抗生素是现代临床应用最广泛的药物，在控制感染传播、治疗感染性疾病过程中发挥着至关重要的作用。抗生素不仅应用于人类疾病治疗，还用于畜牧业和水产养殖业。在家畜饲养中，除了用于治疗动物的传染病，还用作常规饲料添加剂^[1]。抗生素的大量生产和应用，已使其成为水环境中检测到最多的新型污染物^[2-4]。调查显示，全球许多地区的土壤和水体中都检测到抗生素药物，且种类较多，浓度呈升高趋势^[5]。进入环境中的抗生素，可改变环境中微生物种类，破坏生态系统的平衡^[6]，也可诱导出抗药菌株^[7]，通过食物等途径进入人体，对人类健康产生危害^[8-9]。

重金属是环境中典型的污染物之一，微量浓度的重金属就可产生毒性作用^[10-11]。因具有富集性和不易降解性，且对环境中的生物甚至人类健康产生有害影响，重金属污染已成为最难解决的环境问题之一，成了人们关注的热点^[12]。抗生素和重金属这两种环境污染物，在环境中经常同时被检测到^[13-14]。水体中的重金属和抗生素可能会以各种形态和浓度共存，形成各种各样的混合污染物^[15-16]。混合污染物产生的累积毒性与相互作用可能会对生态环境、甚至生物健康产生更大危害^[17-19]，如张雨^[20]和王瑞等^[21]研究发现抗生素-金属复合物之间的络合作用会改变抗生素的环境行为和生态毒理作用，络合物的毒性最强。因此，开展抗生素与重金属的联合毒性作用研究具有重要的实际环境意义。

越来越多的研究表明，除浓度外，暴露时间是影响污染物毒性的另一个重要因素，且不同的污染物随时间可能有不同的毒性变化规律^[22-24]。如氨基糖苷类抗生素及其混合物对青海弧菌（Vibrio qinghaisiense sp.-Q67，Q67）的毒性随着时间的延长而逐渐增加，而有的污染物毒性却随暴露时间的延长逐渐减弱^[25-28]。因此，要考察污染物的毒性，必须全面系统采集这些污染物在不同暴露时间对暴露生物的毒性数据才能揭示污染物间发生毒性相互作用（协同或拮抗作用）的机制，才能客观准确评价环境污染物的潜在风险^[29-30]。目前针对重金属或抗生素在某一特定暴露时间的单一毒性效应的研究已有报道^[31-32]，但关于二者复合污染的联合毒性相互作用的研究，尤其关于抗生素与重金属的多元污染物联合毒性相互作用随时间变化的动态规律的研究非常有限^[33-35]。

因此，本文以抗生素和重金属为研究对象，以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）为检测生物，采用均匀设计射线法设计抗生素与重金属的多元（九元）混合污染物体系，应用已建立的时间依赖微板毒性分析法（t-MTA）系统测定抗生素和重金属及其混合污染物体系对蛋白核小球藻的生长抑制率^[36]，运用经典参考模型浓度加和（Concentration addtion，CA）分析混合物在不同暴露时间的毒性相互作用（协同或拮抗作用），并揭示抗生素与重金属联合毒性相互作用变化规律，为科学评价重金属以及抗生素可能产生的风险提供数据参考。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

5种抗生素分别为硫酸阿米卡星（Amikacin sulfate，AMI）、硫酸庆大霉素（Gentamycin sulfate，GEN）、硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate，KAN）、硫酸巴龙霉素（Paromomycin sulfate，PAR）、妥布霉素（Tobramycin，TOB），购自上海原叶生物科技有限公司，理化性质列于表 1中。4种重金属分别为氯化镉、五水合硫酸铜、四水合氯化锰、七水合硫酸锌，均为分析纯，均购置于国药集团化学试剂有限公司，理化性质列于表 1中。

重金属和抗生素的储备液均用超纯水（Reverses Osmosis）配制，并于4 ℃冰箱中保存、备用。

主要仪器：Bio-RAD 680型酶标仪（美国Bio-RAD伯乐仪器有限公司），超净工作台（三发仪器有限公司），YX280A手提式压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司），MGC-250智能型光照培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），FA1004型五位电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）。

1.2 藻种与培养

实验藻种：蛋白核小球藻购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库（FACHB），藻的培养基配制及其培养过程参见文献[24]和[32]。

1.3 混合物实验设计

采用均匀设计射线法（UD-Ray）^[37]设计抗生素与重金属的混合物体系，共安排10条九元混合物射线（R1~R10），每条混合物射线包含的抗生素和重金属组分和各组分的浓度配比（p_i）及每条混合物射线的最高和最低设定浓度见表 2。

1.4 微板设计与时间毒性测试

微板设计与毒性测试过程参考文献[24]：在96孔透明微板（Corning，9018）的四周24孔中加入200 μL蒸馏水以防止边缘效应，于2、6、7、11列的24孔中加入100 μL的蒸馏水，在余下孔加入事先配好的12个不同浓度的污染物储备液100 μL，然后加入事先培养至对数期的蛋白核小球藻溶液100 μL，最后加透明盖，然后将微孔板置于温度为25 ℃、照度为5000 lx、光暗比14 h:10 h的光照培养箱中培养，分别在暴露时间t= 0、12、24、48、72 h和96 h时将微板放入酶标仪中，测定690 nm波长下的光密度（OD₆₉₀）。针对每一个毒物，上述微板实验操作至少重复3遍。

式中：E_i，j为污染物浓度c_i（i=1、2、3、…、12）在暴露时间终点j（j=0、12、24、48、72、96 h）对小球藻的生长速率抑制率；μ_i，j为微板中污染物浓度c_i处理孔中小球藻在暴露时间终点j时的平均生长速率；μ_0，j为微板中空白藻在暴露时间终点j（j=0、12、24、48、72、96 h）的平均生长速率。μ_j为微板孔中小球藻在某一暴露时间j（j=0、12、24、48、72、96 h）的平均生长速率；OD₆₉₀，n为微板孔中小球藻在第n个暴露时间点（n=0、1、2、3、4、5、6）的平均吸光光度值；OD_690，n-1为微板孔中小球藻在第n-1个暴露时间点的平均吸光光度值。

1.5 时间毒性数据拟合

实验数据处理方法参见文献[24]。将获得的在不同暴露时间污染物的浓度-抑制率数据运用两参数Logit函数进行非线模拟合。

式中：E表示效应（0≤E≤1）；c表示单个化合物或者混合物浓度；α和β都是参数。

由于毒性实验的固有误差，评估化合物或混合物毒性时必须考察置信区间的范围，特别是观测值的置信区间（OCI）。OCI主要用于表征实验数据的不确定度。本论文中，OCI是基于实测毒性效应，在显著性水平为0.05情况下，化合物实验浓度的可信范围，即化合物产生某一效应x%时的95% OCI。并且本文是在整个浓度-效应区域内建立整条OCI曲线。

1.6 混合物毒性相互作用分析

混合物毒性相互作用常常是参考某一标准加和参考模型来定义的，浓度加和（CA）模型能用来评估大多数混合物的毒性^[38-39]。

CA模型的公式表达为：

式中：c_i表示混合物中产生某一效应x%时组分i的浓度；EC_x，i表示混合物中第i个化合物单独存在时所产生的效应与混合物总效应x%相同时的浓度。当观测毒性等于、大于或小于参考模型预测毒性时，分别称混合物发生了加和作用、协同作用和拮抗作用。

2 结果与讨论 2.1 抗生素与重金属对蛋白核小球藻的时间毒性

不同污染物的毒性随暴露时间具有不同的变化规律^[40-41]。图 1是5种抗生素和4种重金属对蛋白核小球藻在不同暴露时间的浓度-效应曲线（CRC）。从图 1可以看出，抗生素和重金属对小球藻的毒性均随着暴露时间的延长而逐渐增强，呈现出时间依赖性。不同物质对小球藻毒性随时间变化的规律不同，如AMI、GEN、KAN、PAR、Cd、Mn和Zn均是从0时刻的没有明显毒性逐渐增强，但每个物质毒性增强的速率不同，在各个暴露时间点，几个物质的毒性不同，如在96 h，PAR的最大抑制率超过了90%，AMI和GEN的最大抑制率超过了80%，KAN、Mn和Zn的最大抑制率约60%。TOB在前三个时间点几乎没有毒性，72 h后在高浓度才有明显毒性，96 h的最高抑制率迅速达到了70%。而Cd和Cu具有急性毒性，即在12 h就呈现出了30%以上的抑制率，此后Cu的毒性逐渐增加，72 h后最大抑制率达到90%以上，此后几乎不再增加，Cd的最大抑制率在12 h后迅速增加达到了70%以上，此后增加缓慢，72 h后几乎不再增加。

研究表明，重金属对藻的毒性主要是通过改变运动器的细微结构，使核酸组成发生变化，影响细胞生长和缩小细胞体^[42]。氨基糖苷类抗生素的毒性作用是损害细胞膜，使细胞浆外漏，并作用于核糖体阻抑蛋白质合成，影响细胞生长^[43]。由此可以看出本研究中两种污染物对蛋白核小球藻的毒性作用机理相似，可以比较同一暴露时间节点的毒性大小。以pEC₅₀值（半数效应浓度EC₅₀的负对数）为毒性指标，污染物在同一暴露时间的毒性不同，且毒性大小顺序随着暴露时间延长而变化，如在12 h所有物质的pEC₅₀值均为0，在24 h除了Cd有pEC₅₀值，其余8种物质的pEC₅₀值均为0，在48 h，三种物质的毒性大小顺序为PAR＜Cd＜Cu，其余6种物质的pEC₅₀值均为0，72 h时KAN和TOB的pEC₅₀值为0，其余7种物质的毒性大小顺序为Zn＜Mn＜Cd＜AMI＜GEN＜PAR＜Cu，96 h的毒性顺序为KAN＜TOB＜Zn＜Mn＜Cd＜AMI＜GEN＜Cu＜PAR。

2.2 抗生素-重金属对蛋白核小球藻在不同时间点的联合毒性

将抗生素与重金属的九元混合物体系对蛋白核小球藻的浓度-效应数据及拟合CRC绘于图 2中。从图 2可以看出，抗生素和重金属的九元混合物射线对蛋白核小球藻的毒性，均随着暴露时间的延长逐渐增强，即具有时间依赖性，但不同浓度配比的混合物射线，毒性随时间变化的规律略有不同。如R1、R2、R3、R8和R9的毒性均随暴露时间的延长逐渐增强，24 h后增加速度较快，72 h后增加速率减慢，96 h后几乎不再增加，而余下的5条射线的毒性随暴露时间的延长，只在开始的48 h内迅速增加，此后毒性增加非常缓慢，96 h不再增加。九元混合物体系几条射线的毒性较接近TOB的毒性，可能是由于TOB所占浓度比最高（表 2），直接影响了混合物毒性随时间的变化规律。

2.3 抗生素-重金属多元混合物对蛋白核小球藻的联合毒性相互作用

CA模型能较好地评估混合物毒性^[39]。CA对10条射线在不同时间点的预测CRC与实验CRC及其置信区间绘于图 3中。由于在暴露时间12 h和24 h内，部分组分（如TOB）没有明显的毒性，因此，图 3只给出了48 h后的浓度-效应关系图。

从图 3可以看出，除了射线R5~R7的CA预测CRC部分落在实验观测置信区间的上方，表现为部分拮抗作用，其余射线的CA预测线都在实验CRC置信区间的下方，呈现明显的协同作用，但不同射线协同作用不同。R1~R3和R8、R9均呈现出明显的协同作用，而R4和R10均在48 h呈现明显的协同作用，且随暴露时间的延长而逐渐减弱甚至变为加和作用，而R5~R7在暴露时间为48 h时，CA预测CRC都落在实验CRC置信区间内，表现为经典的加和作用，随后随暴露时间的延长，CA预测线CRC落在了置信区间上限的上方，即呈现出拮抗作用，表明R5、R6和R7三条射线呈现出明显的时间依赖性拮抗作用。如前所述，两类物质作用于藻细胞的机理接近，因此大多数混合物射线呈现出明显的协同作用。同时，由于抗生素分子中含有大量的羧基、羟基、氨等基团或电子供体原子，可与金属离子发生络合作用，这种络合作用会在不同程度上改变混合污染物的环境行为和毒理效应，这可能使污染物的联合毒性增强或减弱，即产生了协同或拮抗作用^[20-21]。综上所述，混合物的相互作用的毒性大小及其变化规律不仅与组分的浓度比有关，也会随暴露时间变化而变化，这就要求我们在揭示污染物相互作用规律时，要同时考虑浓度与时间两个因素，提高生态风险评估的可信度。

3 结论

（1）9种污染物对蛋白核小球藻的毒性具有明显的时间依赖性，但不同物质对其毒性随时间变化的规律不同，毒性大小顺序也随时间不断变化。

（2）抗生素和重金属的九元混合物体系对蛋白核小球藻具有时间依赖毒性，且毒性的大小随暴露时间的延长而增强，前48 h内毒性显著增强，在48~96 h内，毒性增加幅度减小。

（3）10条抗生素和重金属的九元混合物射线对蛋白核小球藻的毒性具有时间依赖性协同或拮抗作用，射线R1~R3和R8~R9均呈现出随时间的延长而逐渐减弱的协同作用，而射线R5~R7呈现出随时间的延长而逐渐趋于明显的拮抗作用。

（4）混合物的毒性相互作用不仅与组分的浓度配比有关，也与暴露时间有关。