-Cd、F_HAc-Cd和F_R-Cd含量呈极显著正相关(表 2)，与地上部总Cd、F_HCl-Cd和F_W-Cd呈显著正相关，与莎草根部F_W-Cd呈极显著性正相关。土壤有效态Pb的含量与蚕豆根部总Pb、F_W-Pb、F_HCl-Pb，与莎草根部总Pb、F_E-Pb、F_NaCl-Pb、F_HCl-Pb，与蚕豆地上部F_E-Pb、F_W-Pb、F_HAc-Pb，与莎草地上部总Pb、F_NaCl-Pb的含量均具有显著的正相关性。土壤有效态Zn的含量与蚕豆根部总Zn、F_E-Zn、F_W-Zn、F_NaCl-Zn、F_HCl-Zn、F_R-Zn，与蚕豆地上部总Zn、F_NaCl-Zn、F_HAc-Zn的含量均具有显著的正相关性，而与莎草体内的总Zn和不同化学形态的Zn含量均无显著的相关性。

3 讨论 3.1 间作对生物量与生理指标的影响

不同的植物品种、类别以及植物的不同组织、器官都会对重金属的耐性机理产生显著性的差异^[21]，并且大量研究表明，间作会对植物的生长发育产生两种作用：促进或者抑制。本次实验中，于单作而言，莎草与蚕豆间作后，莎草地上部和根部的生物量显著减少了54.55%和41.67%，而蚕豆地上部的生物量显著增加了11.71%，产生这种现象的原因可能是，蚕豆的竞争能力更强，莎草与蚕豆间作之后，蚕豆能够在竞争中获得更多的生长空间，并且能最大限度地获取土壤中的氮、磷、钾和水分等能源与物质，而莎草在竞争中处于劣势的状态，所以导致了其生物量显著性降低^[7]。重金属会对植物的细胞膜产生强烈的破坏作用，导致细胞的选择透性功能丧失，而使植物体内发生一系列对自身生长不利的生理生化反应^[22]，间作后莎草叶片叶绿素含量显著减少了33.33%、可溶性糖含量显著减少了36.39%，产生这种现象的原因可能是莎草与蚕豆间作后，莎草体内吸收累积了大量的重金属，Pb、Cd、Zn与叶绿体中的蛋白质结合或者取代了叶绿体中的Fe²⁺、Mg²⁺等，使得叶绿体结构与功能遭到严重的破坏、叶绿素被分解、叶绿素的合成酶被抑制^[23]，从而导致莎草的光合作用系统被损坏，造成体内不溶性糖和蛋白质的分解以及运输受阻^[24]。本次实验中，间作相比单作对两种植物体内丙二醛的含量均无显著性的变化，表明间作对两种植物的膜系统伤害程度与单作相比影响是不显著的。

3.2 间作对Pb、Cd、Zn在莎草与蚕豆体内化学形态分配的影响

研究表明，重金属离子在植物细胞中不能以大量游离态的形式存在，多是与多肽、氨基酸、磷酸盐、有机酸、蛋白质等有机物结合，以螯合物的形式存在，这些有机化合物都含有大量的金属离子配位基团，在维持重金属对植物的毒害方面具有显著性意义^[25]。采用差速离心技术与化学试剂逐步提取的方法，可将Pb、Cd、Zn的化学提取态分为乙醇提取态、去离子水提取态、氯化钠提取态、醋酸提取态、盐酸提取态、残渣态。随着提取剂极性的增强，所提取出来的Pb、Cd、Zn的活性和在植物体内迁移转化的能力逐渐减弱^[26]。本实验中，莎草与蚕豆体内的Pb以中性的氯化钠提取态为主，其次是残渣态与醋酸提取态，说明莎草与蚕豆体内Pb主要以果胶酸盐、蛋白质结合或吸着态的化学形态存在^[1]。间作后，莎草根部各化学形态Pb含量显著增加，且莎草体内Pb的总量(各种化学形态之和)大于单作(表 3)，说明间作促进了莎草对土壤中Pb的吸收，吸收的Pb主要积累在根部。同时，间作后，莎草根际土壤有效态Pb含量显著增加，回归分析表明，莎草地上部和根部Pb含量均与土壤有效态Pb含量显著正相关，所以可以推断出，莎草与蚕豆的间作体系在一定程度上改变了莎草的根际环境，活化了莎草根际土壤中的Pb，从而促使莎草吸收更多土壤中的Pb^[27]。与单作相比，间作后蚕豆根部Pb、Cd、Zn的各种化学形态含量显著降低，根部Pb、Cd、Zn总量(各种化学形态含量之和)均显著降低(表 3)，且与蚕豆根际土壤有效态Cd、Zn含量显著正相关(表 2)；间作蚕豆地上部各种化学形态Pb、Zn含量和总量(表 3)均显著减少，且与蚕豆根际土壤有效态Pb、Cd、Zn含量显著正相关(表 2)。同时蚕豆体内Pb、Cd、Zn的富集系数也显著降低，说明与莎草间作后，蚕豆体内无论是活性较强还是较弱的提取态Pb、Zn含量均显著降低，间作抑制了蚕豆对土壤Pb、Cd、Zn的吸收。同时，间作后蚕豆体内Pb、Cd、Zn的总吸收量降低了2.4%、2.5%和21.8%(表 4)。

植物对重金属的累积量为植物体内重金属含量与植物生物量的乘积。由于蚕豆生物量较大，因此，无论单作还是间作，蚕豆地上部和根部Pb、Cd、Zn的累积量均大于莎草(表 4)。这说明间作促进了蚕豆的生长，在一定程度上稀释了蚕豆体内Pb、Cd、Zn的浓度。

Cd具有毒性强、污染范围广、累积过程不可逆等特点，是农作物生长发育的非必需元素，过量的Cd不仅会对植物的正常生理功能造成损坏，进入食物链后还会对人体健康造成严重的威胁^[29]。本实验中，Cd在莎草和蚕豆体内的化学形态以氯化钠提取态和盐酸提取态为主，说明Cd在植物体内与多肽、草酸盐、果胶酸盐等多种金属配位体结合，这样既可以使游离态Cd的含量有所减少，从而使Cd的有效性和移动性显著降低，还可以使Cd²⁺沉积在细胞壁上或者将金属复合物从细胞质转移到液泡中，是植物对Cd具有较强耐性的重要机理^[30]。植物对Cd的耐受性与氯化钠提取态的含量具有显著的正相关性^[25]，莎草与蚕豆体内氯化钠提取态Cd分别占总Cd的43.05%与23.92%，说明莎草对Cd具有较强的耐受性。与单作相比，莎草体内去离子水提取态、盐酸提取态和残渣态Cd含量均有显著增加现象，蚕豆体内去离子水提取态、氯化钠提取态、醋酸提取态、盐酸提取态、残渣态Cd含量均有显著减少的现象，同时，间作后，蚕豆Cd的富集系数显著降低，而转移系数与生物转移因子的变化不明显，此现象说明重金属Cd主要存在于蚕豆根部，而可食部分(地上部)的含量显著减少。

Zn是植物生长发育的必需元素之一，参与植物细胞内某些酶的合成，在植物的生理代谢过程中有着不可忽视的重要作用，过多或过少都会导致生长发育受阻^[31]。在本次实验中，Zn在莎草和蚕豆体内的化学形态以醋酸提取态、去离子水提取态和氯化钠提取态占优，说明莎草与蚕豆体内的Zn以多种形态存在，可能与植物络合素、有机酸、多糖和金属硫蛋白等多种金属螯合物结合。与单作相比，莎草体内乙醇提取态、醋酸提取态和盐酸提取态Zn均有显著性增加的现象，蚕豆体内在5种化学提取形态下的Zn含量均有显著减少的现象，其原因可能是Zn在植物体中能与多种金属配位体结合，这些配位体通过联合作用，共同参与植物体内Zn的分布与解毒^[18]。表明间作体系会产生有机酸、蛋白质以及氨基酸等水溶态和酯溶态有机配位体，这些有机配位体在解毒Zn毒害过程中起重要作用^[32]。并且据前人研究表明：重金属Cd和Zn之间存在某种特定的交互作用，Zn能够与Cd竞争非专性粘膜上的吸附点，因此Zn含量的这种变化也可能是由于重金属Cd、Zn的复合污染造成的^[33]。因此，富集植物莎草与作物蚕豆间作，可以在一定程度上减轻重金属Pb、Cd、Zn对蚕豆的毒害作用，但Pb、Cd、Zn在莎草和蚕豆体内主要与何种配位体结合，还有待进一步研究。

4 结论

(1) 间作后莎草生物量显著降低，可溶性糖与叶绿素含量显著减少；蚕豆地上部的生物量增加。

(2) 与蚕豆间作后，莎草根际土壤有效态Pb的含量显著增加。莎草体内Pb、Cd以氯化钠提取态为主，Zn以醋酸、去离子水和氯化钠提取态为主；间作后莎草体内乙醇提取态Pb、Zn含量、残渣态Cd含量显著增加。

(3) 与莎草间作后，蚕豆根际土壤有效态Pb、Cd、Zn的含量显著增加。蚕豆体内Pb、Cd、Zn的含量和累积量，Pb、Cd、Zn的富集系数都显著降低，Pb、Cd在蚕豆各部位的化学形态以活性较低的氯化钠提取态和盐酸提取态为主，Zn在蚕豆各部位的化学形态以醋酸提取态、去离子水提取态和氯化钠提取态为主。