土壤重金属污染，尤其重金属复合污染，具有影响范围广，持续时间长，隐蔽性强，不易被发现且不可逆的特点^[1]。植物修复作为清洁、有效的土壤污染修复方法，被广泛应用，但是重金属也会对植物本身造成毒害^[2]，导致植物枯萎甚至死亡。植物可以通过自身解毒机制特别是抗氧化酶系统来减轻这种危害，对于具有一定重金属富集能力的植物，例如龙葵、东南景天等植物对重金属表现出很强的耐性和抗性^[3-5]。国内外研究表明，植物抗氧化酶系统可以清除重金属产生的活性氧自由基，其中最主要的抗氧化酶是过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）^[6]，3种抗氧化酶随着重金属种类^[7-8]、浓度^[9]和植物类型不同^[10]，分别表现为激活或抑制作用。在一定重金属胁迫水平下SOD活性和细胞内的活性氧自由基水平呈正相关，POD活性与植物体内重金属浓度呈正相关^[11]。

黑麦草（Lolium perenne L.）是我国北方常见的优质草坪草，种植方便，有很强的再生能力，不仅对多种重金属有很好的富集能力，而且对重金属胁迫有很强的耐性和抗性^[12-13]。研究表明，黑麦草抗氧化性酶对土壤重金属污染都有明显响应，单一重金属污染可以激发CAT、SOD、POD活性，重金属复合污染对酶活性增加具有协同作用^[14-15]。其中，Cd对黑麦草SOD、POD活性都有激活作用，呈现出先增加后降低的趋势^[16]，Pb在低浓度、短时间内可以使黑麦草SOD活性明显升高，但POD活性随着Pb浓度升高随之降低^[17]。以前的研究多集中在单一重金属或两两复合重金属污染上，对多种重金属复合污染植物抗性酶响应机制研究较少，因此可以探索利用黑麦草抗氧化酶对重金属污染的响应特征，筛选敏感性指示指标来预报土壤重金属污染程度^[18]。

鉴于重金属复合污染在环境中普遍存在，许多环境效应都无法采用单一污染物机理来解释，因此本研究选择土壤中污染严重的Cd、Zn和Pb作为污染来源，采用复合和交互正交实验方法，以黑麦草为实验生物，研究重金属复合污染对黑麦草抗氧化酶活性的影响，以期为土壤重金属污染植物修复和污染识别提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 土壤样品

土壤采自陕北延安镰刀湾地区黄土，采用多点布设方法采取0~20 cm表层黄土，装入密封袋中带回实验室风干，去除碎石、植物残根等。然后过20目筛，存放待用。按土壤农化的常规分析法^[19]测得土壤的理化性质见表 1。土壤中重金属含量采用微波消解-ICP-MS（NexION 350X，PE，美国）测定；称取土壤样品0.150 0 g，采用HNO₃-HCl-H₂O₂微波（MDS-10，上海新仪）法消解，同时制作空白，并用标准液进行校正，同时采用国家标准土样（GSS-8）进行质量控制，回收率为97%~103%，RSD≤5%。所有酸均为优级纯，水为超纯水（>18.2 MΩ）。

1.2 实验设计

选取3种植物抗氧化酶CAT、POD、SOD为指示指标，Cd、Zn、Pb的量和培养时间作为实验因素，设计正交实验因素和水平表（如表 2）。Cd、Zn、Pb和时间复合作用实验采用L₁₆（4⁵）复合正交表，3种重金属交互作用实验采用L₈（2⁷）交互正交表。重金属指标水平设计参照土壤环境质量标准（GB 15618—2008）和相关文献确定^{[14, 16-17]}，Cd、Zn、Pb分别以CdCl₂·2.5H₂O、Zn（NO₃）₂·6H₂O和Pb（NO₃）₂配制水溶液的形式加入到土壤中，充分搅拌，平衡3周后待用，每处理3个重复。

黑麦草种子先用1%酒精消毒2 min，再用去离子水清洗，然后浇湿放入光照生化培养箱（PGX-450L，宁波赛福），在光照充足恒温处发芽。待7 d发芽后移植到花盆中，每盆保留幼苗30株，每日早晚浇水，保证含水率为田间含水率的60%。1周后施入少量N、P肥，植物发育吸收后每7 d对植物叶片进行采样，在植物生长期35 d内共采样4次，按照1.3测试方法测试样品。

1.3 测试指标与方法

称取1.0 g左右新鲜叶片测定抗氧化酶（SOD、POD、CAT）指标：参照Marklund等^[20]测定方法，将叶片放入冷冻钵体中，加入磷酸溶液，在冰浴下研磨成浆，冷冻离心后取酶上清提取液，由抑制剂氮蓝四唑（NBT）在光下还原作用来确定SOD活性，一个酶活性单位由NBT光还原50%来表示；参照Polle等^[21]测定方法，用愈创木酚比色法测定POD活性，以1 min内470 nm吸光度变化0.01单位来表示酶活性；测量酶上清液240 nm下吸光率的变化速度来反映过氧化氢分解，以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位，用紫外分光光度法（DR6000，HACH，日本）测定CAT活性^[22]。

1.4 数据处理

采用Excel 2007进行数据处理，采用SPSS v22.0进行正交实验方差和差异显著性分析（Duncan，P＜0.05），采用Origin8.5作图。

2 结果与分析 2.1 Cd、Zn、Pb复合作用对黑麦草抗氧化酶活性的影响

由表 3可知，在表中16组实验数据中，T6组的CAT活性值最大，T3组的POD活性值最大，T4组的SOD活性值最大。由极差分析可知，各实验因素对CAT影响顺序依次为培养时间>Cd>Zn>Pb；对POD影响顺序依次为培养时间>Pb>Zn>Cd；对SOD影响顺序依次为培养时间>Pb>Zn>Cd；由此可见，培养时间对植物3种抗氧化酶都是主要影响因素，重金属Cd对CAT活性有较大影响，Pb对POD、SOD活性有较大影响。

表 4中的复合作用方差分析结果显示，3种氧化酶活性对Cd、Zn、Pb均无显著响应（P＞0.05）。培养时间对CAT活性有较显著影响（P＜0.1），对POD活性和SOD活性有显著影响（P＜0.05）。同时，结合表 3可以得出，CAT对Cd、Zn的方差和较大，对Cd、Zn浓度响应较敏感，当Cd为10 mg·kg^-1，Zn为150 mg·kg^-1的较小浓度时，CAT活性值达到最大3 731.4 U·min^-1·g^-1 FW，表明低浓度的Cd、Zn对CAT活性具有激活作用；POD、SOD对Pb的方差和较大，表明POD、SOD对Pb较敏感，当Pb为500 mg·kg^-1，POD活性值达到最大2 757.6 U·min^-1·g^-1 FW，当Pb为900 mg·kg^-1，SOD活性值达到最大1 577.8 U·min^-1·g^-1 FW，表明中浓度的Pb对POD活性具有激活作用，高浓度的Pb对SOD活性具有激活作用。

2.2 Cd、Zn、Pb的交互作用对黑麦草抗氧化酶活性的影响

如表 5可知，在交互正交实验8组数据中，S3的CAT活性值最大，S8的POD活性值最大，S4的SOD活性值最大。由极差分析可知，各实验因素对CAT影响顺序依次为Zn×Pb>Cd×Zn>Pb>Cd×Pb>Zn>Cd；对POD影响顺序依次为Zn>Pb>Cd×Pb>Cd×Zn>Cd>Zn×Pb；对SOD影响顺序依次为Cd×Zn>Zn×Pb>Pb>Cd×Pb>Cd>Zn。

由表 6中方差分析结果可知，Cd、Zn、Cd×Zn、Pb、Cd×Pb、Zn×Pb这些因素都对SOD活性有显著影响（P＜0.05），对CAT活性和POD活性无显著影响。

2.3 Cd、Pb和Zn主效应对黑麦草抗氧化酶活性的影响

重金属浓度对抗氧化酶活性影响如图 1A~图 1C所示，不同培养时间对抗氧化酶活性影响如图 1D所示。图 1A表明，CAT活性在Cd不同浓度水平均与对照有显著差异（P＜0.05），在Cd浓度为10 mg·kg^-1时酶活性最高，为对照的225%，后随Cd浓度增加酶活性逐渐降低趋于平稳。POD活性在Cd浓度为30、50 mg·kg^-1时与对照有显著差异（P＜0.05），分别为对照的127%和138%。SOD活性在Cd不同浓度下均比对照值低，在Cd浓度为10、50 mg·kg^-1时明显小于对照（P＜0.05），分别为对照的78%和56%。说明随着Cd浓度增加，CAT、POD活性逐渐升高，起激活作用，SOD活性总体呈降低趋势，有明显的抑制作用。

图 1B表明，Zn浓度在150 mg·kg^-1时CAT活性最高，为对照的138%，在550 mg·kg^-1时为最低，是对照的71%。POD活性在Zn浓度350 mg·kg^-1时最高，为对照的114%，550 mg·kg^-1时最低，为对照的78%。SOD活性在Zn浓度150、550 mg·kg^-1时与对照有显著差异（P＜0.05），分别为对照的191%和206%。说明随着Zn浓度的增加，总体来看，对CAT、POD活性为先升高后降低，起抑制作用，对SOD先升高然后降低再升高，起激活作用。

图 1C表明，CAT活性在Pb浓度为100、500、900 mg·kg^-1时与对照有显著差异（P＜0.05），分别为对照的77%、72%和54%。POD活性在Pb浓度为100、500 mg·kg^-1时与对照有显著差异（P＜0.05），分别为对照的132%和123%。SOD活性在Pb浓度为100、500、900 mg·kg^-1时与对照有显著差异（P＜0.05），分别为对照的49%、70%和149%。说明CAT活性随Pb浓度升高逐渐降低，起抑制作用，POD活性在低浓度升高，高浓度降低，为先促后抑作用；SOD活性先降低后升高，在高浓度下表现为激活作用。

图 1D表明，从14 d到35 d，CAT和SOD活性随着时间增长，酶活性一直在升高，起激活作用，CAT和SOD活性在35 d时达到最高，分别为对照的527.5%和637.4%。对POD活性来说，在第21 d时酶活性下降。在第28 d时酶活性明显升高，达到对照的260%，第35 d时酶活性又下降，POD活性随时间的变化先低后高，随着时间上下波动并逐渐平稳。

3种抗氧化酶和重金属浓度之间的多元回归方程如式（1）~式（3）所示。从式（1）~式（3）可得，Cd对CAT、POD、SOD活性的回归系数分别为141.2、140.2、-81.7，Cd表现为对CAT、POD活性的激活作用，对SOD活性的抑制作用。同理，Zn、Pb表现为对CAT、POD活性的抑制作用，对SOD活性的激活作用。多元回归方程的分析结果与以上方差分析结果相符。

式中：Y_CAT、Y_POD、Y_SOD分别代表CAT、POD、SOD 3种植物抗氧化酶值。

3 讨论

重金属污染对植物抗氧化酶的影响已经有所报道^[23-27]。CAT、POD、SOD抗氧化酶是植物适应外部污染胁迫的保护性酶，在外部重金属胁迫下可以协同清除由其产生的活性氧基团（Reactive Oxygen Species，ROS），从而保护植物细胞不受到破坏^[28-29]。在本研究中，单一变异源Cd、Zn、Pb对3种植物抗氧化酶活性影响变化不大，但Zn和Pb相比较Cd来说，对POD活性影响较显著，当Zn浓度为550 mg·kg^-1时，POD活性仅比对照下降了21.7%，当Pb浓度为900 mg·kg^-1时，POD活性仅比对照下降了10.9%，无显著变化，表明POD在去除Zn和Pb引起的自由基中起主要作用^[16]，这与徐卫红等^[14]、王晨等^[30]的研究结果一致。本研究中，正交复合实验设计下，低浓度Cd、Zn对CAT酶活性具有较大影响，中、高浓度的Pb对POD、SOD酶活性具有较大影响，而培养时间对3种抗氧化酶活性具有显著影响，随着培养时间的延长，CAT和SOD活性呈升高趋势，表明这2种抗氧化酶一直都在起着清除植物体内自由基的作用。且在长时间（28 d和35 d）重金属胁迫下，CAT和SOD都显著高于对照（P＜0.05），表现为随时间的激活效应。在正交交互实验中，CAT活性对Zn×Pb、Cd×Zn交互作用最敏感，POD活性对Zn、Pb及Zn×Pb交互作用最敏感，SOD活性对Cd×Zn、Zn×Pb交互作用最敏感，这与单一重金属胁迫下黑麦草抗氧化酶活性变化有所不同^{[8, 16-17]}，表明在复合重金属污染下，酶活性并非单一重金属影响之和，而是表现为协同或拮抗作用，激发了植物抗氧化酶长期处于较高水平，防止膜脂过氧化作用而导致细胞死亡。重金属交互明显增强了CAT、SOD酶活性响应，这一结果可能与黑麦草细胞解毒机制以及重金属之间的交互作用相关^[31]。

植物在重金属胁迫下，可以通过多种机制和途径消除重金属产生的毒害，特别是通过抗氧化酶清除过量的ROS，达到解毒的目的^[32]。本研究交互实验的结果显示，重金属Cd、Zn、Pb复合污染对SOD活性影响最显著（P＜0.05），尤其是Cd×Zn，其次是Zn×Pb，Zn的存在可以加大Cd、Pb对植物抗氧化酶的影响，尤其是增强SOD酶活性，这与董冰冰研究黑麦草得出SOD是重金属耐性敏感指标结果一致^[33]。SOD对3种重金属复合污染具有明显的响应，这可能是因为抗氧化酶SOD最先被激活用来去除氧化自由基O-2·，其去除产物H₂O₂进一步被抗氧化系统中CAT、POD转化^[34]，因此黑麦草抗氧化性酶SOD对重金属污染敏感性大于CAT和POD。

4 结论

（1）Cd、Zn、Pb复合污染下，黑麦草抗氧化酶产生了不同程度的响应。Cd表现为对CAT、POD活性的激活作用，对SOD活性的抑制作用。Zn、Pb表现为对CAT、POD活性的抑制作用，对SOD活性的激活作用。相对于3种重金属来说，培养时间对CAT、POD、SOD活性影响显著，特别是对POD活性的影响最大。

（2）在Cd、Zn、Pb污染胁迫下，SOD活性对3种重金属及其交互作用最敏感（P＜0.05），尤其是Cd×Zn、Zn×Pb共同作用时，因此在黑麦草抗氧化酶中可以选取SOD作为重金属单独或复合污染程度的指示指标。