2. 武夷学院福建省生态产业绿色技术重点实验室, 福建 武夷山 354300;
3. 福建技术师范学院近海流域环境测控治理福建省高校重点实验室, 福建 福清 350300
2. Fujian Provincial Key Laboratory of Eco-Industrial Green Technology, Wuyi University, Wuyishan 354300, China;
3. Fujian Provincial Key Lab of Coastal Basin Environment, Fujian Polytechnic Normal University, Fuqing 350300, China
随着我国养殖业集约化、规模化的快速发展,畜禽粪便产量逐年增加,已成为主要的农业污染源之一,直接影响农业生态环境和农业生产安全,正确处理和利用养殖废弃物已成为养殖业健康良性发展的关键因素[1]。作为农业废弃物资源化和能源化利用处理主要手段之一的厌氧发酵技术,具有处理废物和回收清洁沼气能源的双重特点[2-4]。但是厌氧发酵效率及运行稳定性受到多个因素的影响,其中微量元素的缺乏能够导致产甲烷菌生物活力下降,有机物降解不完全,进而影响整个厌氧反应器的运行效果和稳定性等[5-6]。
目前,已有大量文献报道了微量元素对厌氧发酵的积极作用。Zandvoort等[7]指出,微量元素不仅参与合成厌氧微生物,而且还参与合成和激活厌氧发酵产甲烷过程中的多种酶系统,对厌氧发酵的产甲烷阶段起着重要调控作用。张万钦等[8]归纳了微量元素在以“乙酸、H2及CO2和甲基化合物”为原料的3种甲烷生物合成途径中的作用,综述了Fe、Co、Ni等单一微量元素及多元素组合对厌氧发酵产甲烷过程中的积极影响。Zhang等[9]研究了Zn对猪粪厌氧发酵过程中沼气产量的影响,添加125 mg·L-1(低浓度)和1250 mg·L-1(高浓度) Zn的猪粪沼气产量分别比不添加Zn的对照组增加51.2%和56.0%。丁福贵等[10]研究了微量元素(Fe、Co、Ni、Mo、Zn、Mn、W)及生长因子对寒区猪粪沼气发酵的影响,筛选了以Fe、Co、Ni和酵母粉为化学促进剂的最佳优化组合。陈琳等[11]研究了猪粪中Cu含量对厌氧发酵过程中水解酶活性及产气进程的影响,结果表明,中、高浓度的重金属Cu对水解酶活性有显著的抑制效应。由此可见,不同学者围绕Fe、Co、Ni等关键微量元素在以乙酸为原料的甲烷生物合成主要途径中的作用机制进行了较为深入的研究,但是在构成整个厌氧发酵系统不可或缺的以H2及CO2为底物的甲烷生物合成路径中,微量元素Se、W对猪粪厌氧发酵过程中有机酸的互营氧化效应以及产甲烷作用机制的影响尚未引起普遍关注,国内外文献也鲜有报道。
本试验在前期研究[12-14]的基础上,采用批式厌氧发酵方式,以猪粪为发酵底物,在温度、pH等因素和运行正常的条件下,开展微量元素Se、W对厌氧发酵的影响研究,尤其从厌氧产酸阶段的总挥发性脂肪酸(TVFAs)和产甲烷阶段的甲烷产率变化视角,应用一级动力学和Gompertz模型拟合探析Se、W对厌氧发酵过程甲烷产率的影响效应,以提高畜禽粪污等有机废弃物厌氧发酵的生物产甲烷效率(BDA),有效提升厌氧发酵技术应用水平,为厌氧发酵过程中微量元素Se、W的功能效应提供基础的技术支持和科学的参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料新鲜猪粪和接种污泥分别取自福建莆田、南平、平潭、漳州等养殖区养猪场。鲜猪粪取回后置于4 ℃冰箱中保存。接种污泥取回后置于(35±1) ℃恒温箱中保存。鲜猪粪和接种污泥的特性分析在样品取回3 d之内完成,检测的基本理化性质见表 1,微量元素及需求量见表 2。
采用升流式厌氧污泥床(UASB)发酵装置进行批式试验。该装置材质为有机玻璃,有效容积5 L,内置水浴加热、温度和压力传感器,具有数据监测自动校正功能,示意图见图 1。料液由进料口加进后密封,通N2 10 min保持厌氧发酵环境,生物气从顶部的出气孔导出记录体积、收集并监测气体成分。
由表 2可知,与需求量相比,试验猪粪和接种污泥中含有较高本底值的关键微量元素Fe、Co、Ni、Mo、Cu、Zn,满足厌氧发酵需求[15-17],而影响产甲烷途径关键酶生物活性的微量元素Se、W缺乏。本试验在综合前人[8, 15-18]试验研究的基础上,借鉴Feng等[18]通过添加微量元素Se、W对食品工业废弃物厌氧发酵影响的研究结果,探析微量元素Se、W在该浓度范围内对猪粪厌氧发酵的影响,试验设计见表 3。以鲜猪粪为原料,每组总进料量5 kg,其中猪粪1 225 g,接种物1 000 g(接种量20%),加去离子水调节TS约8%,将物料混匀后备用。将不同浓度梯度的Se、W组合与备用料液搅拌均匀通过蠕动泵导入UASB发酵装置。空白组为只添加接种物和去离子水;CK组为对照组,不添加微量元素Se、W;L组为添加低浓度Se、W(0.4 mg·L-1和0.9 mg·L-1);M组为添加中浓度Se、W(0.8 mg·L-1和1.8 mg·L-1);H组为添加高浓度Se、W(1.2 mg·L-1和2.7 mg·L-1)。进料结束后向厌氧装置中通入N2,调节温度(35±1) ℃,每个处理组重复3次,每日定时测定产气量、气体成分和发酵液中的VFA浓度。
TS、VS分别采用烘干法和灼烧减重法测定[19],测定温度分别为105 ℃和600 ℃;C、H、O、N、S元素的质量分数采用元素分析仪测定[20];样品经HNO3-HClO4消煮后,采用等离子体发射光谱仪(ICP–AES)分析测定Fe、Cu、Zn、Ni、Mo、Se、W、Co微量元素[21]含量;采用气相色谱仪检测VFA质量浓度,用5%的硫酸溶液调节pH值< 3.0,10 000 r·min-1离心10 min,上清液经0.45 μm硝酸纤维素膜过滤后用丙酮稀释5倍,进样口、检测器温度均为200 ℃,载气流量8.00 mL·min-1,M12毛细管柱(30 m×0.53 mm×1 μm,Thermo) [22];沼气日产气量使用湿式流量计测定;沼气中甲烷含量采用气相色谱仪测定,色谱柱为Φ10 m×2 mm不锈钢色谱柱,甲烷检测条件:氢气分压为0.6 MPa,流速为20mL·min-1,进样口温度、柱温及检测器(TCD)温度分别为120、50 ℃和120 ℃,进样为0.5 mL[19]。
1.5 数据分析 1.5.1 发酵原料理论产甲烷潜力值发酵原料的理论产甲烷潜力值是指在适宜的厌氧发酵条件下,单位质量的某原料在一个发酵周期内所能产生的甲烷总量,可作为发酵工艺设计评估的重要科学依据[23]。目前,比较有效的发酵原料理论产甲烷潜力值的计算方法是在元素分析的基础上,用Buswell方程[24]计算理论气体组成:
(1) |
进而通过方程式(2)便可估算出发酵原料的理论产甲烷潜力值Xe(mL·g-1 TS):
(2) |
应用一级动力学模型(公式3)和Gompertz模型(公式4)拟合厌氧发酵过程并计算动力学反应常数[25],根据决定系数R2对模型的拟合度进行比较,文中涉及的甲烷产率均是相对于猪粪中VS含量。
(3) |
式中:X∞为整个发酵周期内猪粪甲烷产率,mL·g-1;Xt为t时刻猪粪甲烷产率,mL·g-1;k为反应速率常数,d-1;t为发酵时间,d。
Gompertz model方程[26]如下:
(4) |
式中:Rm为产甲烷速率,mL·g-1·d-1;e为常数,2.718 282;λ为迟滞时间,d。
1.5.3 发酵底物生物转化产甲烷效率以不同时间段甲烷累积产量与整个发酵周期甲烷总产量的比值表示发酵过程甲烷产率比(Methane production ratio,MPR) [27]。
底物厌氧发酵的生物转化产甲烷效率[28](Biodegradability,BDA)通过下式计算:
(5) |
式中:Xt为t时刻VS的甲烷产率,mL·g-1;Xe为VS的理论甲烷产率,mL·g-1。
1.5.4 数据处理采用SPSS 25.0进行数据处理及方差分析(显著性水平设置为0.05),采用Origin 8.0软件进行绘图及方程拟合。对照组和试验组的沼气产气量、甲烷体积分数及VFA的试验数据均扣除了空白组的影响且为3次重复的平均值。
2 结果与讨论 2.1 添加微量元素Se、W对沼气产气量的影响图 2为厌氧发酵过程中沼气日产气量曲线图。各组的产气启动期均较短,没有明显的迟滞期,这是由于试验接种污泥取自运行良好的沼气工程厌氧发酵反应器,且经过进一步驯化并富含生物活性显著的功能微生物。在厌氧发酵进程中,沼气日产气量总体呈现先上升后下降的趋势,各组均出现3个产气高峰,与已有研究报道保持一致[29]。其中,CK组的产气高峰分别出现在第4、10 d和21 d,添加微量元素Se、W的3个处理组(L、M和H)的产气高峰均分别出现在第3、7 d和12~15 d,与CK组相比,对应的产气高峰均提前;产气速率在厌氧发酵前期迅速增大,表 4显示各组间最高日产气量差异显著(P < 0.05),最佳M组在第7 d产生的最高日产气量(12 712 mL)比CK组在第10 d产生的最高日产气量(11 253 mL)增加13.0%。图 3反映了累积沼气产气量变化规律,各组间差异显著(P < 0.05)。M组的累积沼气产气量最大(177 001 mL),与最小的CK组(160 595 mL)相比提高了10.2%;L、H组的累积沼气产气量分别比CK组提高了4.9%和8.8%。试验结果表明:添加Se、W微量元素对厌氧发酵产沼过程均有不同程度的积极作用,表现为产气速率加快、产气量提高和产气峰值提前。已有研究[8, 18]报道显示Se、W是构成甲基呋喃脱氢酶和甲酸盐脱氢酶活性中心的关键元素,其生物有效性与脱氢酶的活性、产沼效应呈正相关。本试验进一步验证了适量Se、W的加入能够促进厌氧发酵产沼进程,提高沼气产气量。
挥发性脂肪酸(VFA)是衡量厌氧发酵过程微生物代谢状态的一个重要指标[22]。从图 4a、图 4b可以看出,乙酸占TVFAs的60%左右,各组变化规律基本一致,均是先上升后下降,最后趋于平稳。在发酵初始阶段水解速率大于产甲烷速率,TVFAs浓度迅速升高,CK组在第3 d达到产酸高峰,L、M和H组比CK组提前1 d达到产酸高峰,这可能是因为微量元素Se、W在水解酸化阶段生成的金属螯合物提高了产酸菌的活性,缩短了产酸相的反应时间,导致产酸峰值提前;随后,TVFAs和乙酸浓度迅速下降,至发酵结束,L、M和H组的TVFAs和乙酸累积量明显低于CK组,表 5显示各组间的TVFAs和乙酸累积量均差异显著(P < 0.05),其中,M组积累最少,比CK组分别降低57.6%和41.4%。这表明适量添加微量元素Se、W可能改变了发酵产酸菌的群落结构[30],直接影响发酵系统中VFA的浓度;产酸菌与产甲烷菌的互营共生关系,间接影响产甲烷菌菌群的多样性及菌群丰度[31],促进产甲烷活动的发生。因此,添加适量Se、W能起到缓解TVFAs积累的作用,促进产甲烷进程。
丙酸是最易积累且最难被降解的一种脂肪酸[22]。由图 4c可知,CK组的丙酸浓度并未随TVFAs浓度的降低而降低,而是在高浓度2 356~2 484 mg·L-1区间内维持14 d(第3~16 d)后逐渐下降,L、M和H组在第2 d到达峰值后迅速下降,发酵结束时丙酸累积量明显低于CK组,表 5显示各组间丙酸差异显著(P < 0.05),其中,M组积累最少,比CK组降低91.9%。Se、W是合成甲酸盐脱氢酶(Se参与)、甲基呋喃脱氢酶(W参与)和氢化酶(Se参与)必需的辅因子,催化丙酸转化生成CO2的系列化学反应,进而促进以CO2和H2为底物合成甲烷的产甲烷菌活性,促进程度为M> H>L>CK。其他相关学者的研究[14, 32-33]也证实了Se、W能够通过调节电子转移,促进丙酸降解,缓解丙酸积累。本试验也得到类似结果。
2.2.2 添加微量元素Se、W对甲烷产率的影响甲烷产率是单位质量的有机物经厌氧发酵产生甲烷的体积,主要用于表征有机物转化产甲烷的能力[34],反映厌氧发酵过程TVFAs转化为甲烷的效率。由图 5可知,甲烷体积分数均呈现先快速增长后趋于稳定的变化趋势。CK组的稳定期为14 d(第6~19d),从第20 d开始呈波动式下降;L组的稳定期为26 d(第4~29 d),从第30 d开始呈震荡式下降;M组和H组的稳定期为32 d(第4~35 d)。L、M组和H组稳定期明显优于CK组。由表 6可知,各组间平均甲烷体积分数及甲烷产率均差异显著(P < 0.05),L(66.2%)、M(68.3%)和H(67.2%)组的平均甲烷体积分数分别比CK组(62.2%)提高6.4%、9.8%和8%;M组的累积甲烷产率最高(398.3 mL·g-1),与CK组(328.1 mL· g-1)比提高21.4%。Gerhard等[35]向培养基中加入能刺激产甲烷菌生长的微量元素Se、W,CO2转化为甲烷和生物量的效率提高了25%。研究结果表明,适量添加Se、W能够促进产甲烷菌的生长和激活酶的活性,丰富产甲烷菌的多样性,提高合成甲烷的前体物质(包括乙酸及CO2、H2等)的利用率,对提高甲烷产率和保障厌氧发酵系统运行稳定性均有显著的促进作用。
试验采用一级动力学模型和Gompertz模型拟合各组厌氧发酵产甲烷过程,表 7列出了2种模型的拟合参数。
从拟合结果可以看出,Gompertz模型的决定系数R2均大于0.998,拟合精确度高,而且甲烷产率的拟合值与实测值接近,最大差值仅为1.0%,说明该模型可以较为准确地反映各组产甲烷过程。一级动力学模型的决定系数R2均小于0.978,且拟合值与实测值偏差较大,说明不适合用此模型拟合厌氧发酵过程。
Gompertz模型中,CK组的产甲烷速率最小(19.1 mL·g-1·d-1),M组的产甲烷速率最大(31.0 mL·g-1· d-1),与CK组比提高62.3%,H、L组次之(28.6、24.5 mL·g-1·d-1),与CK组比分别提高49.7%和28.3%。另外,M组的迟滞期最短(1.13 d),与CK组(1.93 d)比缩短41.5%。由此可见,向缺乏某一种或几种微量元素厌氧发酵系统中补充相应的微量元素利于产甲烷菌的生长繁殖,产酸阶段产生的乙酸、丙酸等挥发性脂肪酸作为营养物质和能源及时地被产甲烷菌代谢生成甲烷,同时也促进了水解反应的正向进行。因此,添加适量的微量元素Se、W能够促进产酸菌和产甲烷菌快速建立平衡状态,提高挥发性脂肪酸互营氧化效率,促进产甲烷进程,表现为产甲烷速率提高和迟滞期缩短。
2.3 微量元素Se、W对厌氧发酵生物产甲烷效率的影响根据发酵原料(表 1)元素分析结果可知猪粪的化学组成为C105H110O58N8S1,通过方程(2)和VS/TS计算猪粪的理论产甲烷潜力为566.7 mL · g-1,高于Møller等[36]通过猪粪中碳水化合物、蛋白质和脂肪等通用分子式计算获得的理论产甲烷潜力516 mL·g-1。表 8为各组在不同发酵时间的BDA和MPR值。BDA为衡量原料甲烷转化是否彻底的重要参数。由表可知,发酵进行到第17 d时,L、M组和H组的BDA比CK分别提高16.7%、37.6%和31.1%,其中M组在第13 d的BDA值(56.6%)与CK组第26 d的BDA(56.5%)接近;发酵结束时L、M组和H组的BDA分别达到64.9%、70.3%和68.2%,明显高于CK组的BDA (57.9%)。MPR可作为确定水力停留时间(HRT)的重要依据,本研究中以MPR等于90%表示厌氧发酵反应过程结束[37]。各试验组的厌氧发酵结束时间分别为18.92、16.23 d和17.01 d,其中M处理的HRT最短,比CK组(20.23 d)缩短了4 d。试验结果表明,添加微量元素Se、W可提升发酵底物的转化效率并大大缩短发酵水力停留时间,在实际应用中,BDA的提高和HRT的缩短意味着更高的发酵反应器有效容积利用率,利于成本降低。
(1) 添加外源微量元素Se、W在调控挥发性脂肪酸积累和提高产气量、甲烷体积分数、产甲烷速率及甲烷产率等方面均有不同程度的积极作用,其中中浓度M组(Se 0.8 mg·L-1、W 1.8 mg·L-1)对厌氧发酵效率的促进效应最为显著,累积产气量(177 001 mL)、平均甲烷体积分数(68.3%)和BDA(70.3%)比CK组分别提高了10.2%、6.1%和21.4%,厌氧发酵过程的促进效应及其变化规律符合Gompertz模型。
(2) 甲烷产率与TVFAs质量浓度呈负相关,随微量元素添加量的增加先增加后降低。微量元素Se、W能够促进产甲烷菌和酶的活性,加快挥发性脂肪酸转化为甲烷的反应速率,促进产甲烷进程,其中对丙酸降解效应尤为显著。M组效果最佳,呈现出最低TVFAs累积量(809 mg·L-1)、最大产甲烷速率(31.0 mL·g-1· d-1)和最短水力停留时间(16.23 d)和迟滞期(1.13 d),表明添加微量元素Se、W可提高猪粪厌氧发酵效率(T90)、缩短厌氧发酵迟滞期。对于易发生酸败现象的厌氧发酵系统,建议添加适量微量元素Se、W,通过调节系统内产酸菌和产甲烷菌互营氧化效率恢复运行。研究结果可为厌氧发酵技术实践应用提供技术参考和借鉴。
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