秸秆是我国农业生产中最主要的副产物之一，据统计，2015年全国秸秆资源量达到10.4亿t，可收集资源量为9.0亿t，其中玉米秸秆是全国各类农作物秸秆中最主要的秸秆资源^[1]。秸秆的资源化和无害化利用，是秸秆资源利用的主要研究方向^[2-3]。目前，秸秆的肥料化利用以直接还田和堆腐还田为主^[4-7]，但是这两种方式存在腐解不彻底、养分释放量少等缺点^[8]。因此，通过秸秆快速腐解达到提高秸秆利用率的目的已成为秸秆肥料化利用的热点问题。

近年来，由美国农业部林产品研究所和美国威斯康星大学麦迪逊分校合作开发的亚硫酸盐法（Sulfite Pretreatment to Overcome Recalcitrance of Lignocelluloses，SPORL法）处理木质纤维素类原料^[9-11]，对促进原料的酶水解及提高糖化产率具有较好的效果^[12-14]。SPORL法是在高温条件下，利用亚硫酸盐或亚硫酸氢盐作为催化剂对原料进行处理，进而使原料中的木质素发生磺化反应生成木质素磺酸盐，以增加木质素的亲水性，使秸秆中复杂难分解的有机物质快速分解成小分子物质^[15]；木质素磺酸盐氧化和水解的产物为木质素腐植酸盐，与天然腐殖质相比，其氮含量较低，磺酸基比例较高，但两者较为相近，可将木质素腐植酸认为是天然腐殖质的类似物^[16-17]，预处理过程可视为强制腐殖化过程。目前SPORL法用于秸秆能源化的前处理和秸秆造纸行业的研究较多^[18-22]。朱文远等^[23]采用酸性亚硫酸氢钠对棉杆进行处理，并对棉杆的酶水解效率和棉杆组分溶出规律进行研究，发现酸用量和亚硫酸氢钠用量的增加可以提高纤维素的降解溶出和木质素的磺化溶出；王德汉等^[24]以造纸黑液为原料，使其与亚硫酸钠进行磺化改性后引入锌微量营养元素，制成螯合锌肥，在石灰性土壤上施用，这种肥料的生物有效性高于无机锌肥，且具有供锌平稳、缓释的特点。SPORL法直接对玉米秸秆进行处理并对固体产物有机质含量变化及腐殖化程度的研究未见报道。

本研究利用SPORL法处理玉米秸秆的基本原理对原料进行预处理，结合响应面优化法（Response Surface Methodology，RSM）^[25-26]，以固体产物的有机质含量作为评价指标，首先筛选出一种最优催化剂，并根据催化剂筛选结果，对催化剂的用量、反应温度进行单因素试验，确定各单因素的条件范围，在此基础上优化反应条件，最后对预处理固体产物的腐殖化进行分析，以期为SPORL法对玉米秸秆预处理后的固体产物能够合理利用提供理论指导和相关的数据支持。

玉米秸秆取自吉林农业大学农安试验田，自然风干，粉碎，过60目筛。供试秸秆的有机碳为436.43 g·kg^-1。

根据SPORL法的经典工艺流程^[9-10]，本试验对其进行改进，如图 1所示。分别以亚硫酸铵、硝酸-亚硫酸铵、氢氧化钾-亚硫酸铵作为催化剂，对它们的催化效果进行比较筛选。根据文献[27-28]以及预实验结果，设计4个处理：（1）亚硫酸铵：亚硫酸铵用量15%（相对于原料干质量，m/m，下同）；（2）酸性亚硫酸铵：硝酸用量5%（V/V，下同）+亚硫酸铵15%；（3）碱性亚硫酸铵：氢氧化钾用量5%（W/V，下同）+亚硫酸铵15%；（4）对照组。每个处理3次重复。其他处理条件为：液料比10:1（V/m，下同）、反应温度120 ℃，达到设定温度后保温2 h，将秸秆置于高温高压反应釜内，分别加入催化剂，密闭反应釜，并开始加热；反应结束后，待反应釜降至常温，取出釜内秸秆，用200目尼龙网袋进行过滤分离，并洗至中性，液体产物收集后置于4 ℃冰箱中，用于后续分析，固体产物烘干后对其有机质含量进行测定分析。

图 1 SPORL 法工艺路线改进 Figure 1 The process improvement route of SPORL

图选项

硝酸的用量分别为0、1%、3%、5%、7%、9%，亚硫酸铵用量为15%，反应温度120 ℃，其他试验步骤同1.2。

亚硫酸铵用量分别为0、5%、10%、15%、20%、25%，硝酸用量为5%，反应温度120 ℃，其他试验步骤同1.2。

试验反应温度分别设为120、130、140、150、160、180 ℃，硝酸用量为5%，亚硫酸铵用量为15%，其他试验步骤同1.2。

根据单因素试验结果，借助Design-Expert软件对响应面试验进行设计分析及条件优化，以硝酸用量、亚硫酸铵用量、反应温度作为3个自变量，分别记为A、B、C，每个因素取3个水平，设计共17个试验点的响应面分析试验，以秸秆固体产物有机质含量（Y）作为响应值，建立回归方程；并与响应面模型进行拟合，按照模型预测得到的参数进行秸秆SPORL法预处理的验证试验，比较秸秆固体产物有机质含量的预测值与实测值，验证模型的可靠性，以确定最后的优化结果。

有机质含量的测定采用重铬酸钾容量法^[29]。玉米秸秆固体产物中类腐殖质（HLE）的提取与测定参照土壤腐殖质组成修改法^[30]进行组分（类胡敏酸HLA、类富里酸FLA）提取，其提取物的含碳量均采用重铬酸钾容量法测定。实验数据利用Design-Expert 8.05b分析软件建立多元二次模型方程。

以亚硫酸铵、酸性亚硫酸铵和碱性亚硫酸铵作为催化剂，在高温高压反应釜内对玉米秸秆进行处理，各催化剂对固体产物有机质含量的影响见图 2。由图 2可知，各催化剂处理组固体产物的有机质含量高于对照组，酸性亚硫酸铵处理组的有机质含量高于其他催化剂处理组，其有机质含量达到688.10 g·kg^-1。结果表明，催化剂在高温条件下可以提高秸秆固体产物有机质含量。玉米秸秆的木质纤维素结构是由纤维素、半纤维素、木质素构成，它们之间存在着不同的化学键，致使木质纤维素的结构紧密、性质稳定，在催化剂的作用下，木质纤维素之间的酯键、氢键等化学键断裂；酸性条件使木质纤维素进行酸性水解，纤维素和半纤维素的聚合度下降；酸性亚硫酸铵作为催化剂起作用的活性基团是SO₃^2-和HSO₃^-，使玉米秸秆中木质素结构单元的酚型和非酚型α-醚键断裂，α-碳原子被磺化，磺化反应引进了磺酸基，形成木质素磺酸盐，其在达到适宜温度并持续保温一段时间后可以转化为木质素腐植酸盐，从而使有机质含量增加。碱性亚硫酸铵处理组的有机质含量低于酸性亚硫酸铵处理组，可能是由于碱性亚硫酸铵只能使木质素中酚型α-醚键断裂，降低磺化反应的反应程度，使木质素磺酸盐的生成量低于酸性亚硫酸铵处理组；同时，固体产物中的类腐殖质部分溶于碱性溶液中，从而使有机质含量低于酸性亚硫酸铵处理组并高于对照组。此外，亚硫酸铵水解呈弱碱性，酸性处理条件可以对产物起到中和作用，而碱性亚硫酸铵处理组的后续处理难度较大、能源消耗过多。综上所述，选定酸性亚硫酸铵作为预处理催化剂。

图 2 不同催化剂对秸秆固体产物有机质含量的影响 Figure 2 Effects of different catalysts on organic matter content of straw

图选项

硝酸用量对固体产物有机质含量的影响见图 3。从图中可以发现，硝酸用量在0～5%之间时，有机质的含量随着硝酸用量的升高而升高；硝酸用量达到5%时，有机质含量达到706.83 g·kg^-1；而当硝酸的用量大于5%时，有机质含量呈下降趋势且趋势明显。硝酸用量对固体产物有机质含量的影响较为显著，这可能是由于硝酸的加入使反应体系呈酸性，破坏玉米秸秆木质纤维素之间的化学键，同时加快磺化反应进程；在酸性环境下，木质素的结构单元中存在的亲核部位与亲核试剂（SO₃^2-或HSO₃^-）一起对正碳离子的亲电中心进行竞争发生缩合反应，缩合后的木质素在缩合的部位难以再发生磺化反应，从而抑制了木质素磺酸盐的生成及其腐殖化进程；随着硝酸用量的增加，反应体系中pH逐渐降低，木质素的缩合反应愈加增多，导致固体产物中有机质含量降低。图 3中秸秆固体产物有机质含量在较高范围的硝酸用量是3%～7%。

图 3 硝酸用量对固体产物有机质含量的影响 Figure 3 Effects of nitric acid content on organic matter

图选项

亚硫酸铵用量对固体产物有机质含量的影响见图 4。亚硫酸铵的用量达到10%时，固体产物的有机质含量达到710.10 g·kg^-1。亚硫酸铵用量对固体产物有机质含量的影响可能是由于亚硫酸铵的加入使反应体系引入了大量的SO₃^2-和HSO₃^-，促进木质素的磺化反应，生成木质素磺酸盐，木质素磺酸盐在高温条件下经过一定的保温时间，能够生成天然腐殖质的类似物木质素腐植酸盐，使固体产物的有机质含量增多。当亚硫酸铵用量大于10%时，固体产物有机质含量变化趋于平稳，这一现象的出现推测是由于在当前温度条件下，亚硫酸铵用量的增加使引入的磺酸基含量持续增多，被磺化的木质素达到饱和状态，可被腐殖化的木质素磺酸盐含量不再发生变化，最终固体产物中有机质含量的变化幅度变小。因此，由图 4可以确定亚硫酸铵用量的范围是10%～20%。

图 4 亚硫酸铵用量对固体产物有机质含量的影响 Figure 4 Effects of ammonium sulfite content on organic matter

图选项

反应温度对固体产物有机质含量的影响见图 5。由图可知，反应温度低于140 ℃时，固体产物有机质含量随着温度的升高而增加，140 ℃时达到最大值，为716.53 g·kg^-1；当反应温度高于140 ℃时有机质含量降低的幅度也随之增加。有研究表明反应温度的变化可以使木质素的磺化和溶出呈现明显的阶段性，主要分为两个阶段：（1）当反应温度低于140 ℃时，固体产物有机质含量的变化可能是由于温度的升高使反应体系中分子活性增大和有关离子（磺化剂和盐基）的大量浸透，加剧了木质素的磺化反应，使其逐步形成固态木质素磺酸盐，同时温度变化促进了木质素磺酸盐的腐殖化进程，此时木质素的磺化速率大于溶出速率。（2）温度的持续升高使木质素的磺化反应继续进行，生成的木质素磺酸盐亲水性增强，加快了木质素磺酸盐的溶出速率，此时溶出速率大于磺化速率，导致固体产物中有机质含量的不断下降。由图 5可以确定秸秆固体产物有机质含量在较高范围的反应温度为130～150 ℃。

图 5 反应温度对固体产物有机质含量的影响 Figure 5 Effects of reaction temperature on organic matter

图选项

综上，经过对单因素试验结果的分析，硝酸用量为3%～7%、亚硫酸铵用量为10%～20%、反应温度在130～150 ℃之间时，玉米秸秆固体产物有机质含量达到较高的范围。

为进一步优化玉米秸秆SPORL法预处理的反应条件，借助Design-Expert软件对响应面试验进行设计并分析，以硝酸用量、亚硫酸铵用量及反应温度作为3个影响因素，按照最佳单因素处理条件，利用响应面分析法中的Box-Behnken试验设计原理进行响应面分析试验，试验设计和结果见表 1。通过对试验数据的多元二次回归拟合，可以得到硝酸用量（A）、亚硫酸铵用量（B）、反应温度（C）与固体产物有机质含量（Y）的二次回归方程，如下：

Y=761.40+16.99A+40.85B+8.49C+4.90AB-6.78AC+2.2BC-26.19A²-15.11B²+2.41C²

表 1 响应面试验设计和结果 Table 1 Results of RSM experiments

表选项

由方差分析可以得到，该模型和实际数值的拟合度较高，且回归方程中各因素与响应值之间进行的拟合效果较好、试验误差较小。该回归方程系数的显著性分析表明，变量A、B、C对响应值的线性效应达到极显著水平，A、B的二次项以及交互项AB、AC对响应值的影响呈显著水平。

响应面法的三维曲面图，能够直观地反映各因素之间的交互效应对响应值的影响。通过对数据的拟合分析可以得到硝酸用量、亚硫酸铵用量、反应温度对固体产物有机质含量的三维曲面图，见图 6。由图 6a可知，当硝酸用量为7%、亚硫酸铵用量为20%、反应温度为140 ℃时，有机质含量为最大值786.80 g·kg^-1，硝酸用量和亚硫酸铵用量的交互作用影响显著，这可能是由于单纯增加硝酸用量会加剧木质素的缩合反应，而在亚硫酸铵作用下，适当的硝酸用量可以使固体产物有机质含量升高。图 6b中，当亚硫酸铵用量不变，硝酸用量为5%，反应温度为140 ℃时，图中有一顶点为最大值764.80 g·kg^-1。由此可知，硝酸用量与反应温度共同作用能够增加固体产物有机质含量。图 6c中发现，较温度相比，亚硫酸铵用量的效应面曲线较陡，等高线变化幅度较大，说明此时亚硫酸铵用量对有机质含量的影响较温度更为显著。图 6中，在每个响应面图中找到的一个顶点，代表响应值在所考察范围内存在的极值。

图 6 各因素交互作用的三维曲面图 Figure 6 Each factor and its interaction in response surface chart

图选项

通过响应面及回归模型的分析结果，在试验因素的水平范围之内，可以确定最优试验条件：硝酸用量5.37%、亚硫酸铵用量18.03%、反应温度150 ℃，在此条件下固体产物有机质含量预测值为794.40 g·kg^-1。基于操作的可行性，将优化条件进行改进，结果为硝酸用量5.4%、亚硫酸铵用量18%、反应温度150 ℃，并进行3组平行验证试验，试验结果为有机质含量788.70 g·kg^-1，验证试验结果与预测值的偏差为5.70 g·kg^-1，实测值与预测值接近，该回归方程对固体产物有机质含量的分析预测可靠准确。

SPORL法预处理玉米秸秆发生磺化反应生成木质素磺酸盐，而在达到适宜温度并持续一定时间的同时，可以进行木质素磺酸盐向腐殖质类似物的转化，类腐殖质各组分的数量变化如表 2所示。经SPORL法预处理的玉米秸秆固体产物的HLE和HLA数量增长明显，而FLA数量由8.17 g·kg^-1降低至1.54 g·kg^-1。HLA和FLA是类腐殖质的主要组分，是由脂肪族和芳香族结构聚合而成的高分子化合物。HLE和HLA的增长说明了SPORL法预处理促进了玉米秸秆固体产物中类腐殖质的形成。FLA是类腐殖质中分子量较小、活性较大、氧化程度较高的组分，预处理过程中，硝酸的加入、反应温度的升高以及后续的水洗步骤都是导致FLA数量降低的重要原因。HLA/FLA是表征玉米秸秆固体产物稳定度的重要指标，HLA/FLA的升高说明经过SPORL法预处理可以使玉米秸秆固体产物腐殖化程度提高。

表 2 玉米秸秆固体产物腐殖化分析 Table 2 Results of RSM experiments

表选项

（1）酸性亚硫酸铵预处理玉米秸秆后的固体产物有机质含量较高。

（2）单因素试验可以确定硝酸用量在3%～7%范围内、亚硫酸铵用量在10%～20%范围内、反应温度在130～150 ℃范围内，秸秆固体产物有机质含量较高。

（3）通过对预处理反应条件的优化，得到最佳预处理条件为硝酸用量5.4%、亚硫酸铵用量18%、反应温度150 ℃。

（4）SPORL法预处理可以增加玉米秸秆固体产物类腐殖质、类胡敏酸数量，并提高其腐殖化程度。