2020, Vol. 39
2. 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 农业农村部农业环境重点实验室, 北京 100081
2. Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-Environment, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081, China
砷是一种自然环境中广泛存在且有剧毒的类金属元素[1]。砷在自然环境中的形态主要包括无机态砷[三价砷As（Ⅲ）、五价砷As（Ⅴ）]和有机态砷（一甲基砷MMAs、二甲基砷DMAs和三甲基砷TMAsO）[2]。不同形态的砷在土壤中的毒性相差很大，其中As（Ⅲ）毒性分别比DMAs和TMAsO高出100倍和1000倍[3]。水稻特殊的淹水栽培环境及喜磷和喜硅的生理特性是造成其对砷具有很强敏感性的重要原因[4-5]。如我国湖南郴州的某些矿区，水稻籽粒中的无机砷含量可达0.5~7.5 mg·kg-1，远超我国对水稻砷含量的限值（0.2 mg·kg-1无机砷）[6]。根据现有报道，通过稻米摄入的无机砷量占我国人群无机砷平均摄入量的60%[7]，长期食用含砷稻米将对人体健康造成严重的危害[8]。
稻田土壤中的砷能在微生物介导作用下发生甲基化作用，经过还原-甲基化交替的过程，亚砷酸盐（H3AsO3）中的羟基不断被甲基取代，最终形成还原态有机砷被挥发到大气中[9-10]。研究表明每年约有419~1252 t的砷从水稻土中释放到大气中[11]。最新研究发现，水稻籽粒累积过量的有机砷，特别是DMAs，能诱导水稻产生直穗病[12]，而水稻植株本身无法实现对无机砷的甲基化，因此其累积的有机砷主要来自稻田土壤[13]。稻田土壤砷的甲基化主要受土壤微生物如细菌或真菌体内的砷甲基化功能基因（arsM）调控[14]。土壤中砷的甲基化过程受到多种因素影响，有机质是其中的关键因素[15]。Edvantoro等[16]研究表明，随着有机质添加量的增加土壤中砷的挥发量逐渐增加，砷的甲基化程度逐渐提高。施用有机质的种类和浓度不同，促进砷甲基化的效果亦有差异。Mohapa⁃ tra等[17]研究表明，添加牛粪可显著促进厌氧甲烷菌对砷的挥发，砷含量为30 mg·L-1的培养条件下添加牛粪25 g·L-1时，砷的挥发量最高，约为总砷含量的35%；Huang等[18]研究了添加苜蓿和处理过的谷物对土壤中砷挥发的影响，结果表明，添加处理过的谷物后砷的挥发量（9.8 μg·kg-1·月−1）高于添加苜蓿的处理约2倍。土壤中有机质来源广泛，不同来源的有机质差异性地促进土壤中砷挥发的效应仍然不是很明确，特别是有机质中相对更为活跃的可溶性有机质（DOM），其对土壤中砷甲基化和挥发的贡献以及相关的分子生物学机制还少有报道。DOM在土壤中的含量不到土壤总有机质的1%，但对土壤营养物质的活化、重金属和有机污染物的迁移转化、微生物区系改变等有极其重要的作用[19-21]，本文假设不同有机物来源的DOM添加可差异性改变砷甲基化功能基因arsM丰度进而影响砷甲基化进程。
本研究首先制备不同有机物来源的DOM，通过向砷污染水稻土壤中添加含不同有机碳（TOC）浓度的DOM，分析土壤上清液不同砷形态含量、arsM和总细菌（16S rRNA）丰度以及关键理化因子如土壤pH、EC值的变化，探究不同可溶性有机质添加对土壤砷甲基化效率的影响及其可能机制，相关结果对于今后砷污染稻田通过合理施肥影响砷甲基化效率有重要科学价值。
1 材料与方法 1.1 土壤样品及理化性质供试土壤采自湖南省石门县雄黄矿区（29°38′ N，111°01′E）砷污染水稻土壤，类型为发育自第四纪红土母质的红壤。土壤样品经自然风干后混合均匀，去除植物残根和石砾，并用玛瑙研钵研磨后过2 mm和0.25 mm尼龙筛备用。土壤中总砷含量为60 mg· kg-1，有效态砷采用0.5 mol·L-1的NaHCO3溶液浸提后用原子荧光光谱仪（AFS-9120，北京吉天仪器，中国）测定[22]，含量为1.45 mg·kg-1。供试土壤其他理化性质见表 1，测定分析方法参照《土壤农化分析》[23]。
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表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 The physical and chemical properties of the experimental soils |
试验所用DOM制备的原料分别选自动物源的猪粪、牛粪和鸡粪以及植物源的水稻秸秆。鸡粪取自中国农业大学鸡养殖场，猪粪和牛粪取自中国农业科学院北京马池口基地，水稻秸秆取自中国农业科学院岳阳试验站，其中采取的猪粪、牛粪和鸡粪都已腐熟发酵。猪粪、牛粪和鸡粪自然风干研磨后过20目（0.850 mm）筛备用，水稻秸秆自然风干后，剪成长度为2 cm左右的秸秆碎屑备用。猪粪、牛粪、鸡粪DOM溶液利用超纯水浸取（粪:水=1:10）[21]：分别称取15 g猪粪、牛粪和鸡粪研磨物，置于200 mL三角瓶中，分别加入150 mL超纯水，在25 ℃下，200 r·min-1振荡16 h。然后将振荡液取出，分批转入50 mL离心管中，4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min。将离心后的上清液于0.45 µm醋酸水系滤膜上过滤，滤液即为猪粪、牛粪、鸡粪的DOM原液，将其置于4 ℃冰箱中保存备用。水稻秸秆DOM溶液的制备[24]：将秸秆碎屑10 g与石英砂100 g按1:10（质量比）混合均匀后置于250 mL烧杯中，加入足量超纯水使秸秆湿度达到最大持水量的80%，封口膜密封，用竹签扎孔透气，放入培养箱中，（25±1）℃恒温培养60 d，每隔5 d用称质量的方法补充水分。培养初始加入新鲜土壤提取液5 mL作为接种液（取新鲜水稻土10 g，与450 mL超纯水混合，振荡2 h，静置过夜，上清液用定量滤纸过滤，即为接种液）。培养60 d后，秸秆培养液取出加入一定量超纯水（秸秆石英砂混合质量的2倍）混匀，然后分批转入200 mL三角瓶中，在200 r·min-1条件下振荡2 h，然后将振荡液取出，分批转入50 mL离心管中，4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min。将离心后的上清液于0.45 µm醋酸水系滤膜上过滤，滤液即为水稻秸秆DOM原液，将其置于4 ℃冰箱中保存备用。从猪粪、牛粪、鸡粪和水稻秸秆中提取的DOM分别标记为PD、CDD、CMD和RD，其理化性质如表 2所示，所有制备的DOM在实验前均经γ射线照射灭菌处理。
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表 2 供试可溶性有机质（DOM）原液的基本理化性质 Table 2 The physical and chemical properties of the experimental dissolved organic matter(DOM)original solution |
培养试验共设置4个不同来源DOM处理，各处理设置4个不同TOC浓度（40、80、160 mg·L-1和320 mg·L-1）水平，试验以添加等体积超纯水作为对照（CK），每个TOC浓度设置4个重复。试验过程如下：称取30 g过2 mm筛的供试水稻土转移到50 mL聚乙烯离心管中，每个离心管中加入30 mL不同TOC浓度的DOM溶液，实验过程中保持淹水液面高于土壤表面2 cm。将离心管在（25±1）℃下恒温培养40 d，每隔5 d用称质量的方法补充水分。培养结束后，测定各处理土壤pH及EC值，然后将水土混合液振荡均匀，在常温下以4600 r·min-1离心20 min，将上清液转移到50 mL离心管中，放置于-20 ℃冰箱保存，用于砷形态的测定；将离心后的土壤装入2 mL离心管中，保存于-80 ℃冰箱，用于qPCR分子试验。
1.4 样品分析与测定上清液砷形态分析：采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS，PerkinElmer NexION 300X）进行土壤上清液砷形态分析[25]。将土壤上清液从-20 ℃冰箱中取出在常温下融化，过0.22 µm滤膜后进行砷形态测定。因为As（Ⅲ）与TMAsO在阴离子色谱柱中出峰时间一致，故测定时按待测液与H2O2体积比9:1混合以氧化样品中As（Ⅲ）为As（Ⅴ）[26]。砷形态分析过程中标准曲线R2值大于0.99。为了进行质量控制，每间隔10个样品检测一次As（Ⅲ）单标溶液（GBW08666，中国计量科学研究院）或DMAs单标溶液（GBW08669，中国计量科学研究院）。各砷形态单标溶液中砷的回收率为91%~102%。
土壤arsM和16S rRNA拷贝数分析：通过BioRad CFX96定量PCR仪（美国BIO-RAD）对土壤中提取的DNA进行qPCR扩增。arsM基因的扩增引物为arsMF（5′ -TCYCTCGGCTGCGGCAAYCCVAC-3′）和arsMR（5′ - CGWCCGCCWGGCTTWAGYACCCG-3′）[27]；16S rRNA的扩增引物为BACT1369F（5 ′ - CGGTGAATACGTTCYCGG-3 ′）和PROK1492R（5 ′ -ACGGCTACCTTGTTACGACTT - 3′）[28]。arsM基因qPCR反应体系为20 µL（试剂来自Takara）：7.2 µL ddH2O、10 µL SYBR、0.4 µL arsMF和0.4 µL arsMR，以及0.2 µL DNA样品（10倍稀释）。16S rRNA qPCR反应体系为20 µL（试剂来自Takara）：7.2 µL ddH2O、10 µL SYBR、0.4 µL BACT1369F和0.4 µL PROK1492R，以及0.2 µL DNA样品（1000倍稀释）。qPCR的反应程序：首先94 ℃变性1 min；然后变性30 s，退火30 s（arsM：67 ℃；16S rRNA：56 ℃），72 ℃延伸1 min，共40个循环；最后72 ℃末端延伸1 min，熔融曲线（Melt Curve）55 ℃ 30 s。
土壤pH和EC值测定：土壤pH值用pH计（Thermo Orion 4 Star，Beverly，USA）测定，土水比为1:2.5。土壤EC值用FiveEasy FE30K型电导仪测定，土水比为1:5。
1.5 数据处理砷形态分析使用Nexion软件（版本1.0.1916）进行。采用Excel 2013和SPSS 21进行绘图和数据统计分析，处理间方差分析采用LSD法在0.05水平下进行。所有数据均表示为平均值±标准误（SE）。
2 结果与分析 2.1 添加不同来源DOM对土壤中砷形态变化的影响添加不同TOC浓度的DOM可显著改变水稻土壤中砷的形态（图 1）。研究发现各处理中砷形态主要包括无机砷（iAs）、MMAs、DMAs和TMAsO，且不同处理中各形态砷含量均随TOC浓度增加呈现不同程度的增加。PD处理，当TOC浓度达到320 mg·L-1时，DMAs含量（3.1 µg·L-1）显著高于对照（1.1 µg·L-1），当TOC浓度达到160 mg·L-1时，TMAsO含量（0.4 µg·L-1）显著高于对照（0.2 µg·L-1）；CMD处理，当TOC浓度达到320 mg·L-1时，iAs、MMAs、DMAs和TMAsO含量均显著高于对照（1.4、0.9、1.1 µg · L-1和0.2 µg · L-1），且分别约是对照的1.4、1.8、2.0倍和2.3倍；CDD处理，当TOC浓度为320 mg·L-1时，MMAs和DMAs含量分别为1.3 µg·L-1和2.1 µg·L-1，均显著高于对照（0.9 µg·L-1和1.1 µg·L-1），而iAs含量和TMAsO含量与对照相比无显著差异；RD处理，当TOC浓度为320 mg·L-1时，iAs（2.2 µg·L-1）、DMAs（2.0 µg·L-1）含量和TMAsO含量（0.3 µg·L-1）与对照相比均显著增加，而4个浓度下MMAs含量与对照相比均无显著差异。此外，不同来源DOM处理的有机砷占砷形态总量的比例显著增加，其中CMD-320总甲基态砷（MMAs + DMAs+TMAsO）含量为4.2 µg·L-1，占砷形态总量（6.2 µg·L-1）的68.3%；CDD-320甲基态砷含量为3.6 µg· L-1，占砷形态总量（4.7 µg·L-1）的75.7%；RD-320甲基态砷含量为3.5 µg·L-1，占砷形态总量（5.6 µg·L-1）的61.8%；而PD-320处理中甲基态砷比例最大，含量为4.7 µg·L-1，占砷形态总量（6.2 µg·L-1）的75.8%。
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不同小写字母表示相同砷形态下不同TOC浓度处理之间差异显著（P < 0.05）。40、80、160、320表示TOC含量，mg·L-1 Different lowercase letters indicate the significant differences(P < 0.05)among the different TOC concentration gradient treatments of the same arsenic species. 40, 80, 160 and 320 represent TOC contents in mg∙L−1 图 1 不同TOC浓度的DOM作用下土壤砷形态变化 Figure 1 Arsenic speciation in soil solution added with DOM at different TOC levels |
4种不同DOM作用下土壤溶液中TOC与甲基态砷含量之间均呈显著线性相关（P < 0.01）。如图 2所示，甲基态砷含量随着土壤中TOC浓度的增加而增加，表明添加的DOM可显著促进砷的甲基化。比较拟合的相关方程斜率可知，4种DOM对土壤中砷甲基化的激发效率存在明显差异，激发作用的大小排序为猪粪DOM（0.016 1）>鸡粪DOM（0.014 7）>牛粪DOM（0.009 9）>水稻秸秆DOM（0.008 2）。加入猪粪DOM后对土壤中砷甲基化的激发率最高，即单位TOC浓度下土壤溶液中砷的甲基化效率为0.016 1 µg·L-1；而水稻秸秆DOM的激发率最低，单位TOC浓度下土壤溶液中砷的甲基化效率为0.008 2 µg·L-1。
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图 2 土壤溶液中总有机碳（TOC）与甲基砷的相关性 Figure 2 Correlation between TOC and the methyl-As in soil solution |
图 3为320 mg·L-1 TOC浓度下不同DOM对土壤arsM基因和16S rRNA丰度（每克土壤拷贝数）的影响。添加DOM处理后土壤arsM基因拷贝数均高于对照，PD-320、CDD-320、CMD-320和RD-320处理下arsM拷贝数与对照相比分别增加了1.65 × 109、0.62×109、0.58×109 copies·g-1和0.60×109 copies·g-1，其中PD-320处理土壤arsM拷贝数显著高于对照，为3.36×109 copies·g-1，约是对照的2倍；4种DOM作用下土壤砷甲基化功能基因arsM丰度由高到低的分布规律为猪粪DOM>牛粪DOM>水稻秸秆DOM >鸡粪DOM。添加320 mg · L-1 TOC浓度的猪粪源和鸡粪源DOM处理中土壤总细菌丰度均显著（P < 0.05）高于对照，其中CMD-320处理16S rRNA拷贝数最高，为1.942×1011 copies·g-1；不同DOM处理下土壤总细菌（16S rRNA）丰度由高到低的分布规律为鸡粪DOM＞猪粪DOM＞水稻秸秆DOM＞牛粪DOM。
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不同小写字母表示不同DOM处理之间同种基因拷贝数呈显著差异（P < 0.05） Different lowercase letters indicate the significant differences(P < 0.05)among the different DOM treatments 图 3 不同DOM在320 mg·L-1 TOC浓度下土壤arsM和16S rRNA基因丰度 Figure 3 The gene abundance of arsM and 16S rRNA in soils added with different DOM at TOC concentration of 320 mg·L-1 |
不同DOM添加后可显著改变土壤pH及EC值状况（图 4）。对照土壤pH为6.45，添加DOM各处理pH均高于对照。其中猪粪DOM各处理作用下土壤pH平均值在7.04~7.53之间，牛粪DOM在7.64~7.97之间，鸡粪DOM在7.18~7.73之间，水稻秸秆DOM在8.12~8.64之间。不同DOM作用下土壤pH由大到小的分布规律为水稻秸秆>牛粪>鸡粪>猪粪。相同DOM不同浓度处理间土壤pH变化总体呈现随TOC浓度增加而升高的趋势。对照处理下土壤EC值为128 µS·cm-1，除了PD-40处理外其他处理均高于对照。其中猪粪DOM作用下土壤EC值在11~669 µS· cm-1之间，牛粪DOM在173~903 µS·cm-1之间，鸡粪DOM在231~1277 µS ·cm-1之间，水稻秸秆DOM在249~1826 µS·cm-1之间，表明不同DOM处理下土壤EC值差异较大，总体呈现为水稻秸秆DOM>鸡粪DOM>牛粪DOM>猪粪DOM。此外，相同DOM中不同的浓度处理对土壤EC值的影响也不同，总体呈现土壤EC值随着TOC浓度增加而增加的趋势。
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不同小写字母表示相同DOM不同TOC浓度梯度之间pH或EC值呈显著差异（P < 0.05） Different lowercase letters indicate the significant differences(P < 0.05)of pH value or EC among the different TOC concentration gradient of the same DOM 图 4 不同DOM作用下土壤pH和EC值的变化 Figure 4 The change of soil pH value and EC in soils added with different DOM |
DOM作为土壤环境中最为活跃的有机成分之一，是影响重金属及砷吸附[29]、络合[30]、迁移[31]、转化以及生物地球化学循环过程[32]的重要因素。本文中，通过添加不同来源的DOM，土壤溶液中甲基态砷含量呈现出随着TOC浓度增大而增加的趋势，表明砷的甲基化进程因土壤溶液中TOC浓度的增加而加强。Wang等[32]将具有砷甲基化与挥发能力的棘孢木霉菌接种到砷污染土壤中，结果表明，对有机质含量较高的土壤中砷挥发量的提高量是较低有机质含量土壤的近10倍，与上述结果一致。DOM能够为土壤微生物的生命活动提供丰富的碳氮源与多种矿质营养，调控土壤中与砷氧化、还原与甲基化功能相关的微生物活性，进而影响土壤中砷的形态[33]。本研究中添加4种不同来源的DOM后土壤砷甲基化功能基因arsM的拷贝数均高于对照，表明这4种DOM加快了土壤中携带arsM基因相关微生物的生长繁殖，提高了砷的甲基化效率[18]。进一步将320 mg·L-1 TOC浓度下不同处理的arsM基因拷贝数经log2换算后（X）与其对应的总甲基态砷（MMAs+DMAs+TMAsO）含量（Y）进行相关性分析发现，两者呈显著正相关（Y=1.513 5X- 43.079，R2=0.886 4，P < 0.05）。该结果进一步表明DOM可显著增加土壤中甲基化功能基因arsM丰度，进而促进砷的甲基化。Jia等[27]的研究也发现，向水稻土壤中添加水稻秸秆后，土壤中arsM基因的丰度显著提高了139.4%，显著提高土壤中甲基态砷含量。此外，添加DOM后亦不同程度地增加了土壤溶液中无机态砷含量，通过增加砷甲基化底物浓度，进而促进砷的甲基化进程。加入土壤中的DOM可能会由于竞争吸附或者共沉淀作用嵌入到铁矿物结构中而屏蔽铁矿物中As（Ⅴ）的吸附位点[34]，或是与As（Ⅴ）形成As-DOM络合物降低其在土壤中的吸附[30]，促进As（Ⅴ）进入土壤溶液中进而被还原与甲基化。另外，本研究在土壤淹水状态下进行，厌氧条件有利于铁还原菌和砷还原菌的活动，促进铁矿物的还原溶解进一步使As（Ⅴ）释放到溶液中[35]，提高水淹土壤中无机砷含量，为土壤中砷甲基化提供较高的底物浓度。土壤溶液中无机砷含量提高会增加水稻籽粒中砷的累积风险，砷污染稻田中施用有机肥时应注意其对水稻食用安全的影响。
本研究中，添加不同来源的4种DOM后差异性地促进了土壤中砷甲基化的进程。比较来看，猪粪DOM对土壤砷甲基化的激发效应最高，其次是鸡粪、牛粪和水稻秸秆，可能是由不同有机物料自身的理化性质所导致。相关研究表明，氮碳比更高的有机质更容易被微生物所利用[36]，本文中猪粪的DON/DOC值明显高于水稻秸秆，不同DOM在被微生物利用难易程度上的差异可能影响了全细菌及砷甲基化微生物丰度，进而导致其在砷甲基化效率方面的差异。本研究中，猪粪DOM作用下土壤砷甲基化功能基因arsM丰度较水稻秸秆高，表明猪粪DOM对土壤中砷甲基化的促进作用更为显著。目前，已有研究发现，土壤甲基砷含量增加会导致水稻籽粒中积累过量的有机砷，进而可能诱导水稻产生直穗病[12]，因此通过合理施用有机肥有望减少土壤中砷的甲基化，从而在一定程度上减轻水稻直穗病发生。
土壤pH是影响土壤新陈代谢和微生物群落组成与结构的重要理化因子[37]。本研究中，与对照相比，添加4种不同来源的DOM均提高了土壤的pH，这可能是因为4种DOM原料为近中性或偏碱性，中和了部分原土壤的酸性。王小淇等[38]向土壤中添加大豆秸秆、花生秸秆、甘蔗渣、水稻秸秆4种有机物料并淹水均使土壤的pH显著提高，与本文的研究结果相一致。水稻土在淹水厌氧状态下的pH较高，Honma等[39]研究发现，水稻土pH与土壤溶液中总砷含量存在[As]=3.56×10-12 exp（4.72pH）的函数关系，而砷主要以As（Ⅲ）的形式存在于厌氧环境中[40]，所以较高的酸碱度可能有利于砷的还原，从而增加了砷甲基化反应的底物浓度。添加猪粪源DOM后，土壤pH增加的幅度最小，而猪粪源DOM对土壤中砷甲基化的激发效应最高，其原因可能是加入猪粪DOM后更加接近了与砷还原和甲基化相关的微生物所需土壤的最适酸碱度范围，增强了相应微生物群落的繁殖和生命活动[41]，促进了砷甲基化反应。电导率是土壤重要的物理化学指标，它可以间接表示土壤溶液中离子成分的总质量浓度（全盐量）。本文中添加DOM后，除PD- 40处理外，土壤EC的平均值均增大，总体呈现出随着TOC浓度的增加土壤EC值增大的趋势，但不同DOM处理下对土壤电导率的影响有明显差异。戴志刚等[42]向土壤中施加油菜秸秆后发现土壤表层水溶液电导率迅速升高，而且EC值随着秸秆用量的增加而增加，和本文的研究结果相似。土壤EC值的增加可能是由于猪粪、牛粪等有机物料释放出的营养物质增加了溶液中盐类含量，从而使土壤溶液的离子浓度增大。猪粪DOM处理下的土壤电导率要明显低于水稻秸秆DOM，而添加猪粪为来源的DOM的土壤中砷甲基化效率却高于水稻秸秆，原因可能是过多的Ca2+与Mg2+随水稻秸秆DOM进入土壤溶液中与As（Ⅴ）结合形成更多的沉淀[43]，减少了As（Ⅴ）向As（Ⅲ）的转化，而有机砷含量亦随之下降。
4 结论（1）添加动物源可溶性有机质对水稻土壤中甲基态砷浓度的增加作用要高于植物源，不同来源的可溶性有机质对土壤中砷甲基化的激发效应大小排序为猪粪DOM>鸡粪DOM>牛粪DOM>水稻秸秆DOM。
（2）可溶性有机质添加后，土壤砷甲基化功能基因arsM丰度提高，以及土壤pH及EC值变化介导的砷甲基化底物浓度升高是导致砷甲基化效率增加的重要原因。
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