甲烷（CH₄）是大气中的一种温室气体，对全球变暖贡献约占17%，仅次于CO₂，具有比CO₂更高的年增长速率及更强的红外吸收能力。以百年时间为尺度，一分子CH₄的增温潜势为CO₂的26倍^[1-2]。过去200年来，人类活动导致大气CH₄浓度增加，至2016年大气CH₄浓度已上升到1.85 µL·L^-1，是工业革命前的2.57倍^[3]。

土壤是大气CH₄主要的陆地汇，在全球碳循环中起着不可忽视的作用。不同的生物群落环境氧化吸收CH₄的能力是不同的。碳（C）、氮（N）、磷（P）是重要的生长元素，无论是作为结构性元素还是养分元素，在探究生物系统物质和能量循环以及多元素平衡过程中都发挥着重要作用，并对该过程具有良好的指示作用^[4]。目前，关于外源氮添加对于土壤CH₄氧化的研究已有很多报道，大致分为促进、抑制亦或无显著影响3种情况。Maljanen等^[5]研究表明大气N沉降明显促进了土壤CH₄吸收与氧化，产生这种现象的原因可能是在土壤N元素含量较低时，在土壤N素不足以为CH₄氧化菌生长提供所需N源的条件下，为了维持其稳定的CH₄氧化能力，此时若在土壤中加入适量N则可适当减缓因N源缺乏而对CH₄氧化菌生长的限制，进一步刺激CH₄氧化菌的活性，促进CH₄氧化菌进一步生长繁殖，加快土壤CH₄氧化速率^[6]。也有研究表明外源N的添加会抑制土壤CH₄氧化^[7]，可能是因为外源N的输入，渗透压过大使土壤中的微生物导致生理缺水无法进行正常的生理活动，进而影响CH₄氧化菌氧化吸收CH₄，从而表现为外源N的输入对土壤CH₄氧化产生抑制作用^[8]。Zhang等^[9]通过研究发现，在外源N（NH₄NO₃）的添加下，亚热带鼎湖山的针叶阔叶林土壤CH₄氧化速率并没有发生显著变化。这可能是因为在N含量相对较低的土壤中，输入的低含量N大多数被植物所吸收。关于外源P添加对土壤CH₄氧化影响的研究主要集中在增施P肥对稻田与森林土壤CH₄氧化的影响^[10]，研究结果均表明外源P肥对土壤CH₄氧化具有明显的促进作用。这主要是由于在植物的生长发育中P起着重要的作用。P也是土壤微生物细胞中细胞膜的必要组成元素之一，土壤中的微生物可以通过利用P来提高土壤的养分吸收和物质循环。在一些热带地区P被认为是其基本生态系统过程中最主要的限制元素，热带森林土壤中的P常常受到限制^[11]。Liu等^[12]也发现P肥的施用能够使热带森林土壤中微生物的生物量显著增加。P缺乏能够抑制土壤中微生物的活性^[13]，外源P的添加可以显著提高土壤微生物的呼吸速率^[14]。目前，有关外源N、P含量对土壤CH₄氧化影响的研究较少，且对于N、P同时添加对外源N抑制土壤CH₄氧化缓解的研究还少见报道。

海南岛是荔枝的主要产区，截至2011年，海南省荔枝的种植面积已达2.4万hm^2[15]。荔枝可种植于多种类型的土壤上，有研究表明荔枝园土壤对大气CH₄具有较强的氧化吸收能力^[16]。随着荔枝园有机肥施用日渐减少，化肥施用日渐增多，施用N肥、P肥对土壤原生动物群落有很大影响^[17]，已有的一些研究多是土壤对大气CH₄的氧化吸收能力及施肥对土壤P含量、微生物群落结构的影响。而探讨外源N、P含量及外源N、P同时添加对荔枝园土壤CH₄氧化能力的研究鲜有报道。因此，在探索不同类型荔枝园土壤对N、P肥养分需求的基础上，研究外源N、P添加对旱地不同类型荔枝园土壤CH₄氧化的影响，对土壤CH₄氧化吸收及全球温室效应的响应具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 研究区概况

海口位于19°32′~20°05′N，110°10′~110°41′E，地处海南岛北部，属于热带海洋气候，年平均气温24.3 ℃，平均降水量2067 mm，平均相对湿度81.7%，是中国热带土壤分布最集中、土壤资源最丰富的地区^[18]。荔枝林是该区的主要经济林之一。本研究分别从海南省海口市具有代表性的3个荔枝园进行土样采集：湿润玻璃火山灰土（H3），海口市琼山区永兴镇雷虎村荔枝园，质地为砂土，土壤呈黑色；暗红湿润铁铝土（T2），海口市琼山区大致坡镇美训村荔枝园，质地为黏土，土壤呈红棕色；简育湿润铁铝土（T3），海口市琼山区三门坡镇荔枝园，质地为黏土，土壤呈黄棕色。

1.2 土壤采集与N、P添加

2016年5月分别从海口市永兴镇雷虎村、大致坡镇美训村、三门坡镇东南5 km处的3个荔枝园耕作层采集5~15 cm土壤^[19]，剔除可见的根系等杂物，过2 mm筛，风干备用，一部分用于土壤基本理化性质的测定（表 1），另一部分用于室内培养试验。

试验选用的N、P形态分别为硫酸铵（[NH₄）₂SO₄]、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）。N添加设置6个浓度，分别为0、20、60、100、200、300 mg·kg^-1；P添加设置6个浓度，分别为0、25、50、75、100、125 mg·kg^-1；为了统一变量，N、P同时添加也设置6个浓度（mg·kg^-1），分别为N 0+ P 75、N 20+P 75、N 60+P 75、N 100+P 75、N 200+P 75、N 300+P 75。共计18个处理，每个处理设置3个重复。

1.3 室内培养与测定

根据供试土壤的初始含水量，称取相当于15 g干土的供试土样放入体积为150 mL的厌养瓶中，用无菌去离子水作空白对照，添加不同浓度的N³⁺、P⁵⁺作外源N、P处理，用无菌去离子水调节土壤含水量为15%；样瓶用真空泵进行通气去除空气中的杂质，以减小误差；通过计算注入一定量的CH₄标准气体，使每个瓶中初始CH₄浓度为15 µL·L^-1（具体浓度以实际测量为准）^[20]，使用Agilent 7890A气相色谱仪根据已知标准气体的浓度测定每个样瓶中CH₄的初始浓度；将所有样品放入SANYO气候箱中于26 ℃条件下闭光培养12 d，期间每2 d测定一次样瓶中CH₄浓度。CH₄氧化速率计算公式^[21]：

式中：Rt为CH₄氧化速率，ng CH₄·kg^-1·h^-1；ΔC_CH4/Δt为CH₄浓度消耗速率，ng·kg^-1·h^-1；V为培养容器的顶空体积，L；M_CH4为CH₄的摩尔质量，16.05 g·mol^-1；W为干土的质量，g；V_mol为单位物质的量的CH₄气体在确定温度下的体积，L·mol^-1。

外源N、P对每种土壤CH₄氧化抑制率的计算公式：

PI=（1-Rt/Rc）×100%

式中：PI为添加外源N、P对土壤CH₄氧化的影响程度（PI < 0、PI=0和PI>0分别表示促进作用、无作用和抑制作用），%；Rc为未添加外源N、P时的土壤CH₄氧化速率，ng CH₄·kg^-1·h^-1；Rt为添加外源N、P时的土壤CH₄氧化速率，ng CH₄·kg^-1·h^-1。

同时施用N、P对外源N抑制土壤CH₄氧化效应的缓解程度计算公式：

式中：M_i为同时施用N、P对第i水平外源N的土壤CH₄氧化抑制效应的缓解程度（M_i＞0、M_i=0和M_i＜0分别表示有缓解作用、无缓解作用和促进作用），%；PI (N_i)代表第i水平外源N对土壤CH₄氧化的平均抑制率，%；PI（C_i）为外源N、P同时添加条件下第i水平外源N对土壤CH₄氧化的抑制率，%。

1.4 数据分析

采用Excel 2013进行绘图和数据处理，用SPSS Statistics 19.0统计软件进行单因素（One-way ANOVA）方差分析、相关性分析、Duncan多重比较（P < 0.05，P < 0.01）。

2 结果与分析 2.1 不同浓度N处理对荔枝园土壤CH₄氧化速率的影响

如图 1A所示，在不添加外源N的条件下，3种荔枝园土壤的CH₄氧化速率具有显著性差异。H3的CH₄氧化速率最高为175.39 ng·kg^-1·h^-1，T3的CH₄氧化速率为132.55 ng·kg^-1·h^-1，T2明显低于前两者，为75.64 ng·kg^-1·h^-1。外源N的添加，对3种土壤CH₄氧化速率均有显著抑制作用（P < 0.05），与对照相比，3种土壤CH₄氧化速率的平均抑制率分别为29.93%、36.28%和24.80%，随着外源N浓度的增加，3种土壤CH₄氧化抑制效果逐渐增强（图 1B）。

2.2 不同浓度P处理对荔枝园土壤CH₄氧化速率的影响

如图 2所示，外源P添加对CH₄氧化速率的影响存在促进和先促进后抑制的情况。与对照相比，外源P对T2、T3的CH₄氧化速率都具有显著促进作用（P < 0.05），平均CH₄氧化速率较对照分别提高了30.94%、39.38%，不同浓度外源P处理对H3的CH₄氧化速率的影响存在促进-抑制的交替变化特征，以促进为主，且达到显著水平（P < 0.05）。不同外源P浓度处理对CH₄氧化的促进效果变化趋势随土壤种类不同而异，随着外源P浓度的增加，T3一直呈现逐渐增强的促进效果；T2的CH₄氧化促进作用先增强后减弱；H3的CH₄氧化促进效果在外源P的作用下呈现先促进后抑制的变化趋势。利用二次多项式方程对CH₄氧化速率与外源P浓度进行拟合（表 2），根据拟合方程计算出H3、T2、T3的CH₄氧化速率最大时所对应的外源P浓度（即最佳外源P浓度），分别为40.65、78.31、57.68 mg·kg^-1。

2.3 外源N、P同时添加对荔枝园土壤CH₄氧化速率的影响

经过以上两个试验，在外源N的作用下，3种荔枝园土壤CH₄氧化受到明显的抑制，而外源P的添加可以促进土壤CH₄氧化。N、P同时添加对3种荔枝园土壤CH₄氧化的抑制率均显著低于外源N（图 3），并对H3、T2、T3土壤CH₄氧化速率均具有明显的促进作用，且随铵态氮浓度的增加3种荔枝园土壤CH₄氧化速率促进效果先增强后减弱。如表 3所示，与外源N作用下的CH₄氧化抑制作用相比，3种荔枝园土壤在N、P同时添加对外源N抑制土壤CH₄氧化的缓解程度之间具有显著性差异（P < 0.05）（表 3），T2在N、P同时添加作用下缓解作用最高，且随着外源氮浓度的增加，N、P同时添加对于外源N抑制土壤CH₄氧化的缓解程度逐渐降低。

3 讨论

本研究中，不同浓度的N、P处理对荔枝园土壤CH₄氧化速率的影响不同，其中外源N添加抑制了CH₄氧化（P < 0.05），外源P添加促进了CH₄氧化（P < 0.05），N、P同时添加对外源N抑制土壤CH₄氧化有较大的缓解作用。

已有研究表明NH₄⁺-N对CH₄的氧化有明显的抑制作用^[22]。出现这种现象的原因一方面可能是NH₄⁺-N对CH₄氧化的抑制作用是因为添加了NH₄⁺-N后增强了土壤中氨氧化细菌的活性，而氨氧化细菌的单氧酶（AMO）和CH₄氧化菌氧化CH₄时需要的CH₄单氧酶（pMMO）生理特性具有较高的一致性，因此两者对于底物CH₄和NH₃的选择有竞争作用。此外，外源N的添加也促进了CH₄产生，抵消掉一部分CH₄氧化菌氧化的CH₄，从而表现为CH₄氧化受到抑制^[23]。另一方面可能是因为外源N的输入造成渗透压过大，使土壤中的微生物因生理缺水而无法进行正常的生理活动，导致CH₄氧化菌出现生理性缺水，进而影响CH₄氧化菌氧化吸收CH₄，从而表现为外源N的输入对土壤CH₄氧化的抑制作用^[8]。外源N的输入对CH₄氧化有抑制作用还有一种原因，是在酸性土壤中，NH₄⁺的输入使氨氧化细菌经过一系列的硝化作用生成的NO₂^-和羟胺等产物对CH₄氧化菌的生长有一定的毒害作用，使其无法进行正常的新陈代谢^[24]。因此不考虑硫对CH₄产生的影响；对于硫对CH₄氧化的影响，相关资料显示，硫抑制CH₄产生主要是在厌氧环境下有机物碳矿化的一个重要终端过程^[25]，少量添加SO₄^2-在短时间内对CH₄氧化的影响不大^[26]，而本次研究主要在好氧环境下，且添加的是（NH₄）₂SO₄，所以认为N的影响是主要控制因素。

P元素是微生物膜结构系统和其体内高磷化合物的主要构成元素^[27]，有研究发现，外源P的输入可以明显增加土壤微生物量，提高土壤微生物的活性，使土壤微生物的群落结构发生改变，并且可以提高土壤微生物群落的多样性^[28]。土壤P的缺乏通常不利于土壤微生物的生长，因此可能会影响土壤CH₄氧化菌的生长，从而影响其对CH₄的氧化吸收。本研究表明，外源P添加会刺激CH₄氧化过程，这与其他学者的研究结果一致^[29]。主要原因包括：（1）外源P的加入有助于增加土壤微生物群落的丰度和多样性，P可以诱导多种具有碳降解功能的细菌增加，降低土壤可溶性有机碳的复杂度，从而加速复杂有机碳的降解和CH₄氧化^[30]；（2）铝对CH₄氧化有抑制作用^[31]，而P能吸附铝^[32]，可减轻铝对CH₄氧化的抑制作用。将N、P同时添加后土壤的CH₄氧化抑制作用明显得到缓解，是因为施加适量的P不仅可以提高土壤肥力水平，增加土壤细菌群落的功能性^[33]，还可以缓解N沉降对CH₄氧化的抑制作用^[34]。N、P同时添加对T2的缓解作用较高，这可能跟该土壤的速效磷背景值较低有关，T2有效磷含量仅为14.62 mg·kg^-1，其他2种土壤为42.26 mg·kg^-1与121.59 mg·kg^-1，都明显高于T2的土壤有效磷含量，因此，N、P同时添加对土壤CH₄氧化抑制的缓解作用很有可能与土壤的速效磷背景值有关。随着外源N浓度的增加，N、P同时添加对于外源N抑制土壤CH₄氧化的缓解程度逐渐降低，可能是因为随着NH₄⁺-N添加量的增加，CH₄氧化的抑制作用愈大^[35]。

4 结论

（1）3种荔枝园土壤对CH₄的吸收能力有一定的差异，且3种土壤的CH₄氧化能力从高到低排序为湿润玻璃火山灰土（H3）>简育湿润铁铝土（T3）>暗红湿润铁铝土（T2）。

（2）外源N添加会抑制琼北3种荔枝园土壤的CH₄氧化，且随着外源N浓度的增加，3种土壤CH₄氧化抑制效果逐渐增强；外源P的添加对土壤CH₄氧化有明显的促进作用，随着外源P浓度的增加，促进效果逐渐减弱。

（3）N、P同时添加对外源N抑制土壤CH₄氧化有明显的缓解作用，暗红湿润铁铝土（T2）在N、P同时添加作用下缓解作用最高，这很有可能与土壤的速效磷背景值有关。而在外源N浓度的不断增加下，N、P同时添加对于外源N抑制土壤CH₄氧化的缓解程度逐渐降低。

因此，在施肥管理过程中应根据土壤类型适当地增施P肥，使土壤对大气CH₄的氧化能力维持在较高水平上，充分发挥土壤对大气CH₄的氧化能力。