2020, Vol. 39
2. 天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心, 天津 300193
2. Tianjin Agricultural Ecological Environment Monitoring and Agricultural Product Quality Testing Center, Tianjin 300193, China
抗生素作为可抑制微生物生长、繁殖乃至杀死微生物的自然产生、部分合成或全合成的一类化合物，现已广泛应用于动物感染性疾病的预防和治疗以及促进畜牧业的增长[1]。我国作为世界上最大的抗生素生产和消费国，抗生素年用量约为1.62×108 kg，其中52%用于牲畜[2]。在美国，每年销售的1.35×107 kg抗生素约80%用于动物生产[3]。然而应用于畜禽的抗生素无法被畜禽完全吸收，多达30%~90%的残留化合物通过畜禽粪便或尿液排出[4]。大量抗生素残留引起的细菌耐药问题堪忧。有研究者发现，土霉素(OTC)和金霉素(CTC)是动物粪便中回收频率最高的两种抗生素，鸡粪和猪粪中OTC浓度最高，分别达到417 mg∙kg-1[5]和764 mg∙kg-1[6]。Zhao等[7]检测到鸡粪中诺氟沙星的残留浓度高达225 mg∙kg-1。因此，畜禽粪便作为养殖环境中抗生素的重要存储库，成为周边环境中抗生素的主要排放源[4]。值得关注的是，释放到环境中的抗生素对本地微生物群落造成选择性压力，从而诱导出耐药菌，引起大范围细菌耐药[8]。
目前，许多专家学者已经在养殖场及其周边环境中检测出了多种类且高残留的抗生素。Zhi等[9]对天津市养殖场废水处理过程中的废水样品的58种兽药抗生素进行了分析，四环素类抗生素(TCs)在原废水中的残留浓度最高，尤其CTC的残余浓度高达130.67±5.90 μg∙L-1。赵晶等[10]发现上海市养殖场及周边环境的不同采样介质中喹诺酮类抗生素(QLs)均有较高检出率(53.3%~100%)，在粪肥和土壤中QLs浓度均值高于周边地表水和蔬菜样，表明QLs在粪肥-土壤-蔬菜系统中具有一定的迁移能力。成玉婷等[11]发现磺胺类抗生素(SAs)在有机蔬菜基地土壤中总浓度最高值为973 μg∙kg-1，且检出率均≥94%，推测因长期大量施用粪肥，致使土壤中含有大量有机质，这些有机质可与抗生素发生吸附作用使其在土壤中累积[12]。这些研究结果表明，粪肥的抗生素多种类不同程度被检出并向周边环境中迁移。
欧洲已在2005年完全停止使用抗生素作为生长促进剂[13]。中国政府也意识到抗生素滥用、过度使用及耐药性等问题的严重性，已经颁布了一些相关的政策法规[14]。然而土壤中抗生素的残留浓度仍处于较高水平，亟需评估其生态风险。常用的污染物生态风险评估方法主要有3种：风险商值法(Risk quotient，RQ)、物种敏感性分布法(Species sensitivity distribu⁃ tion，SSD)和概率生态风险法(Probabilistic ecological risk assessment，PERA) [15]。其中RQ法对毒理数据的要求较少，操作难易程度低[16]，已被广泛用于评估环境中抗生素潜在生态风险的大小[17-19]，且RQ值可以分为3个污染等级[20]：0.01≤RQ < 0.1，为低风险；0.1≤ RQ < 1，为中等风险；RQ≥1，为高风险，易于说明污染风险程度。
本研究选取天津市5个不同规模的养鸡场，采集养鸡场新鲜鸡粪、周边近土及对照远土3类样品，用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)方法检测样品中5大类抗生素，分析各类抗生素的污染特征及各抗生素与环境因子的相关性，从而识别关键影响因素，并综合文献中各抗生素急性毒性数据，预测本研究土壤环境中抗生素抗性选择的无效应浓度，借鉴RQ法对土壤环境中抗生素进行生态风险评估，最终提出相应的消减对策，为日后畜禽养殖业抗生素污染防治和粪肥合理化施用提供依据。
1 材料和方法 1.1 样品采集本试验的新鲜鸡粪样分别采集于天津市汉沽区(a养鸡场)、津南区(b养鸡场)、静海区(c养鸡场)和西青区(d、e养鸡场)的5个中小型典型养鸡场，其养殖规模依次约为0.8万、0.8万、5万、1.1万只和0.9万只，周边近土样采集于各养鸡场的周边土壤(10 m附近处)，对照远土样采集于远离各养鸡场50 m附近区域土壤，各样本均取3个平行样混合均匀作为代表样本，分别为：鸡粪样、周边近土样和对照远土样，5个养鸡场共计15个样品。根据四分法取1 kg左右装入带盖棕色瓶中，及时运回实验室，于-20 ℃冰箱保存备测。鸡粪样本、近土样和远土样分别用F、S、K来表示，5个养鸡场依次用a、b、c、d和e命名，例Fa是a养鸡场的鸡粪样。所采样的5个养鸡场采样期间均未暴发疫病。
1.2 理化性质测定鸡粪测定pH、全氮、全磷及有机质依据标准《有机肥料》(NY 525—2012) [21]，土壤测定pH、全氮、全磷及有机质参照《土壤农化分析》 [22]。全氮、全磷采用全自动连续流动分析仪(AA3)测定。有机质的测定采用重铬酸钾容量法。用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定鸡粪和土壤样品中7种重金属元素的总浓度(总Zn、Cu、As、Cr、Cd、Ni和Pb)。
1.3 抗生素测定 1.3.1 抗生素及试剂鉴于抗生素在养殖场的广泛应用，本研究选取五类18种抗生素作为目标筛选化合物。其中5种磺胺类抗生素(SAs)：磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SD)、磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole，SMX)、磺胺二甲嘧啶(Sulfad⁃ imidine，SM2)、磺胺氯哒嗪(Sulfachlorpyridazine，SCP)、甲氧苄啶(Trimethoprim，TMP)；4种四环素类抗生素(TCs)：四环素(Tetracycline，TC)、土霉素(Oxy⁃ tetracycline，OTC)、金霉素(Chlorotetracycline，CTC)、强力霉素(Doxycycline，DXC)；3种喹诺酮类抗生素(QLs)：环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、恩诺沙星(En⁃ rofloxacin，ENR)、氧氟沙星(Ofloxacin，OFL)；3种大环内酯类抗生素(MAs)：红霉素(Erythromycin，ETM)、罗红霉素(Roxithromycin，ROX)、泰乐菌素(Tylosin，TYL)；3种β-内酰胺类抗生素(β-lactams)：氨苄青霉素(Ampicillin，AMP)、头孢氨苄(Cefalexin，CLX)、呋喃唑酮(Furazolidone，FUR)。回收率指示物：13C6-磺胺嘧啶、甲氯环素、洛美沙星及13C3-咖啡因分别作为磺胺类、四环素类、喹诺酮类及剩余类抗生素的替代物。内标指示物：西玛通。色谱纯试剂：甲醇、乙腈；分析纯试剂：柠檬酸、丙酮、甲酸、NaH2PO4、Na2EDTA、NaOH、HCl等。
1.3.2 样品前处理及测试分析养鸡场鸡粪及土壤样品预处理提取液及混合标准储备液的制备采用万位宁等实验方法[23]。首先添加提取液(重复3次)及4种替代物于鸡粪和土壤样品中超声提取目标抗生素，合并稀释提取液，过SAX和HLB串联组装的萃取柱，固相萃取(SPE)纯化目标抗生素，氮气吹至近干，加入内标物储备液定容过滤膜，随后使用UPLC-MS/MS联用技术对目标抗生素进行上机检测。仪器的色谱和质谱工作条件参考已优化的方法[23]。标准曲线的线性相关系数R2均≥0.99，达到分析要求。在分析过程中执行了严格的质量保证和质量控制，抗生素替代物的回收率为52.3%~ 89.2%。
1.4 风险评估本研究采用RQ法来评估18种抗生素在土壤中的残留对生态系统抗性选择的潜在风险。本研究中土壤预计无影响浓度(PNECsoil)的计算方法参考欧盟《关于风险评价技术导则文件》 [24]与相关文献[18-19, 25]中的内容进行估算。
抗生素的RQ值按下式(1)计算[25]：
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(1) |
式中：MEC为实测环境浓度，μg∙kg-1；PNEC是指用于抗生素耐药性选择的预测无效应浓度，μg∙kg-1。
抗生素在土壤中毒性数据较少，且难以对PNECsoil值进行估算，因此采用公式(2)根据水体中抗生素的PNEC值[25]计算土壤中抗生素的PNEC值[18]：
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(2) |
式中：PNECsoil和PNECwater分别用于预测土壤和水环境中抗生素抗性选择的无效应浓度，μg∙kg-1、μg∙L-1，其中PNECwater值(表 1)通过收集急性或慢性毒理学实验数据，并结合美国环保署EPA ECTOX数据库得出[8]；Kdsoil为土壤-水的分配系数，L∙kg-1。
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([ |
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表 1 预测土壤中目标抗生素的无影响浓度 Table 1 Predicts the unaffected concentration of target antibiotics in soil |
式中：EC50为急性毒性参考因子，半最大效应浓度，mg∙L-1；AF为评估因子，根据欧盟《关于风险评价技术导则文件》提出的5种分类方法[24]，考虑到目标抗生素毒性数据只有1个短期试验，且有研究表明急性毒性试验风险评估AF为1000，慢性毒性试验风险评估AF为100[26]，综合考虑后AF取值1000。
为了最大化估计土壤中抗生素的影响，选择现有研究中土壤类型相近的各抗生素土壤最低Kd值对PNECsoil进行估计[27]。
1.5 数据分析Excel 2010处理数据，Origin 2017画图，采用冗余度分析(RDA)评价养鸡场及其周边土壤环境中理化性质与抗生素浓度的关系。
2 结果与讨论 2.1 养鸡场及其周边土壤中抗生素的污染特征采集于5个典型养鸡场及其周边土壤中3类样品的5大类抗生素均普遍检出(表 2)，其中除SM2、ETM及FUR外，鸡粪样中剩余抗生素的检出率均达到100%，鸡粪样中∑SAs、∑TCs、∑QLs、∑MAs、∑β-lactams的均值分别为4.11、143.34、90.46、258.14 μg∙kg-1和4.06 μg∙kg-1，3类样品的检出率依次为：鸡粪样>周边近土样>对照远土样；包括周边近土和对照远土的土壤样品中5大类抗生素检出率依次为：TCs>QLs>SAs>MAs> β -lactams，各土壤样品中采样点∑TCs、∑QLs、∑SAs、∑MAs、∑β-lactams的检出浓度范围分别为9.92~133.95、2.48~13.72、3.15~ 8.51、0.03~2.33 μg ∙ kg-1和0.01~0.40 μg ∙ kg-1。Wei等[8]研究了我国畜禽粪便施肥菜田土壤中17种兽药抗生素的残留情况发现：TCs(82.75 μg∙kg-1)>QLs (12.78 μg∙kg-1) >MAs(12.24 μg∙kg-1) >SAs(2.61 μg∙ kg-1) >AMs(0.06 μg∙kg-1)，该研究中各类抗生素平均浓度高于本研究中近土样的检出浓度且低于鸡粪样的检出浓度，表明粪肥施用于蔬菜农田土壤中可直接提高抗生素残留。
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表 2 养鸡场及其周边土壤中5大类抗生素的总体检出水平 Table 2 Total detection levels of five major classes of antibiotics in chicken farms and surrounding soil |
本研究中四环素类抗生素(TCs)具有最高检出率和检出浓度。TC、OTC、CTC、DXC均被100%检出(表 2)。除去Fb采样点中远高于其他抗生素浓度的DXC的异常值，各抗生素平均浓度依次为OTC(50.07 μg∙kg-1) >TC(22.00 μg∙kg-1) >DXC(15.59 μg∙kg-1) > CTC(8.92 μg∙kg-1)，本研究结果与罗凯等[39]TCs浓度检出水平一致。其中TCs的组成以OTC为主，表明OTC在畜禽粪便及粪污灌溉区均具有较高的检出浓度[17]。在采集养鸡场的3类样品(即鸡粪、近土及远土对照样)中，4种四环素类抗生素总浓度(∑TCs)均值分别为1 543.34、54.76、23.65 μg∙kg-1，∑TCs呈现逐渐衰减的趋势。且TCs的Kd值较高(见表 1)，增强其在土壤中吸附聚积的潜能，从而影响土壤中微生物的群落组成，促使其产生抗性菌，存在不可忽视的生态环境风险[40]。
喹诺酮类抗生素(QLs)总检出率及检出浓度低于TCs。CIP、ENR、OFL在鸡粪样中均100%检出，鸡粪样检出总浓度范围为18.74~337.04 μg∙kg-1，鸡粪样中的QLs检出残留量较高，可能由于QLs作为饲料添加剂，广泛应用于畜禽养殖业，以促进畜禽生长及疾病的预防。在近土及远土对照样中，ENR和OFL全检出，其中ENR的递减趋势较为明显。整体上，3种QLs的浓度变化为：鸡粪样>近土样>远土对照样，表明QLs污染有向周边土壤迁移的趋势[41]。
磺胺类抗生素(SAs)的检出率和检出浓度低于QLs。SAs的检出浓度水平依次为：SD>SMX>TMP> SCP>SM2。其中SD的检出量最高，在1.35~5.1 μg∙ kg-1水平，占总浓度的29.67%~91.11%；其次为SMX，浓度范围为0.07~5.07 μg∙kg-1，占总浓度的2.27%~ 59.58%，两者共占总浓度的33.63%~100.00%。本研究中鸡粪样、近土样和远土对照样中SAs的总浓度范围分别为3.09~4.93、3.43~8.51 μg ∙ kg-1和3.15~6.48 μg∙kg-1，3类样品中∑SAs并未有逐渐降低的趋势，这可能与SAs水溶性较强且难以降解的特性有关[42]，磺胺类抗生素的Kd值较低(表 1)，在土壤中的迁移能力较强，且作为早期最常用的抗生素种类之一，SAs在长期使用的过程中不断向附近土壤进行迁移，导致周边土壤的磺胺浓度不断积累，接近甚至超过了粪便中的浓度；但其中养鸡场c和e中∑SAs的浓度为：对照远土样>周边近土样>鸡粪样，这可能由于c、e养鸡场的对照远土样受外部的SAs源污染。
3种大环内酯类抗生素(MAs)检出率及检出浓度依次为：TYL>ROX>ETM。TYL作为兽医临床常用的抗菌药物之一，在鸡粪样中全部检出，采样点总检出率为80%，MAs中TYL有从鸡粪样向近土样转移的趋势(图 1d)；TYL在Fb采样点处具有异常浓度为1 274.20 μg∙kg-1，推测b养鸡场在采样前期过量使用TYL，用于促生长和防治感染性疾病。ROX检出率高达100%，检出浓度值较低，其浓度范围为0.03~0.52 μg∙ kg-1(表 2)；ETM在鸡粪样中低于检出限，表明ETM并未广泛应用于本研究的5个养鸡场中。
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图 1 养鸡场及其周边土壤中抗生素的浓度水平和分布特征 Figure 1 Concentration and distribution of antibiotics in the chicken farm and its surrounding soil |
5个养鸡场及其周边土壤中β-内酰胺类抗生素(β-lactams)的检出率和检出浓度均低于TCs、QLs、SAs及MAs 4类。3种β-lactams均有较低的检出率和检出浓度，依次为：AMP>CLX>FUR(如图 1e)。β-lac⁃ tams主要存在于鸡粪样中，周边土壤环境几乎未检出(表 2)，无明显的迁移变化。其中，AMP、CLX在鸡粪样中100%检出且检出浓度相近，AMP在近土样和远土样均较低检出率且微量检出，CLX在土样中未检出，可能是由于AMP、CLX微量添加于饲料，用来畜禽疾病预防。
2.2 抗生素与环境因子的相关关系5个典型养鸡场及其周边土壤中3类样品的理化性质见表 3。由表 3可知，新鲜鸡粪样的pH均值为6.68，普遍偏酸性，周边近土和对照远土样普遍偏碱性；鸡粪样的含水率、TN、TP和TOC均值较高。整体上，3类样品的理化因子(pH除外)浓度依次为：鸡粪>周边近土>对照远土。
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表 3 养鸡场及其周边土壤中各采样点的理化性质 Table 3 Physical and chemical properties of each sampling point in the chicken farm and its surrounding soils |
为了评价养鸡场周边土壤中环境因子[包括理化因子：pH、含水率、TN、TP、TOC；重金属因子：Total(As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb及Zn)]对抗生素浓度的影响，本研究采用冗余分析(RDA)，结果表明，18种抗生素在第Ⅰ轴和第Ⅱ轴的解释量分别为34.8%和24.5%，RDA分析中第Ⅰ、Ⅱ轴解释了土壤样品中抗生素浓度数据总方差的59.3%，对抗生素浓度与环境因子关系的累积解释量达75.3%，因此，第Ⅰ、Ⅱ轴在一定程度上反映抗生素浓度与环境因子的关系(图 2)。
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蓝色箭头代表抗生素，红色箭头代表环境因子；Total表示总重金属，Mo表示含水率 Blue rays represent antibiotics, red rays represent environmental factors; Total represents total heavy metals, and Mo represents moisture content 图 2 5大类抗生素与环境因子的冗余分析 Figure 2 Redundant analysis of five major classes of antibiotics and environmental factors |
RDA图中射线的长度代表对模型贡献率的大小，射线越长，贡献率越大；射线的夹角代表其相关性，夹角的余弦值等于两者的相关系数，环境因子射线在抗生素浓度射线上的垂直投影越长，则对抗生素浓度影响越大[43]。养鸡场周边土壤样品中18种抗生素的射线分布如图 2所示，TCs、QLs、SAs、MAs和β- lactams 5大类抗生素的相关性不大，除TCs外，其余抗生素分布较集中，但射线较短；TCs(OTC、CTC、TC和DXC)的射线较长但分布较分散。环境因子TP、pH、TN射线均较长，对抗生素浓度差异性的解释分别为29.27%、15.08%和12.00%。其中，pH与SMX正相关，与CIP、TMP、TYL等负相关；TP与SCP正相关，Mo、TOC与CTC正相关，TN、Total与DXC、ENR正相关。可以得出，不同的抗生素与大多数的单一环境因子之间没有明显的规律，通常受所有环境因子共同累加的影响。常规环境因子与重金属通过影响抗生素在土壤中的吸附作用，从而影响抗生素在土壤溶液中的浓度、迁移能力、生物学效应及其降解效率[44]。
2.3 养鸡场周边土壤中抗生素的生态风险评估及消减对策 2.3.1 生态风险评估由于目标抗生素已有的土壤毒理数据较少，采用RQ法来进行初步评价研究[18]。本研究中β-lactams在土壤中检出率和检出浓度均较低(图 1e)，故暂未评估其生态风险，ROX未检索到相关的土壤分配系数(即Kd值)，故不考虑其生态风险。抗生素从粪肥到土壤的迁移是一个复杂的过程。在实际环境中，很难计算从粪便到土壤的抗生素浓度[17]。本研究将重点讨论在养鸡场周边近土(图 3S)和对照远土(图 3K)中14种抗生素的生态风险。
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图 3 养鸡场周边近处土壤(S)及远处对照土壤(K)中主要抗生素的RQ值 Figure 3 Risk quotient of predominant antibiotics in the soil(S)near the chicken farm and in the remote control soil(K) |
整体上，养鸡场周边近土RQ值高于对照远土的RQ值，这可能与周边近土可直接接触鸡粪有关，鸡粪含有的抗生素可直接迁移转化到周边近土中去[8]。由图 3可知，周边近土样和对照远土样中，以SMX、SD生态风险最高，RQ值远大于1，均全部表现为高风险，两者为养鸡场土壤样品中最严重的抗生素污染物，需采取减量使用等消减措施；SM2、TC、OTC、DXC、ENR、OFL、ETM及TYL的RQ值均在0.01~1范围内，表现为中低风险，对土壤微生物有一定程度伤害，应给予重视；SCP、TMP、CIP以及远土样中的CTC均小于0.01，暂时表现为无风险，在后期风险评估中仍需关注。TCs、QLs和MAs的RQ值小于1，3类抗生素表现为有中低风险，对环境造成一定选择压力[8]，若考虑各抗生素的联合作用，风险水平更需加强关注[45]。
表 4为5个养鸡场周边近土的各类抗生素总含量减去对照远土的各类抗生素总含量，排除外源抗生素的影响，得出RQ差值，用以评估由于养鸡场来源对周边近土抗生素的影响。由表 4可知，∑SAs在a、b养鸡场中的生态风险最高，在剩余养鸡场中的RQ差值小于0，这可能由于c、d和e养鸡场的对照远土受外部的SAs源污染。∑TCs、∑QLs和∑MAs 3大类抗生素的RQ差值大于0.01的均有4个养鸡场，表明3大类抗生素均有一定程度的生态风险；养鸡场a、b的4大类抗生素均存在较高的生态风险，对周边土壤造成不同程度的污染。因此亟需开展有关畜禽粪便-土壤-作物系统中抗生素环境行为与调控等方面的研究[11]。
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表 4 养鸡场周边近土与对照远土4大类抗生素的生态风险差值 Table 4 Ecological risk difference of four major antibiotics in the near-soils and control remote soils around the chicken farm |
目前国家已出台了相关法律法规和行动计划，但抗生素污染问题仍较为突出。亟需提出消减对策，其关键途径之一是源头控制抗生素的使用[14]。首先建议国家加大相关法律法规执行力度、制定使用规范，并建立部门联合管理机制；其次，政府需加强养殖业从业人员教育，引导农户科学合理地使用抗生素；第三，主管部门应定期抽查养殖场，严格控制其使用抗生素的种类和剂量，建立残留药物的防控监测系统；第四，大力推广具有高效性、安全性、不易产生抗性的抗生素替代品。途径二是畜禽粪便施用前的无害化处理，常用的生物处理方式有好氧堆肥和厌氧发酵[46]，此外，也可通过粪便分离减缓抗生素残留[47]。途径三是在粪肥利用过程中，通过调控施用量、施用频率、施用时间等因素加速土壤中抗生素的消减[48]。最终从源头上控制抗生素的使用，在粪肥处理和末端利用中开发和优化去除抗生素残留技术，消减抗生素残留，遏制动物源细菌耐药，进而降低抗生素的生态风险，保障养殖业生产安全。
3 结论(1) 养鸡场及其周边土壤中5大类抗生素均普遍检出，检出率依次为：TCs>QLs>SAs>MAs>β-lactams。3类采样点中检出率及检出浓度依次为：粪便样>近土样>远土样，TCs和QLs的总浓度有依次衰减的趋势，暗示有向土壤环境迁移转化的可能。
(2) 关键环境因子TP、pH和TN对目标抗生素浓度差异性解释方差的贡献率分别为29.27%、15.08%和12.00%，且抗生素的浓度差异、吸附能力等通常受所有环境因子共同累加的影响。
(3) 养鸡场周边近土样生态风险高于对照远土样，TCs、QLs和MAs均表现为中低风险；周边近土与对照远土的RQ差值表明，各养鸡场已经对周边土壤产生不同程度的污染。
(4) 消减抗生素的对策应从抗生素使用源头、畜禽粪便处理过程和末端进入土壤3个方面着手。
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