2019, Vol. 38
2. 石油石化污染物控制与处理国家重点实验室, 中国石油集团安全环保技术研究院, 北京 102206;
3. 天津天迈节能设备有限公司, 天津 300112;
4. 天津市城市环境污染诊断与修复工程技术中心, 天津 300071
2. State Key Lab of Petroleum Pollution Control, CNPC Research Institute of Safety & Environmental Technology, Beijing 102206, China;
3. Tianjin Tianmai Energy Saving Equipment Co., Ltd., Tianjin 300112, China;
4. Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, Tianjin 300071, China
由于生物炭（BC）优异的物理化学性质，包括巨大的表面积、大量的孔隙结构，其已被广泛用于环境修复中。针对BC对微生物毒性影响的研究还未见报道，但有研究表明BC施于土壤后，会引起微生物群落的变化[1-2]。施用BC可以增加土壤养分和稳定碳的含量[3-6]，从而为微生物提供更多的底物，提高微生物的丰度；BC在土壤中的应用也为微生物提供了一个安全的栖息地[7]。所以在经过BC改良的土壤中，微生物的数量和活性会有所增加，这也导致土壤微生物群落和酶活性发生显著变化[8]。但是BC对某种具体微生物的影响尚不清楚。Chen等[9]在中国桐乡市进行了大田试验，研究了稻草BC对土壤养分和微生物特性的影响，研究发现施用20%BC与对照相比，土壤细菌数量增加了26.9%；施用10%以上的BC，放线菌数量显著增加80.6%~130%，但是真菌数量减少22.2%~ 30.2%，枯草杆菌数量减少42.4%~54.4%。另外Qiao等[10]在受砷污染的稻田土上进行实验，发现BC增加了砷和铁相关细菌的丰度，但对其他菌群的影响尚不清楚。
球磨生物炭（BM）是由高温裂解后的BC在球磨机中通过机械力作用，将BC粒径减小到纳米或者微米级别的新型生物炭材料[11]。这种新型材料由Peterson等[11]在2012年提出。由于它比BM具有更好地吸附[12]和降解[13]性能，而经常被用于去除水体和土壤中的污染物。之前的研究证明了BM具有更大的比表面积[11]和更多的酸性官能团。近年来，关于BM的研究多集中在它的吸附降解性能[14]，很少有研究关注它对微生物的毒性。但是，根据以往的研究[15]，达到纳米级别的BC很有可能对微生物产生毒性效应。另外，之前的研究[16-17]证明了碳纳米材料都存在一定的毒性，如氧化石墨烯[18-20]、碳纳米管[21]、富勒烯[22-23]等。
已有研究表明，自由基的产生是纳米材料对微生物毒性作用的重要方式[24]。自由基或产生的活性氧可以与许多化学结构分子发生反应，包括生物大分子，如糖蛋白会导致细胞膜失稳和细胞死亡。在水相中，这些自由基可以触发活性氧自由基（ROS）的产生。研究发现，中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死[25-27]，低浓度的ROS更广泛的生理意义在于其对转录因子的激活以及对细胞增殖、分化的促进[25]。Lieke等[28]对500 ℃水稻秸秆BC研究发现，存在于BC中的自由基对线虫神经毒性产生影响。此外，Liao等[29]和Farhangi-Abriz等[30]证明了BC颗粒中的自由基在水中可以促进活性氧的产生，并对植物的种子萌发以及根和茎伸长产生不利的影响。BM经球磨后，材料粒度大幅降低，部分可以达到纳米尺度，因此有理由认为BM有一定程度的纳米毒性效应。
到目前为止，关于BM对细菌的毒性影响尚未有人研究。基于此，本研究以小麦秸秆为原料，在500 ℃下制备得到BM，通过行星式球磨仪制备球磨生物炭材料。对其性质进行研究，同时选取两种模式细菌进行急性毒性实验，利用荧光法测定细菌的ROS和存活率等指标，并利用扫描电子显微镜（SEM）和激光共聚焦显微镜（LSCM）观察细菌的形态，对BM的微生物毒性和抗菌机理进行了初步研究。
1 材料与方法 1.1 实验原料实验所用的生物炭原料为小麦秸秆，来源于天津周边农村。BC由小麦秸秆在马弗炉中500 ℃限氧裂解2.5 h制备而成[31]，BM由生物炭按照Lyu等[14]的方法制备而成。大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923为实验室保存菌种。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养均采用LB培养基（胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1），在30 ℃、180 r· min-1条件下，于摇床中培养12 h至对数生长期。
1.2 BC的表征对制备的BC和BM进行清洗处理：将BC和BM置于蒸馏水中浸泡一周，并用磁力搅拌器（84-B，山东菏泽正虹科教仪器有限公司，中国）搅拌，每隔6 h倒掉漂浮在水面上的杂质，再加入等量的蒸馏水进行清洗。将清洗好的BC和BM进行抽滤，置于恒温干燥箱（DGG-9023A，上海优浦科学仪器公司，中国）中，于80 ℃下干燥24 h，装入塑封袋密封，备用。采用多站扩展式全自动快速比表面仪（ASAP 2460，麦克公司，美国）测定BC和BM的比表面积；采用扫描电子显微镜（JSM-7800F，日本电子，日本）观测BC和BM的表面形貌；采用傅里叶变换红外光谱仪（TENSOR 37，BRUKER，德国）分析BC和BM的官能团；采用pH计（PB-10，Sartorius，德国）测定pH值；采用电导率仪[FE30，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，中国]测定电导率值。
1.3 急性毒性实验将50 mL培养至对数生长期的E.coli和S.aureus转移至50 mL无菌离心管中，5000 r·min-1离心5 min，倒掉上清液，用无菌0.9% NaCl清洗3次以除去残留的LB培养基。将清洗完的菌种倒入50 mL分别加入了0、10、20、50、100、200 mg·L-1 BC和BM的无菌LB培养基和0.9% NaCl中，置于摇床（HNY-2102C，欧诺公司，中国）里，30 ℃、180 r·min-1培养2.5 h后，分析其毒性影响。
1.4 细菌形貌观测取50 mL染毒后的菌液，5000 r·min-1离心5 min后，去除上清液。将菌体放到2.5%的戊二醛（扫描电镜专用）中，4 ℃固定4 h（或固定过夜）。将固定液倒掉，0.1 mol·L-1 PBS缓冲液（pH7.0）漂洗3次，每次15 min。利用浓度为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇进行梯度脱水，每次15 min，随后用无水乙醇处理两次，每次20 min。真空干燥后在菌体表面喷金，置于SEM下观察细胞形态。
1.5 细菌存活率测定与LSCM观测存活率采用细菌细胞活性测定试剂盒（Invitrogen，美国）测定[24]。染料为PI和SYTO 9，PI只能穿过破损的细胞膜，与细胞核结合显红色荧光；SYTO 9可以穿过所有细胞膜，与细胞核结合显绿色荧光。当两种染料同时存在时，活细胞呈现绿色，死细胞呈现红色。取1 mL染毒后的菌液置于2 mL离心管中，10 000 r·min-1离心3 min，用无菌0.9% NaCl清洗3次，取100 μL PI和SYTO 9等量混匀后的染料与100 μL菌液混合，锡箔纸包好后置于摇床中，于30 ℃，180 r·min-1混合摇匀15 min，取100 μL样品于96微孔板中，用全功能酶标仪（Synergy H4，伯腾公司，美国，激发波长485 nm，发射波长521 nm）测定荧光值，计算存活率。另取50 μL样品用LSCM（LSM880 with Airyscan，Zeiss公司，德国）观测。
1.6 细菌ROS测定用活性氧试剂盒（碧云天，中国）测定细菌细胞内的ROS含量[24]，染料为2′，7′ -二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）。DCFH-DA向细胞内扩散，脱去乙酰基成为不显荧光的DCFH，细胞内的ROS迅速将DCFH氧化成具有高强度荧光的DCF，其荧光强度和细胞内的ROS含量成正比。取1 mL染毒后的菌液置于2 mL离心管中，10 000 r·min-1离心3 min，用无菌0.9% NaCl清洗3次后，取100 μL活性氧染料与100 μL菌液混合，锡箔纸包好后置于摇床中，于30 ℃、180 r·min-1混合摇匀30 min，取100 μL样品于96微孔板中，用酶标仪（激发波长485 nm，发射波长521 nm）测定荧光值。相对ROS水平表示为样品组与空白对照组的荧光强度之比[26]。
消除ROS实验：将培养至对数期的菌体清洗干净后，倒入50 mL 0.9% NaCl中，并加入2 mmol·L-1 N-乙酰半胱氨酸（NAC）[32]。以不加NAC的0.9% NaCl为对照，30 ℃条件下培养1 h后，向加入NAC的培养瓶中依次加入0、10、20、50、100、200 mg·L-1的BM，培养2.5 h后，测定各体系的致死率和ROS含量，并在LSCM和SEM下直观观察细胞的损伤情况。
1.7 数据分析采用Origin 2018进行数据处理及作图，数据表示为平均值±标准差，ROS和存活率的测定均设置3次平行，采用SPSS对数据进行方差分析（One way ANO VA）及Turkey′s Test分析，P < 0.05表示有显著差异。
2 结果与分析 2.1 BM和BC的性质BM和BC的基本性质见表 1。分析表 1可知，BM的比表面积远大于BC，是BC的3.15倍，而pH值低于BC。由表 1中的元素分析结果可知，BM中C和O的含量高于BC，这与BM溶液比BC溶液的颜色黑这一实验现象相吻合。将BM和BC置于蒸馏水中，超声30 min后，BC在10 min内上浮或者沉淀，而BM在12 h内未发生沉淀，说明BM的稳定性和分散性优于BC。
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表 1 BM和BC的比表面积、pH和元素组成 Table 1 Specific surface area, pH and elemental composition of BM and BC |
用扫描电子显微镜对BM和BC的颗粒大小和形态进行比较的结果见图 1。由图 1a和图 1b可知BC是多孔的，存在明显的孔状结构，粒度为毫米级别，孔径约为1 μm。由图 1c和图 1d可知，BM的粒径不规则，且大小不均匀，但都在1 μm以下，图中圈出的红色部分为小于100 nm的颗粒。总体来看，BM的粒度在60 nm~1 μm之间。BC经过球磨成BM后，颗粒粒径减小，颗粒数量大量增加，这导致了比表面积的增加，与比表面积的结果一致。
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a、b放大倍数为5000倍；c放大倍数为16 000倍；d放大倍数为30 000倍 The magnification of a and b is 5000 times, c is 16 000 times, d is 30 000 times 图 1 BM和BC的扫描电镜图 Figure 1 Scanning electron microscopy(SEM)of BM and BC |
从BM和BC的红外图谱（图 2）可以发现，BM在3356 cm-1和3048 cm-1处，O-H和N-H键显著拉伸，C=C、N=N、C=N和N=O双键在1586 cm-1处伸缩振动，C-H在873、810 cm-1和749 cm-1处弯曲振动。此外，在BM上观察到两个新的峰，分别为1380 cm-1和1092 cm-1处的酚醛C-X和C-O，表明球磨引入了一些酸性官能团，这与pH值的结果相一致。在测试条件下，BM表面酸性官能团的引入会增强电双层之间的排斥力，以防止亚微米球磨生物炭粒子的聚集，这与超声分散的结果一致。
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图 2 BM和BC的红外图谱 Figure 2 Fourier transform infrared(FTIR)of BM and BC |
经过2.5 h的毒性暴露实验后，E.coli和S. aureus的存活率测定结果如图 3所示。在0.9% NaCl中，仅添加10 mg·L-1的BM，S.aureus的存活率为90.1%，当浓度增大到200 mg·L-1时，存活率仅为23.5%；而添加10 mg·L-1的BC时，S. aureus的存活率为98.2%，当浓度增大到200 mg·L-1时，存活率仍为68.9%。这说明相比于BC，BM对S.aureus的毒性更显著。在LB培养基中，BM浓度为200 mg·L-1时，S.aureus存活率为60.9%，这说明在LB培养基中，BM对S.aureus的毒性减弱。无论是在0.9% NaCl还是LB培养基中，添加BM和BC后，E.coli的存活率一直维持在90%以上，且两者差别较小，这说明BM和BC对E.coli的存活率影响不显著。由SPSS分析，数据对照均具有显著性差异。
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图 3 0.9% NaCl和LB培养基中细菌的存活率 Figure 3 Livability of bacteria in 0.9% NaCl and LB medium |
为了分析BM和BC对E.coli和S.aureus产生毒性的原因，测定了两种菌细胞内的ROS含量，结果如图 4所示。细菌和培养介质相同的条件下，添加BM产生的ROS是BC的1.1~2.0倍。如图 4a所示，在0.9% NaCl中，添加BM对E.coli最大的氧化损伤为空白的1.4倍，对S.aureus的氧化损伤最大为空白的6.4倍，且倍数随着BM浓度的增加而增加，说明BM对S.aureus造成的氧化损伤远大于E.coli。如图 4b所示，在LB培养基中，添加BM对E.coli最大的氧化损伤为空白的1.2倍，对S.aureus的氧化损伤为空白的4倍。对比图 4a和图 4b可以发现，在LB培养基中，添加BM和BC后，细菌细胞内的ROS均有所减少。
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图中不同的小写字母表明在同一浓度下，不同处理间差异显著（P < 0.05）。误差棒表示标准偏差（n=3）。下同 Different lowercase letters in the picture indicate significant difference among the treatments at the same concentration(P < 0.05). Error bar represent standard deviation(n=3). The same below 图 4 0.9% NaCl和LB培养基中细菌产生的ROS Figure 4 ROS produced by bacteria in 0.9% NaCl and LB medium |
由于BM对E.coli的毒性效果不明显，因此以S. aureus为模式菌株探究BM毒性与氧化损伤的关系。
如图 5所示，加入NAC后，各处理组ROS的含量降低至与空白相接近，说明各组中ROS的作用已基本消除。与暴露于BM的各组相比，加入的NAC使得S.aureus存活率升高，但是与对照相比仍有一定差距。说明BM对S.aureus产生毒性主要是由于氧化损伤导致的，但是其他因素，例如BM的机械碰撞作用也有可能是造成毒性的一个原因，因此虽然消除了ROS，但其存活率与对照相比仍有一定差距。
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图 5 0.9% NaCl中S.aureus产生的ROS与S.aureus的存活率 Figure 5 ROS produced by S.aureus and livability of S.aureus in 0.9% NaCl |
为进一步证实上述推测，采用荧光活/死染色法观察细菌膜完整性，区分活菌（绿色）和死菌（红色），以探讨BM和BC对E.coli和S.aureus的抗菌能力。选取在0.9% NaCl中，添加BM后的E.coli和S. aureus的LSCM图像进行分析。如图 6所示，在0.9% NaCl中，不添加BM时，E.coli和S.aureus几乎全为绿色，添加BM后，E.coli和S.aureus中均有红色出现，且红色部分所占比率和BM的浓度呈正相关。同一浓度下，S.aureus中红色部分远大于E.coli，说明BM对S.aureus的毒性远大于E.coli。在0.9% NaCl中添加200 mg·L-1 BM，消除ROS后S.aureus的LSCM图像（图 6d）与未消除ROS的图像（图 6c）相比，红色部分大量减少，说明加入NAC后，S.aureus的存活率上升。
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图 6 在0.9% NaCl中添加BM后细菌的LSCM图像（×40倍） Figure 6 LSCM image of bacteria in 0.9% NaCl after adding BM(×40 times) |
为了进一步确定实验结论，采用SEM观察了E. coli和S. aureus的表面形态。选取在0.9% NaCl中，添加BM后E.coli和S. aureus的SEM图像进行分析，如图 7所示：不添加BM的S.aureus表面光滑，无褶皱存在。添加BM后，S.aureus的表面存在褶皱，且随着BM浓度的增加，褶皱更加明显。可能是由于BM造成S.aureus细胞膜和细胞壁损伤，细胞质泄漏所致；不添加BM的E.coli表面光滑无破损，添加BM后，细胞表面存在微量的褶皱，但是随着浓度增加，细胞体积不变。说明在0.9% NaCl中，BM对S.aureus的毒性远大于E.coli。在LB培养基中也有相似情况，但没有在0.9% NaCl中明显。在0.9% NaCl中添加200 mg· L-1 BM，消除ROS后S.aureus的SEM图像（图 7d）与未消除ROS的图像（7c）相比，褶皱大量减少，细胞膜基本无褶皱。这与ROS、存活率和LSCM的结果吻合。
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图 7 在0.9% NaCl中添加BM后细菌的SEM图像（×40 000倍） Figure 7 SEM image of bacteria in 0.9% NaCl after adding BM(×40 000 times) |
加入NAC消除ROS的实验说明氧化损伤是造成细胞死亡的重要原因，但是其他因素，例如纳米颗粒对细胞的机械碰撞等也有可能是造成BM毒性的原因。
3 讨论本次研究的实验结果表明，相比于BC，BM具有更低的pH值，更多的酸性官能团，更大的比表面积，这与Lyu等[14]和Wang等[33]的研究结果一致。球磨能够将毫米尺度的颗粒减小到纳米级别，由于颗粒减小，BM在蒸馏水中分散得更好。同时，也由于颗粒减小使大量亚微米颗粒增加，从而导致了BM比表面积的增加。FTIR结果表明，BM具有更多的酸性官能团，从而导致pH值的降低。
对比BC和BM，相同条件下，BM的毒性更明显。BM由BC经过球磨得到，通过球磨，可能会增加持久性自由基的数量[34-35]。本次研究中，相比于LB培养基，BM在0.9% NaCl中对S.aureus的毒性更明显，可能是由于LB培养基中的营养物质起到了缓冲与保护作用，这与Liu等[24]的研究结果一致。在两种介质中，BM的毒性都大于BC。这除了与自由基有关，可能还与颗粒尺寸有关。由图 1可知，BM的粒度在60 nm~ 1 μm之间，远小于BC[36]，而S.aureus的直径在0.8 μm左右，小于100 nm的颗粒极有可能穿过细胞的细胞膜，进入细胞，造成高浓度的ROS，从而导致S.aureus的死亡。100 nm~1 μm之间的颗粒，由于培养过程中的振荡作用，会对S.aureus产生撞击，从而造成一定的机械损伤。由于粒度减小，导致BM具有更大的比表面积[33, 37]，与E.coli和S.aureus的接触更充分，使其产生更高浓度的ROS，所以损伤更大。此外，BM对E. coli和S.aureus的毒性效应不同，可能还与E.coli产生的胞外聚合物（EPS）有关。由于革兰氏阳性菌与阴性菌的细胞壁构造不同，在其表面产生的EPS也不同[38]。EPS不仅可以起到屏障作用，防止生物炭所造成的物理损伤，而且还可以作为ROS的汇，保护细菌免受生物炭的毒害[39]。
4 结论（1）球磨生物炭具有更多的酸性官能团和更大的比表面积。
（2）球磨生物炭对E.coli和S.aureus的毒性影响远大于生物炭。
（3）球磨生物炭对S.aureus的毒性高于E.coli，且毒性与浓度呈正相关。
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