土壤微生物是农田生态系统中最活跃的一部分，通常作为土壤环境发生变化的指示物^[1]，可反映土壤的健康程度^[2]，已成为目前生态农业研究的热点之一。土壤微生物对人为因素的干扰极其敏感，其中施用有机肥不仅可以影响土壤肥力和理化性质^[3]，而且还会引起土壤微生物结构和多样性的变化。随着研究的深入，越来越多的方法应用于土壤微生物研究当中，其中磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）分析法可以定量地反映不同类群活体微生物的量、微生物总量和群落结构等信息^[4-5]，具有分析速度快、方法简单、稳定性好等特点，因此在土壤微生物多样性分析中得到了广泛应用^[6-7]。白震等^[8]在种植玉米的农田上研究发现，与单施化肥相比，施用猪粪有机肥和猪粪有机肥化肥配施均有效地提高了土壤氮磷钾等养分的含量，土壤真菌、细菌的PLFA含量显著增加。李金岚等^[9]针对种植玉米的土壤进行研究，指出不同施肥处理中，化肥+有机肥（鸡粪）处理可明显增加土壤微生物总PLFA的含量，主成分分析结果显示，化肥+有机肥处理的微生物群落结构相较于不施肥和施化肥处理变化较大。张恩平等^[10]通过研究种植番茄土壤的微生物发现，配施有机肥（马粪）可提高番茄根际土壤微生物群落功能多样性，其中丰富度指数普遍高于单施化肥处理，香农指数、均匀度指数和优势度指数无显著差异。有机肥对土壤肥力和微生物群落结构影响显著，但目前的研究多集中于不同施肥方式，如有机肥化肥配施和单施化肥对土壤微生物群落结构的影响，而针对有机肥不同施肥量和菜地施用有机肥微生物群落结构变化的报道较少。

畜禽粪便中含有丰富的有机质和氮磷等营养元素，经过堆肥处理的畜禽粪便施用于土壤，可以减少养殖废弃物的排放，实现资源化利用，同时可替代化肥的使用，改善地力。鸡的消化道较短，对饲料消化率低，导致大量营养物质随粪便排出^[11]，鸡粪中氮、磷、钾含量相对较高，分别为1.63%、1.54%和0.85%^[12]，因此鸡粪作为有机肥主要原料之一，被广泛应用于农业生产当中。本研究通过大田试验，采用PLFA技术探讨鸡粪有机肥不同施用水平下，土壤化学特性和微生物群落结构的变化规律，旨在明确不同施肥量对土壤微生物群落结构的影响，以期为科学养田、提高菜地土壤生物学质量、确定有机肥合理施用量提供科学依据。

试验地点位于天津市东丽区露天菜地，该地土壤类型为潮土，基本化学特征为：pH 8.19，有机质28.23 g·kg^-1，阳离子交换量33.63 cmol·kg^-1，全氮0.83 g· kg^-1，全磷0.94 g·kg^-1，全钾14.61 g·kg^-1，铵态氮11.56 mg·kg^-1，硝态氮100.35 mg·kg^-1，有效磷117.58 mg· kg^-1。鸡粪有机肥购自天津市中埴盛华农业科技有限公司，其基础化学特性为：pH 8.39，有机质345.50 g· kg^-1，全氮21.56 g·kg^-1，全磷20.18 g·kg^-1，全钾15.8 g· kg^-1。

试验设置5个鸡粪施用量，分别为0、7.5、15、30、60 t·hm^-2，分别记为CK（不施肥）、T0.5（极低量有机肥）、T1（低量有机肥）、T2（中量有机肥）和T4（高量有机肥），其中T2为常规施肥量处理。每个处理3次重复，共15个小区，每个小区面积10 m²，各小区随机分组排列并用田埂隔开，小区内种植小油菜，品种为当地广泛种植的寒绿（Brassica chinenesis cv.Hanlv）。采用人工撒施的方法将有机肥于2017年4月15日一次性均匀施入小区内，翻耕，混匀（深度20 cm），浇水。小油菜共种植3茬，每茬油菜种植周期为40 d，每10 d左右灌一次水，使田间持水量保持在60%~80%。小油菜生长期间不再施用其他肥料，定期除草，按照田间常规管理方式进行管理。第3茬小油菜收获后，采用多点混合采样的方法采集各小区0~20 cm土层土壤样品，一部分土壤样品于-20 ℃冷冻保存，用于土壤PLFA的测定，另一部分土样在室内自然风干，去除杂物和植物的残体，研磨，过筛，用于土壤化学特性的测定。

土壤pH按照1:2.5固液比浸提，滤液使用pH计（NY/T 1377—2007）测定；土壤有机质采用重铬酸钾容量法（NY/T 1121.6—2006）测定；土壤阳离子交换量采用一次性平衡法测定；全氮采用自动定氮仪测定（NY / T 1121.24—2012）；铵态氮、硝态氮采用0.01 mol·L^-1的CaCl₂浸提，使用连续流动分析仪测定；全磷采用NaOH熔融-钼锑抗比色法测定；有效磷采用0.5 mol·L^-1 NaHCO₃浸提剂浸提，使用紫外分光光度计测定；土壤全钾采用NaOH熔融-原子吸收分光光度法测定。

磷脂脂肪酸（PLFA）的测定参照Bossio等^[13]的方法并进行改进。取冻干土样8.0 g，将土壤进行两次浸提与分离，然后依次进行萃取磷脂、酯化，以十九烷酸甲酯（C19:00）为内标，所得样品在气相色谱仪（Agilent 7890B）上采用美国MIDI公司生产的微生物自动鉴定系统（MIDI Sherlock）进行磷脂脂肪酸鉴定，每种磷脂脂肪酸的定量通过样品中的内标（C19:00）来表达^[14]。土壤微生物的磷脂脂肪酸的表征参照文献[15-17]，通过分析不同处理土壤特征磷脂脂肪酸的变化，来揭示土壤微生物群落组成及结构的变化，并以PLFA数据为依据，通过计算不同施肥处理的Simpson指数^[18]、Shannon指数^[18]和Pielou指数^[19]，分析土壤微生物的多样性、丰富度和均匀度的变化情况。

实验数据利用Excel 2013进行整理，采用DPS进行单因素方差分析及差异显著性分析，Canoco 5.0进行主成分分析和冗余分析，绘图使用Origin 2018软件。

土壤基本化学性质如表 1所示。土壤pH为7.80~8.26，呈弱碱性，与CK相比，施用极低和低量（T0.5和T1）鸡粪有机肥提高了土壤pH，但未达到显著水平（P > 0.05），中量和高量（T2和T4）显著降低了土壤pH（P < 0.05）。与不施肥相比，施用有机肥可以提高菜地土壤有机质（7.0%~34.1%）、CEC（5.8%~ 13.5%）、全氮（9.6%~48.2%）、全磷（10.6%~47.9%）、全钾（7.4%~35.5%）、铵态氮（8.7%~46.1%）、硝态氮（1.2%~3.9%）和有效磷（2.9%~14.7%）的含量，其中有机质、全磷、全钾、硝态氮和有效磷的含量随着有机肥施用量的增加而增大，且各处理有机质、全磷和全钾的含量均显著高于CK（P < 0.05）。

表 1 Table 1

表 1 土壤主要化学参数 Table 1 Main chemical parameters of soil

表 1 土壤主要化学参数 Table 1 Main chemical parameters of soil

有机肥不同施用量对土壤微生物PLFA的影响各不相同（表 2），土壤总PLFA、革兰氏阴性菌（G^-）、革兰氏阳性菌（G⁺）、细菌和真菌的PLFA变化趋势基本一致，PLFA含量表现为在极低量和低量施肥处理（T0.5和T1）下有所抑制，降低幅度分别为9.1%~ 11.7%、10.4%~18.9%、5.0%~6.5%、8.6%~13.1%和5.3%~7.7%，且除真菌外，其他较对照组均显著降低（P < 0.05）；而在中、高剂量有机肥处理（T2和T4）下，PLFA含量均有所上升，且在T4处理时显著升高并达到最大值，与CK相比，最高增幅分别为53.4%、65.5%、52.9%、52.1%和108.3%。

表 2 Table 2

表 2 土壤磷脂脂肪酸含量特征 Table 2 Content of phospholipid fatty acid(PLFA)in soils

表 2 土壤磷脂脂肪酸含量特征 Table 2 Content of phospholipid fatty acid(PLFA)in soils

前人研究发现G^- PLFA/G⁺ PLFA和真菌PLFA/细菌PLFA的比值可作为研究微生物群落结构变化的指标^[20]。投加鸡粪有机肥后真菌PLFA/细菌PLFA的比值均有所提高，且T2和T4处理显著高于CK（P < 0.05），其中T4处理比值最高。说明随着施肥量的增加，土壤真菌与细菌的构成发生了显著变化，真菌的占比增大，细菌反之。G⁺ PLFA/G^- PLFA的比值范围为0.83~1.04，T0.5处理比值最高，而T4处理比值最低。除T0.5和T1处理外，其他处理的G⁺ PLFA/G^- PLFA比值均低于对照，且随施肥量的增加而降低，并在T4处理达到显著水平（P < 0.05），说明有机肥不同施用量明显改变了土壤细菌结构。

由图 1可知，细菌为各处理土壤的优势微生物，其PLFA含量占微生物PLFA总量的75.6%~77.2%，细菌类群中，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌所占的比重较高，分别为25.5%~30.1%和23.2%~26.6%，革兰氏阴性菌在CK、T1、T2和T4处理中为优势菌群，占比分别为27.9%、27.5%、26.0%和30.1%；而在T0.5处理中则以革兰氏阳性菌为主，其占比为26.6%；两种菌群对不同施肥处理的响应结果不同。除细菌外，真菌的总PLFA含量占比较高，为3.6%~5.2%，且占比随施肥量的增加而升高（除T0.5处理外）。厌氧菌和真核生物PLFA含量占比则相对较少。

图 1 施用鸡粪有机肥对土壤微生物PLFA占比的影响 Figure 1 The ratio of microbes PLFA under different treatments of organic fertilizer from chicken excrement

Shannon指数表征微生物群落物种组成的多样性^[21-22]，其值越大，说明微生物物种的多样性越高。Simpson指数表征群落中最常见物种的优势度^[23-24]。Pielou指数反映群落中物种的均匀度^[23-24]。土壤微生物群落多样性的分析结果（表 3）表明，施用有机肥处理的Simpson指数、Shannon指数和Pielou指数较对照组均有不同程度的增加，其中Simpson指数的最大值出现在T2处理，为0.790，显著高于CK（P < 0.05），CK处理的值最小，为0.782；Shannon指数和Pielou指数值较高的是T2和T4处理，均显著高于CK（P < 0.05），并在T2时取到最大值。说明施用有机肥增加了土壤微生物的多样性，施肥量≥30 t·hm^-2时，对土壤微生物多样性的影响较大。

表 3 Table 3

表 3 磷脂脂肪酸生物标记物生态学指数 Table 3 Ecological index of phospholipid fatty acid biomarkers

表 3 磷脂脂肪酸生物标记物生态学指数 Table 3 Ecological index of phospholipid fatty acid biomarkers

不同处理的土壤磷脂脂肪酸主成分分析结果（图 2）表明，第一主成分轴和第二主成分轴对不同施肥处理的差异贡献率分别为90.4%和4.6%，其累计贡献率达到95.0%。各处理中，CK、T0.5、T1最为接近，均位于第三象限，说明以上3个处理微生物群落组成较为相似；而T2和T4分别位于第一象限和第四象限，表明T2和T4处理的微生物群落结构发生了较大的变化，且与CK、T0.5、T1处理差异显著。T2和T4处理与各类群微生物箭头指向基本一致，呈锐角，说明该施肥处理与微生物的PLFA含量相关性较强，而CK、T0.5、T1处理与箭头方向相反，呈钝角，说明其相关性较弱。以上结果表明，施肥改变了土壤原有微生物群落的组成和结构，尤其是在有机肥施用量为30 t·hm^-2和60 t·hm^-2时对各类群微生物的影响较大。

图 2 不同施肥处理的土壤微生物特征磷脂脂肪酸主成分分析 Figure 2 Principal component analysis of phospholipid fatty acids in soil microbial characteristics under different fertilization treatments

为解释引起土壤中微生物群落结构变化的主要环境因子，对各类群微生物PLFA含量与土壤化学特征进行冗余分析（Redundant analysis，RDA）（图 3）。首先对微生物群落的PLFA值进行除趋势对应（DCA）分析，结果表明其4个排序轴的长度均小于3，因此选用RDA进行分析。利用Canoco 5.0软件对影响土壤微生物群落结构变化的土壤基础化学性质等环境因子进行蒙特卡罗检验。有机质和全钾的膨胀因子（F）均大于20，与其他环境因子具有多重共线性，因此去除以上两个因子。筛选结束后选择CEC（F=2.6，P=0.110）、全氮（F=0.2，P=0.764）、全磷（F=3.6，P= 0.076）、硝态氮（F=13，P=0.004）、铵态氮（F=0.6，P= 0.468）、有效磷（F=3.9，P=0.070）、pH（F=6.3，P= 0.034）几个环境因子进行冗余分析。由图 4可知，两个排序轴对物种变量的解释度达87.2%，其中第一、第二排序轴分别解释了微生物群落变化的83.3%和3.9%。硝态氮和pH分别占总解释度的50.0%和11.9%，是对微生物结构变异影响较大的两个环境因子，其次是总磷（10.1%）、CEC（8.9%）和有效磷（5.7%），铵态氮和全氮所占的比例较小，分别为0.9%和0.3%。由环境因子与微生物PLFA箭头的夹角可知，CEC、pH与各微生物PLFA表现为负相关，有效磷、铵态氮、硝态氮、全氮、全磷与各菌群PLFA呈正相关。

图 3 土壤微生物群落特征与环境因子的RDA排序图 Figure 3 RDA ordination diagram of microbial communities characteristics and environmental factors of soil

施用有机肥可提高土壤肥力，改善土壤环境条件。胡诚等^[25]研究发现，随着有机肥施用量的增加，土壤pH降低，逐渐接近中性。本研究中，土壤pH在施肥量小于30 t·hm^-2时与不施肥相比无显著变化，施肥量为30 t·hm^-2和60 t·hm^-2时，pH低于不施肥处理，原因可能是大量施入有机肥使得土壤硝化作用增强，产生了大量的H⁺，从而降低了土壤的pH^[26]。宇万太等^[27]研究发现，施用有机肥能显著提高土壤中全磷和全钾含量，且高量有机肥处理增加幅度明显高于低量施肥处理，这与本研究结果相一致。宋蒙亚等^[20]发现，菜地土壤有效态养分含量增加的直接原因可能是大量施用有机肥后土壤的氮磷等营养物质得到了有效的补充，这也可能是本研究中土壤铵态氮、硝态氮和有效磷含量随着施肥量的增加不断累积，且在施肥量较高时明显增加的原因。弓萌萌等^[28]研究发现，土壤有机质含量随有机肥施用量的增加而增大，其主要原因是有机肥中有机质含量丰富，在本研究中，有机质的变化规律与上述结果一致，且施用鸡粪有机肥后有机质含量显著升高。

微生物是土壤生态环境中重要的组成部分，对土壤环境的变化极其敏感^[29]。施肥后土壤中微生物的量会发生明显变化，表现为显著增加^[30]。本研究中，微生物总PLFA的含量在施用较低剂量有机肥料（≤15 t·hm^-2）时低于CK，而中、高剂量（≥30 t·hm^-2）施肥处理则高于CK，此外，G^-、G⁺、真菌和细菌PLFA含量的变化规律与总PLFA基本一致。有机肥施用量较大时，土壤细菌和真菌均有所增加，其中真菌增长幅度相对较大，但细菌在微生物类群中仍占据绝对优势。大量有机肥提供的养分满足了土壤中微生物代谢活动的需要^[31]，同时缓解了土壤不适宜的酸碱度对微生物的影响^[32]；此外，施肥量较高时向土壤中输入了大量的外源微生物，在一定程度上起到了“接种”的作用^[33-34]。土壤微生物的生态学指数均明显高于不施肥处理，这与夏昕等^[35]的研究结果一致，施肥量为30 t· hm^-2时，土壤微生物的生态学指数最高，说明施用有机肥会增加土壤微生物群落的多样性，使土壤微生物的量及群落构成发生变化。施加高量有机肥（60 t· hm^-2）时，土壤微生物群落的多样性、丰富度和均匀度较常规施肥量虽有所降低，但Shannon指数和Pielou指数的降低幅度较小，均未达到显著水平。

真菌PLFA/细菌PLFA的值可反映土壤真菌与细菌的结构比例、土壤生态系统稳定性及健康程度，且比值越高越稳定^[36]。施用有机肥后，土壤真菌与细菌的磷脂脂肪酸比值均有所升高，中量和高量有机肥处理显著高于不施肥处理，这与裴雪霞等^[37]的研究结果一致，该结果说明施肥改变了真菌与细菌的比例结构，施用有机肥的土壤生态系统的稳定性优于不施肥处理，且施肥量≥30 t·hm^-2时更有利于生态系统的稳定性，其原因可能是真菌可通过菌丝移动来分解外来营养物质，且对碳源的同化效率高，而细菌则不具备此优势^[35]。施用有机肥为土壤提供了外来碳源，有利于真菌的生长繁殖，且施肥量较大时，真菌比细菌更占据优势。G⁺ PLFA/G^- PLFA的比值可表征土壤的营养状况，比值越低营养状况越好^[38]。本研究结果表明，随着有机肥投入量的增加，革兰氏阴性菌的相对丰度高于革兰氏阳性菌，且G⁺ PLFA/G^- PLFA的比值呈降低趋势，说明随着有机肥施用量的增加，土壤所受的营养胁迫降低，由表 1可知，施肥量较高时土壤营养状况明显改善。

主成分分析（图 2）将不同施肥量处理明显区分开来，分为不施肥处理和较低剂量有机肥处理、中量有机肥处理、高量有机肥处理3部分，这表明施肥量对土壤微生物的结构影响显著，且施肥量≥30 t·hm^-2时微生物群落结构开始发生转变。土壤微生物群落结构受到土壤理化性质的影响，因此微生物群落结构的改变也可能是由于不同施肥处理的土壤环境中理化性质的差异造成不同处理间微生物的生长、繁殖与富集不尽相同^[39]。牛佳等^[40]研究发现，土壤中的碳、氮含量是土壤微生物生长的主要限制因素。Bekku等^[41]认为土壤有机质和全氮可能是影响土壤微生物生长的主要因素。在本研究中，硝态氮（50%）、pH（11.9%）和总磷（10.1%）对群落结构改变的解释度最大，硝态氮和总磷是土壤养分的重要组成部分，说明施用有机肥主要是通过改变土壤氮磷的养分水平及土壤的酸碱度，从而对土壤微生物群落结构产生影响，这与章家恩等^[42]和孙瑞莲等^[43]的研究结果相一致。CEC和pH与各微生物PLFA的量表现为负相关，这可能是造成施肥量较低时，土壤微生物PLFA含量降低的原因。张蓉等^[44]以复垦多年的林地和草地为研究对象，发现CEC与土壤微生物PLFA含量呈正相关，与本试验研究结果相反，这可能与研究区域土壤本身性质、土壤利用方式及气候因素等的差异有关，其具体原因还有待进一步验证。

（1）施加鸡粪有机肥有效地改变了土壤的化学性质，提高了土壤肥力。在极低量有机肥处理下土壤铵态氮、硝态氮和有效磷含量未明显增加；而不同施肥水平下，土壤CEC、有机质、全氮、全磷和全钾含量均显著增加。

（2）中量和高量有机肥处理促进了土壤微生物PLFA含量的增加，土壤微生物生态指数的增长，明显提高了真菌与细菌磷脂脂肪酸的比值。

（3）施加鸡粪有机肥有效地改变了土壤微生物的群落结构，且施加中量和高量有机肥处理（≥30 t· hm^-2）土壤微生物群落结构显著区别于不施肥和较低剂量有机肥处理（≤15 t·hm^-2），驱动土壤微生物群落组成发生变化的主要因素为硝态氮、全磷和pH。