2020, Vol. 39
2. 广西师范大学环境与资源学院, 广西 桂林 541004;
3. 广西师范大学生命科学学院, 广西 桂林 541004
2. College of Environment and Resource, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China;
3. College of Life Science, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China
2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国土壤环境状况不容乐观。其中，镉污染点位超标率为7.0%，砷污染点位超标率为2.7%，在无机污染物中位列第一和第三[1]。因此，对于土壤镉-砷污染的修复至关重要。植物-微生物联合修复是近年来土壤修复的研究热点。有研究表明，一些根际微生物对植物的生长具有显著的促进作用[2]，被称作“根际促生菌”。另外，部分耐重金属的微生物还能显著提高植物对重金属的富集能力[3-4]。Nie等[5]的研究表明，植物促生菌Enterobacter cloacae CAL2通过分泌氨基环丙烷羧酸脱氢酶（1-aminocyclopropane -1-carboxylic acid，ACC），有效促进了欧洲油菜（Brassica napus L.）对砷的富集。赵根成等[6]的研究也表明，接种放线菌PSQ、sh2和细菌TS37、C13显著提高了蜈蚣草（Pteris vittata L.）对砷的富集。
研究表明，在植物受到外界胁迫时如重金属胁迫，植物体内的抗氧化酶及非酶抗氧化剂可以清除植物体内过多的活性氧物质，以减轻逆境胁迫对植物的损伤，是植物抵抗逆境胁迫的重要防御机制[7]。根际微生物可通过提高植物对非生物逆境胁迫的忍耐能力从而促进植物在逆境胁迫下的生长。汤叶涛等[8]研究发现，高浓度镉胁迫导致滇苦菜（Picris divarica- ta）体内H2O2和丙二醛（MDA）含量以及阴离子超氧自由基产生速率显著提高。李燕等[9]研究表明，重金属锰对短毛蓼（Polygonum pubescens Blume）的胁迫引起了植物体内H2O2和MDA的累积，同时超氧化物歧化酶（SOD）活性随着外界重金属浓度的升高而升高。张子杨等[10]的研究表明，接种Streptomyces pactum Act1对包心芥菜（Brassica juncea）的抗氧化酶系统有积极作用，可以有效降低MDA的含量，提高植物对镉的富集能力。Pandey等[11]的研究表明镉耐受菌Ochrobactrum sp.和砷耐受菌Bacillus sp.的接种可以有效提高水稻（Oryza sativa L.）根部的SOD含量，并且可以通过分泌ACC促进水稻的生长，提高其对镉和砷的富集能力。
水蓼（Polygonum hydropiper L.）[12]和酸模叶蓼（Polygonum lapathifolium L.）[13]作为两种常见的蓼科植物，具有较好的锰富集和耐受能力。肠杆菌FM-1（Enterobacter sp. FM-1）为新发现的对镉具有一定耐性且对植物有一定促进作用的微生物[14]，但水蓼和酸模叶蓼对于镉和砷的富集性能，以及肠杆菌对其的促生特性尚未有研究报道。因此，本研究通过灌根的方式，研究了肠杆菌对水蓼和酸模叶蓼生长、镉和砷富集以及植物抗氧化酶系统和非酶系统的影响，旨在为镉-砷复合污染土壤的植物-微生物联合修复提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法 1.1 实验材料镉耐受菌——肠杆菌FM-1，GenBank登录号：MF664375；中国典型培养物保藏中心保藏号：2017825[14]。水蓼和酸模叶蓼采自广西桂林漓江沿岸。
镉-砷复合污染土壤采自广西桂林阳朔思的村。土壤采集时先去除地表杂物，然后采用蛇形5点法采集0~20 cm的土壤，混合均匀后，置于塑料袋中运回实验室。土壤经自然风干后，一部分过4 mm筛，另一部分过0.149 mm的尼龙筛备用。土壤的理化性质采用鲁如坤的《土壤农业化学分析法》 [15]进行测定，结果见表 1。
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表 1 土壤理化性质 Table 1 Physical and chemical character of soil |
将过4 mm孔径筛的土壤装入直径为25 cm的黑色塑料盆，每盆2.5 kg；并加入基肥，基肥标准：N 100 mg·kg-1（以干土计，下同），以NH4NO3形式加入；P和K分别为80 mg·kg-1和100 mg·kg-1，以KH2PO4形式加入，每30 d施加追肥一次。水蓼和酸模叶蓼采用扦插的方式进行栽培，选取长势良好且粗细一致的茎，用自来水冲洗2~3次，洗掉泥土，用剪刀剪成长度约为5 cm的茎段，保留一个完整的节间和一个腋芽。将剪短的植物茎段插入装好土壤的盆中，保留腋芽于土壤上面。每盆扦插4株，定期浇水，保持在田间最大持水量的60%。
1.2.2 微生物接种在植物长出新芽且培养15 d后，以灌根的方式分别接种OD600值为0.25、0.5和1.0的菌悬液（其对应的浓度分别为5.5×108、1.0×109、2.8×109 CFU·mL-1）30 mL于未灭菌的土壤中，每7 d接种一次（在前期的试验中以7 d为间隔向土壤中接种菌悬液1次），保证土壤中的肠杆菌浓度维持在6.6×106、1.2×107、3.4×107 CFU·g-1土左右。以不加肠杆菌为对照。
1.2.3 植物收获及重金属含量分析待植物培养60 d后，取出植物样品，首先用自来水冲净，再浸入20 mmol·L-1的EDTA-Na2溶液中交换20 min，以除去附着的重金属，最后用去离子水洗净，用吸水纸将水分吸干，用天平称量生物量。采集同一位置的叶片置于-20 ℃冰箱用于抗氧化酶和非酶物质的测定，其他部分分为植物根、茎和叶，并分开装入信封，在105 ℃烘箱中杀青30 min，且在70 ℃下烘干48 h至恒质量。烘干的植物样品用不锈钢粉碎机磨碎，用于分析重金属含量。同时测定根际土壤的pH值[16]、有效态砷含量[17]以及水提态镉含量[18]。
1.2.4 叶绿素、类胡萝卜素、O 2-·、H2O2和丙二醛（MDA）含量的分析水蓼和酸模叶蓼叶片中叶绿素、类胡萝卜素、H2O2和O 2-·的分析参考Li等[19]的方法，MDA的分析采用Quan等[20]的方法。
1.2.5 抗氧化酶活性的测定准确称取0.20 g去叶脉剪碎的叶片于预冷研钵中，加1 mL预冷的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液在冰浴上研磨成匀浆，加缓冲液至体积为8 mL。在4 ℃条件下10 000 r·min-1离心15 min，上清液即为粗提液，用于超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的测定。其中SOD、CAT和POD的分析参考Parida等[21]和Wu等[22]的方法。
1.2.6 巯基、谷胱甘肽和植物螯合肽含量分析巯基（- SH）、谷胱甘肽（GSH）和植物螯合肽（PCs）含量的分析采用El-Zohri等[23]的方法。
1.3 数据处理实验数据均以3次重复的平均数±标准误差表示。方差分析采用SPSS 19.0软件完成，绘图采用Ex- cel 2010软件完成。
2 结果与分析 2.1 接种肠杆菌对根际土壤pH、砷的有效态以及镉的水提态含量的影响接种肠杆菌（≥1.2×107 CFU·g-1土）显著降低了水蓼和酸模叶蓼根际土壤pH，提高了砷的有效态以及镉的水提态含量。当接种浓度为3.4×107 CFU·g-1土时，水蓼和酸模叶蓼根际土壤pH较对照下降了0.35个和0.28个单位（图 1A）；水蓼根际土壤镉的水提态和砷的有效态含量分别为1.45 mg·kg-1和1.64 mg· kg-1，较对照分别增加了30%和21%；酸模叶蓼根际土壤镉的水提态和砷的有效态含量分别为1.35 mg·kg-1和1.59 mg·kg-1，较对照分别增加了29%和17%（图 1B）。
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数据表示平均值±标准偏差（n=3），不同小写字母代表各处理组间差异显著（P<0.05）。下同 Data is shown as mean±SE(n=3). The different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P<.05). The same below 图 1 接种肠杆菌对水蓼和酸模叶蓼根际土壤pH、砷的有效态以及镉的水提态含量的影响 Figure 1 Effect of Enterobacter sp. addition on the pH and bioavailable concentration of arsenic and water-soluble concentration of cadmiun in rhizosphere soil of Polygonum hydropiper L. and Polygonum lapathifolium L. |
接种肠杆菌对蓼科植物的株高、株质量有不同程度的影响。当接种浓度小于3.4×107 CFU·g-1土时，水蓼的株高、株质量与对照间无显著差异（P>0.05）。酸模叶蓼的株高随接种浓度的增加而显著提高（P<0.05）；当接种浓度为6.6×106 CFU·g-1土时，酸模叶蓼的株质量与对照无差异（P>0.05）。当浓度为3.4×107 CFU·g-1土时，水蓼和酸模叶蓼的株高和株质量显著增加（P<0.05），此时，水蓼的株高和株质量分别为对照的1.54倍和1.45倍。酸模叶蓼的株高和株质量分别为对照的2.27倍和1.33倍（图 2）。
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图 2 接种肠杆菌对植物株高和株质量的影响 Figure 2 Effect of Enterobacter sp. addition on the height and weight of plant |
另外，随着肠杆菌接种浓度的增加，水蓼和酸模叶蓼根茎叶中镉、砷含量呈增加的趋势。当接种浓度为3.4×107 CFU·g-1土时，除酸模叶蓼根中镉含量外，水蓼和酸模叶蓼根茎叶中的镉、砷含量显著高于对照（P<0.05）。此时，水蓼根中的镉和砷含量最高，分别达到了81.2 mg·kg-1DW和33.9 mg·kg-1DW，分别为对照的1.64倍和1.68倍（图 3A）。水蓼茎中的镉和砷含量分别为对照的1.68倍和1.74倍；酸模叶蓼茎中的镉和砷含量分别为对照的2.51倍和1.21倍（图 3B）。水蓼叶中的镉和砷含量分别为对照的2.74倍和1.92倍；酸模叶蓼叶中的镉和砷含量分别为对照的2.12倍和1.86倍（图 3C）。
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图 3 接种肠杆菌对水蓼和酸模叶蓼根茎叶中砷、镉含量的影响 Figure 3 Arsenic and cadmium content in roots, stems and leaves of Polygonum hydropiper L. and Polygonum lapathifolium L. under different bacterial-inoculated level |
从表 2中可以看出，接种肠杆菌（≥1.2×107 CFU· g-1土）显著提高了水蓼和酸模叶蓼叶片中的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量以及水蓼叶片中的总叶绿素含量（P<0.05）。其中，接种浓度为3.4×107 CFU· g-1土时，水蓼和酸模叶蓼叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量分别为对照的1.46、2.14、1.61、3.32倍和2.73、2.98、2.04、1.47倍。另外，接种浓度为3.4×107 CFU·g-1土时显著降低了水蓼和酸模叶蓼叶片中叶绿素a/叶绿素b的值（P<0.05），与对照相比分别降低了31.5%和40.5%。
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表 2 接种肠杆菌对植物叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、叶绿素a/叶绿素b和类胡萝卜素含量的影响 Table 2 Effects of Enterobacter sp. addition on the content of chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll, chlorophyll a/chlorophyll b and carotenoids in the leaves of Polygonum hydropiper L. and Polygonum lapathifolium L. |
从表 3中可以看出，接种肠杆菌（≥1.2×107 CFU· g-1土）显著降低了水蓼和酸模叶蓼叶片中O2-·、H2O2和MAD的含量（P<0.05）。当接种浓度为3.4 × 107 CFU·g-1土时，水蓼和酸模叶蓼叶片中O2- ·、H2O2、MAD的含量分别比对照降低了16.9%、74.9%、28.8%和19.5%、59.3%、19.6%。从表 3中可以看出，接种浓度≥1.2×107 CFU·g-1土时显著提高了水蓼叶片中SOD、POD、CAT的活性（P<0.05），分别为对照的1.65、12.81、2.19倍；当接种浓度为3.4×107 CFU·g-1土时显著提高了酸模叶蓼叶片中POD和CAT的活性，此时分别为对照的2.09倍和3.36倍。但接种肠杆菌对酸模叶蓼叶片中的SOD活性未产生显著影响（P>0.05）。
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表 3 接种肠杆菌对水蓼和酸模叶蓼叶片中MDA、O2- ·、H2O2含量及抗氧化酶活性的影响 Table 3 Effects of Enterobacter sp. addition on the content of MDA, O2- ·, H2O2 and antioxidant enzyme activity in the leaves of Polygonum hydropiper L. and Polygonum lapathifolium L. |
当接种肠杆菌浓度≥1.2×107 CFU·g-1土时，水蓼和酸模叶蓼叶片中-SH、PCs和GSH的含量显著增加（P<0.05）。当接种浓度为3.4×107 CFU·g-1土时，水蓼和酸模叶蓼叶片中-SH、PCs、GSH的含量分别比对照增加了92%、97%、104%（图 4A）和111%、124%、96%（图 4B）。
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图 4 接种肠杆菌对水蓼和酸模叶蓼叶片中-SH、PCs、GSH含量的影响 Figure 4 Effect of Enterobacter sp. addition on the content of –SH, PCs and GSH in the leaves of Polygonum hydropiper L. and Polygonum lapathifolium L. |
从表 4可以看出，根际土壤pH、土壤镉水提态含量和砷有效态含量与接菌量呈极显著相关关系（P<0.001），而植物种类仅对根际土壤pH和镉水提态含量的变化产生显著影响（P<0.05）。接菌量与植物的交互作用对根际土壤pH和砷有效态含量以及镉水提态含量均没有显著影响（P>0.05）。
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表 4 二元方差分析（F-值和P-值）考察植物种类、接菌量及其交互作用对指标的影响 Table 4 F-values and P-value of a Two-way ANOVA of measured parameters of Polygonum hydropiper L. and Polygonum lapathifolium L., treated with different inoculation level |
本研究发现，当肠杆菌FM-1接种浓度为3.4×107 CFU·g-1土时，水蓼和酸模叶蓼的株高和株质量显著增加（P<0.05）（图 2），这表明肠杆菌有利于植物的生长，是一种良好的植物促生菌。有研究表明，植物根际促生菌可直接或间接地促进宿主植物的生长[20]，其促生机制主要包括：分泌植物生长素，如吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、氨基环丙烷羧酸（1-ami- nocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脱氢酶、铁载体（Siderophore）等促生物质[22]；分泌有机酸和释放矿质中难溶的营养元素促进植物生长[21]；通过固氮作用促进植物生长；提高植物的抗逆性等[23]。另外，接种肠杆菌FM-1显著提高了水蓼和酸模叶蓼的叶绿素及类胡萝卜素含量（表 2），叶绿素含量的增加有利于植物的光合作用，从而促进植物生长。这与Guo等[24]通过在镉污染土壤中接种植物促生菌Bradyrhizobi- um sp. YL-6，从而通过菌株分泌铁载体和吲哚乙酸，有效促进黑麦（Lolium multiflorum Lam.）和大豆（Gly- cine max L.）生长的研究结论相似。在我们的前期研究中发现肠杆菌FM-1可以通过分泌吲哚乙酸、铁载体及其具有良好的溶磷性，来促进积雪草对土壤中镉的富集[25]。
本研究结果表明，接种肠杆菌FM-1降低了水蓼和酸模叶蓼根际土壤的pH（图 1），促进了水蓼和酸模叶蓼根茎叶对镉和砷的富集（图 3），这可能与土壤中能被植物直接利用的镉、砷浓度有关。大量的研究结果表明，土壤pH的降低有利于土壤水提态镉的增加，从而增加植物可利用镉含量，增加植物对镉的吸收。Rajkumar等[26]发现植物促生菌Pseudomonas sp. PsM6和Pseudomonas jessenii PjM15通过分泌铁载体来提高土壤中重金属的生物可利用性，从而提高蓖麻（Rici- nus communis）对重金属的富集。Prapagdee等[27]发现植物促生菌Micrococcus sp. MU1和Klebsiella sp. BAM1通过分泌大量的吲哚乙酸来增加重金属的生物可利用性，从而提高向日葵（Helianthus annuus）对镉的富集。
土壤pH的降低一般不利于砷的溶解，但本实验中肠杆菌的添加降低了水蓼和酸模叶蓼根际土壤的pH（图 1），而植物的砷含量却增加，这可能与微生物对土壤砷的作用有关。耐砷菌株Pseudomonas 2-23T的添加明显提高了砷沉积物中砷的释放能力[25]。抗砷菌株E、G可以增强蜈蚣草对砷的吸收能力[28]。另外，这还可能与土壤砷的价态有关。通常在pH < 7时，随着土壤pH的升高，As（Ⅲ）的吸附量逐渐增加，As（Ⅴ）的吸附量逐渐降低[29]。对于添加肠杆菌所引起的蓼科植物砷吸收量的增加，究竟是肠杆菌促进了土壤砷的溶解还是改变了砷的价态，还有待进一步研究。由此可见，在镉-砷复合污染土壤中接种肠杆菌FM-1，不仅有效地促进了水蓼和酸模叶蓼的生长，而且提高了水蓼和酸模叶蓼对镉和砷的富集，是一种良好的植物促生菌。
当植物受到重金属胁迫时，会超量产生超氧自由基（O2- ·）等活性氧物质（Reactive oxygen species，ROS）。超量活性氧物质的存在会造成植物体内DNA、蛋白质被破坏以及膜脂过氧化等伤害症状[30]。此时，SOD、POD和CAT等抗氧化酶在去除环境应激活性氧方面发挥着重要作用[31]。SOD可以有效清除植物体内多余的活性氧，是植物抗氧化酶系统中首先起作用的酶[32]。在SOD作用下，O2- ·发生歧化反应产生大量的过氧化氢，而这些过氧化氢可以在植物体内CAT和POD的作用下被清除。植物叶片内的CAT可以有效清除植物体内多余的过氧化氢。本研究结果表明，接种肠杆菌FM-1能够更好地激活水蓼叶片中的SOD、POD和CAT的酶活性（表 3），加速催化水蓼叶片中O2- ·向H2O2的转变。对于酸模叶蓼，尽管肠杆菌FM-1的接种也提高了酸模叶蓼叶片中POD和CAT的含量，但是相对水蓼而言，提高的幅度不大。因此，在应对镉-砷复合污染的胁迫时，水蓼的应激机制更为有效，所以在同等条件下，水蓼的根茎叶中可以富集更多的镉。这与沈亚琴等[33]对接种丛枝菌根可以有效激活玉米的抗氧化酶系统、帮助其缓解膜脂过氧化程度、减轻锑对玉米胁迫的研究结果相似。
抗氧化酶系统并非植物体清除氧化胁迫的唯一途径，植物还可以通过非酶物质（GSH、PCs）系统消除活性氧物质的胁迫。其中GSH是植物体内的抗氧化剂，当植物受到氧化胁迫时，植物叶绿体及其他细胞区室内会产生较高浓度的GSH参与活性氧物质的清除[34]；PCs可以通过螯合作用清除活性氧，是植物缓解重金属毒害的重要物质[35-37]。当水蓼和酸模叶蓼根茎叶中镉、砷含量显著增加时，其叶片中的MDA含量显著降低，这表明两种植物的叶片并未受到膜脂过氧化的伤害，无氧化应激反应[38]。这与秦余丽等[39]对丛枝菌根（Arbuscular Mycorrhiza）-黑麦草（Lolium multi⁃ florum L.）联合修复可以有效降低番茄（Lycopersicon esculintum Mill.）叶片中的MDA含量的结果相似。这表明接种肠杆菌虽然促进了叶片中镉、砷含量的累积，但植物通过抗氧化酶和非酶系统消除了活性氧物质对植物的伤害，从而提高了水蓼和酸模叶蓼的叶绿素含量，有利于植物的生长。
4 结论（1）接种肠杆菌可以降低根际土壤的pH；接种浓度为3.4×107 CFU·g-1土时，水蓼和酸模叶蓼根茎叶中的镉、砷含量均提高，表明肠杆菌促进了水蓼和酸模叶蓼对镉和砷的吸收。
（2）接种肠杆菌可以提高水蓼和酸模叶蓼叶片中叶绿素及类胡萝卜素的含量，同时提高株高和株质量，表明肠杆菌能够促进水蓼和酸模叶蓼的生长。
（3）接种肠杆菌可以提高水蓼和酸模叶蓼叶片中SOD、POD、CAT的活性，同时提高植物叶片中GSH及PCs的含量，降低O2- ·及MDA的含量，有效缓解了重金属对植物的毒害。
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