2020, Vol. 39
2. 江苏省农业科学院循环农业研究中心, 南京 210014;
3. 农业农村部种养结合重点实验室, 南京 210014;
4. 江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心, 南京 210014
2. Recycling Agriculture Research Center, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
3. Key Laboratory of Crop and Livestock Integrated Farming, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing 210014, China;
4. Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing 210014, China
目前，畜禽粪便的利用仍然是个难题，堆肥是实现畜禽粪便资源化、无害化、减量化利用的重要途径。然而传统堆肥也面临着许多问题，诸如发酵温度低、发酵周期长、无害化不彻底、臭味污染严重等。近年来，有研究表明[1-2]，在堆肥过程中接种菌剂，能有效提高堆肥腐熟度，缩短堆肥周期。然而也有研究表明[3-4]，外源接种菌剂并不能在堆肥过程中很好地发挥作用。究其原因，主要是接种的微生物与土著微生物相比，对堆肥环境的适应性差，导致对堆肥有机物分解利用不充分，从而达不到预期效果。因此，如何获得对堆肥环境适应性好，并能稳定发挥作用的微生物菌剂是研究重点。
根据环境中微生物最适生长温度的不同，可以将其分为嗜冷微生物(< 20 ℃)、嗜温微生物(25~40 ℃)、嗜热微生物(40~60 ℃)、极端嗜热微生物(60~85 ℃)和超嗜热微生物(>85 ℃) [5]。Oshima等[6]首次发现极端嗜热微生物在高温堆肥过程中具有非常重要的作用。廖汉鹏等[7]发现土芽孢杆菌属(Geobacillus)、栖热菌属(Thermus)和Calditerricola等属的极端嗜热菌对提高堆肥堆体温度、促进堆肥腐熟的作用显著。目前，国内外关于堆肥用极端嗜热菌剂的报道不多，尤其是针对堆肥环境制备具有良好适应性和功能性的极端嗜热菌剂产品更是少有研究。为此，本研究从不同高温堆肥样品中筛选既能在高温、高pH、高盐浓度的畜禽粪便堆肥环境中存活，且同时具备大分子有机物降解能力的极端嗜热功能菌，按一定要求复配成极端嗜热菌剂，在猪粪堆肥中添加该复配菌剂，并考察不同堆肥时期的种子发芽指数、腐殖质组分及含量的变化来确定复配菌剂促进堆肥腐熟、提高堆肥品质的效果，以期获得具有商业价值的极端嗜热菌剂。
1 材料与方法 1.1 材料分菌样品取自江苏、湖南等地不同有机肥厂的高温期畜禽粪便及秸秆堆肥。
新鲜猪粪取自江苏镇江乐甜仕猪场，水稻秸秆取自江苏省农科院水稻试验基地。
培养基：(1) LB培养基为胰蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH 7.2~7.4。固体培养基每1 L加琼脂10 g和结冷胶10 g。(2)富集培养基为NH4NO3 1.0 g·L-1，K2HPO4 1.5 g·L-1，KH2PO4 0.5 g·L-1，MgSO4 0.2 g·L-1，NaCl 1.0 g·L-1，胰蛋白胨0.2 g·L-1，酵母浸粉0.2 g·L-1，pH 7.0。
1.2 极端嗜热菌的分离及鉴定菌株分离:取不同堆肥高温期的样品10 g，放入90 mL富集培养基中，60 ℃振荡培养3 d后，以5%接种量转接至新鲜的富集培养基中，65 ℃振荡培养3 d，按相同方法再次转接，70 ℃振荡培养3 d。吸取第3次富集液梯度稀释后涂布于LB固体培养基上，将平板置于70 ℃恒温培养箱中培养2 d，挑取形态不同的单菌落，进一步划线纯化。最终分离出的单菌置于终浓度为10%的甘油中，-80 ℃保存。
菌株鉴定:各菌株提取总DNA进行PCR扩增，扩增引物为细菌16S rDNA序列通用引物27F/1492R，扩增体系及程序参考文献[8]，扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果在GenBank中进行blast比对，运用MEGA 5.0软件构建系统发育树。
1.3 菌株的生长特性研究温度对菌株生长的影响:以2%的接种量，将新鲜菌体接种到LB液体培养基中，置于不同的生长温度下(35、45、55、65、70、75、80 ℃)振荡培养，24 h后取样测定其在OD600处的吸光值。
pH对菌株生长的影响:以2%的接种量，将新鲜菌体接种到LB液体培养基中，培养基pH分别为3.5、5.5、6.5、7.5、9.5和11.5，65 ℃振荡培养，24 h后取样测定其在OD600处的吸光值。
盐浓度对菌株生长的影响:以2%的接种量，将新鲜菌体接种到NaCl含量分别为1、5、10、20、50 g·L-1和100 g·L-1的LB液体培养基中(pH 7.2~7.4)，65 ℃振荡培养，24 h后取样测定其在OD600处的吸光值。
1.4 不同温度条件下的酶活测定蛋白酶活力的测定:采用福林(Folin)法测定蛋白酶活力[9]，粗酶液与2%酪蛋白溶液分别在不同温度下(70、80、85、90、95 ℃)反应20 min，加入三氯乙酸终止反应，上清液加入碳酸钠和福林试剂进行显色反应，测定OD680处的吸光值，根据酪氨酸标准曲线计算生成的酪氨酸量。酶活单位定义:一定条件下每分钟水解酪蛋白溶液生成1 μg酪氨酸所需要的酶量为1个酶活力单位。
淀粉酶活力的测定:采用DNS法测定淀粉酶活力[10]，粗酶液与1%的淀粉溶液分别在不同温度下(70、80、85、90、95 ℃)反应10 min，加入DNS试剂进行显色反应，测定OD540处的吸光值，根据麦芽糖标准曲线计算生成的麦芽糖量。酶活单位定义:一定条件下每分钟水解淀粉释放1 μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位。
木聚糖酶活力的测定:采用DNS法测定木聚糖酶活力[11]，粗酶液与1%木聚糖溶液分别在不同温度下(70、80、85、90、95 ℃)反应10 min，加入DNS试剂进行显色反应，测定OD540处的吸光值，根据木糖标准曲线计算生成的木糖量。酶活单位定义:一定条件下每分钟水解木聚糖产生1 μmol还原糖(以木糖计)所需的酶量为1个酶活性单位。
脂肪酶活力的测定:采用滴定法测定脂肪酶活力[12]，粗酶液与橄榄油乳化液分别在不同温度下(70、80、85、90、95 ℃)反应20 min，用NaOH滴定计算生成的脂肪酸量。酶活单位定义:一定条件下每分钟水解底物释放1 μmol脂肪酸所需要的酶量为1个酶活力单位。
1.5 极端嗜热菌剂制备根据菌株生长特性和酶活测定结果，挑选出6株菌(NN-86、NY-44、LB-3、B、D、E)用于构建具有较好环境耐受性和有机物降解能力的复合菌剂。进一步通过拮抗试验确认各复配菌株间不存在拮抗现象。将各菌株分别培养制备成菌悬液后，取各菌株种子液等比例混合后接种于新鲜培养液中继续培养，至培养液中有效活菌数≥1×108 cfu·mL-1时即获得极端嗜热复合菌剂。
1.6 极端嗜热菌剂促进堆肥腐熟效果研究堆肥所用原料的基本性质见表 1。
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表 1 堆肥原料的理化性质 Table 1 Physiochemical properties of raw materials for composting |
采用实验室模拟堆肥方法，将猪粪(主料)和秸秆(辅料)按比例混合，调节初始C/N为25，初始含水率为65%。试验设常规堆肥(未接种)和接种极端嗜热菌剂堆肥(接种，2%接种量)，为排除培养基对堆肥结果的影响，常规堆肥组加入2%的液体培养基，每个处理组重复3次。将盛有混合物料的小型堆肥装置(2 L圆形带盖塑料桶)放入烘箱中，模拟自然高温堆肥温度变化控制堆体温度，堆肥过程中的温度控制条件见图 1。每隔2 d翻堆一次，分别在第0、6、12、18、24、30 d和42 d取样，测定堆肥各时期的GI及腐殖质、胡敏酸和富里酸含量。GI测定参照Ke等[13]的方法进行，具体计算公式见式(1)。
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(1) |
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图 1 模拟堆肥温度控制 Figure 1 Temperature control in the mimic experiment |
堆肥腐殖质及其组分的测定采用焦磷酸钠提取-重铬酸钾氧化容量法。
2 结果与讨论 2.1 极端嗜热菌株的分离鉴定堆肥高温期样品经过富集培养和分离纯化，共得到9株能在70 ℃生长的极端嗜热菌株，各菌株的菌落形态见图 2，详细形态描述见表 2。16S rDNA序列比对结果表明(表 2):菌株NN-36、NN-86、LB-3、B与土芽孢杆菌属相似度最高；菌株NY-44与副土芽孢杆菌属相似度最高；菌株80-31、80-39、E与栖热菌属相似度最高；菌株D与红嗜热菌属相似度最高。同时，从构建的系统发育树可知(图 3):菌株NN-36、NN- 86、LB-3、B与土芽孢杆菌属聚为一类，因此初步鉴定其为Geobacillus sp.；菌株NY-44与副土芽孢杆菌属聚为一类，因此初步鉴定其为Parageobacillus sp.；菌株80-31、80-39、E与栖热菌属聚为一类，因此初步鉴定其为Thermus sp.；菌株D与红嗜热菌属聚为一类，因此初步鉴定其为Rhodothermus sp.。Geobacillus sp.和Thermus sp.是堆肥高温期常见优势菌株[14-15]，Parageobacillus sp.和Rhodothermus sp.在堆肥中少有报道。
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图 2 9株菌株在LB培养基上的菌落形态 Figure 2 Colony morphology of nine strains on the LB medium |
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表 2 菌株16S rDNA序列相似性分析及菌落形态描述 Table 2 Similarity analysis of the 16S rDNA sequences of the isolated strains and descriptions of colony morphology |
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图 3 9株菌株基于16S rDNA序列的系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree of nine strains based on 16S r DNA sequences |
本研究从高温堆肥环境分离获得的极端嗜热菌中，土芽孢杆菌和栖热菌占比高达80%左右，与前人研究结果一致。
2.2 菌株生长特性及酶活测定结果 2.2.1 菌株的生长特性温度是影响菌株生长、繁殖、新陈代谢的重要指标之一。由图 4a可以看出，菌株80-31、80-39、D、E的最适生长温度为70 ℃，菌株NN-36、NN-86、NY- 44、LB-3和B的最适生长温度为65 ℃。近年来已有研究表明提高堆体温度可加速腐殖化进程，缩短发酵周期[16-17]。在传统过程堆肥中温度超过70 ℃将抑制几乎所有微生物(包括嗜热微生物)的活性，导致后续堆肥过程难以稳定运行，因此分离筛选最适生长温度为65 ℃和70 ℃的高温菌株资源并应用到堆肥中具有重要意义。
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图 4 温度、NaCl浓度、pH值对各菌株生长的影响 Figure 4 Effects of temperature, NaCl concentration, and pH value on the growth of each strain |
由图 4b可知，各个菌株对盐浓度的耐受能力不同。多数菌株的最适生长盐浓度为10 g·L-1，而菌株NY-44的最适生长盐浓度是20 g·L-1，比其他菌株能耐受更高盐浓度，属于嗜盐菌[18]。
由图 4c可知，所分离菌株都能在pH 7.5以上生长，都属于耐碱菌。其中菌株NY-44、D和E的最适生长pH为9.5，属于嗜碱菌[19]。曹云等[20]在研究畜禽粪便堆肥前期理化性质发现，堆肥前期由于微生物分解蛋白质类有机物产生氨氮，促使pH值上升，pH可达到8~9。
综上，所分离菌株具有耐高温、耐碱和耐盐等特性，而堆肥过程是有着高温、高pH和高盐环境的，菌株的这些特性有助于它们在堆肥过程中更好地适应堆肥环境从而存活，而这也是菌剂在堆肥中发挥功能的先决条件。
2.2.2 菌株不同温度条件下的酶活性质如图 5a所示，所分离菌株都能检测出高温蛋白酶活性，菌株NN-36和NY-44所产蛋白酶在80 ℃酶活最大，分别为25.6 U·mL-1和21.8 U·mL-1；菌株NN- 86、LB-3和D所产蛋白酶均在90 ℃酶活最大，分别为22.9、23.3 U·mL-1和29.1 U·mL-1。所有菌株均能检测出高温淀粉酶和木聚糖酶活性，但活性都较弱，其中菌株B所产淀粉酶在70 ℃酶活最大，为0.20 U·mL-1；菌株E所产木聚糖酶在70 ℃酶活最大，为0.25 U·mL-1 (图 5b、图 5c)。如图 5d所示，只有菌株NY-44、NN-36和B检测到了脂肪酶活，且活性均不高，其中菌株NY-44所产脂肪酶在70 ℃酶活最大，为1.80 U·mL-1。
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图 5 各菌株在不同温度下的蛋白酶活、淀粉酶活、木聚糖酶活和脂肪酶活 Figure 5 Protease activity, amylase activity, xylanase activity, and lipase activity of each strain at different temperatures |
有研究表明，土芽孢杆菌可产生多种高温酶，比如高温蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶等[21]。本研究结果也证明土芽孢杆菌同时具有高温蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶活性，且部分土芽孢杆菌还同时具备脂肪酶活性，说明土芽孢杆菌有较强的饲料酶系[22-23]，有利于堆肥过程中大分子有机物的降解，从而促进堆肥升温和腐熟。高温菌所产的降解酶具有较好的热稳定性，能将发酵温度维持在较高的温度下，可以更加有效地杀死病原微生物，达到卫生化的要求。此外，高温酶不仅耐热，而且对不良化学环境也具有高度的耐受性，从而能提高有机废弃物处理效率，缩短堆肥生产周期。
2.3 接种极端嗜热菌剂对猪粪堆肥腐熟进程的影响 2.3.1 极端嗜热菌剂的复配经过比较各菌株生长特性和不同温度下的酶活结果:NY-44既是嗜碱菌又是嗜盐菌；D和E是嗜碱菌；NN-86、LB-3在90 ℃时有最大蛋白酶活；菌株B能产脂肪酶和淀粉酶。最终选择NN-86、NY-44、LB-3、B、D和E这6株菌用于复配耐碱、耐盐和具备良好蛋白质、淀粉、脂肪和半纤维素高温降解能力的极端嗜热菌剂。
2.3.2 极端嗜热菌剂对堆肥GI的影响GI是判断堆肥腐熟程度极为重要的指标之一。不同堆肥处理的GI变化如图 6所示。在堆肥过程中，接种和未接种处理的GI都呈先下降再上升的趋势，且两组处理均在12 d时GI降到最低。堆肥初期发芽指数降低可能是因为有机物降解产生大量酚类化合物、挥发性有机酸和氨等植物毒素[24-25]。12 d后接种和未接种处理的GI均呈逐渐上升趋势，且接种处理的GI增加更为迅速，在30 d即达到了56.8%，已达到基本腐熟标准[26]，而此时未接种堆肥的GI仅为41.8%。堆肥结束时，接种处理的GI为72.1%，比未接种处理高14.8%，堆肥结束时，未接种处理与接种处理的GI均超过50%，表明此时堆体已无明显植物毒性[27]。以上结果说明接种极端嗜热菌剂有利于加快猪粪堆肥的腐熟进程，从而缩短堆肥周期。
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图 6 堆肥过程中种子发芽指数（GI）变化 Figure 6 Changes of GI during composting |
在堆肥过程中，有机质在微生物的作用下，进行降解的同时还进行着腐殖化的过程。从图 7a可以看出，接种和未接种堆肥总腐殖质含量均呈现先下降后上升再下降的变化趋势。堆肥12 d后接种处理的腐殖质含量一直高于未接种组，直至堆肥结束，接种处理腐殖质含量较未接种高出4.2%。堆肥结束时，接种处理和未接种处理腐殖质含量较初始值分别降低了12.8%和16.3%。现有研究关于堆肥过程腐殖质总量变化趋势没有统一结论，与堆肥原料以及堆肥工艺的选择有关。鲍艳宇等[28]研究以奶牛粪为原料的堆肥，发现腐殖质碳呈逐渐增加的趋势。本研究结果与曹云等[29]的研究结果相一致，以猪粪为原料堆肥时，堆肥腐熟后腐殖质总含量与初始相比均降低。
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图 7 堆肥过程中总腐殖质、胡敏酸、富里酸、HA/FA变化 Figure 7 Dynamics of humic substance, humic acid, fulvic acid, and HA/FA during composting |
胡敏酸是一种分子量大、稳定性高的物质。图 7b显示，在整个堆肥过程中胡敏酸含量总体呈现先略降低后逐渐上升的趋势。堆肥12 d后接种处理的胡敏酸含量一直高于未接种组，直至堆肥结束，接种处理胡敏酸含量较未接种高出7.8%。42 d时，接种处理和未接种处理胡敏酸含量分别为52.87 g·kg-1和49.03 g·kg-1，较初始值分别提高了58.0%和46.5%。富里酸是腐植酸中分子量较小、活性较大、氧化程度较高的组分[30]。由图 7c可知，堆肥过程中富里酸含量呈下降趋势，这主要是由于富里酸类物质分子量相对较小、分子结构简单，易被微生物降解。堆肥结束时，未接种处理和接种处理富里酸含量分别是34.97 g· kg-1和34.63 g·kg-1，差异不显著。
胡敏酸和富里酸含量的比值(HA/FA)是评价堆肥腐殖化程度的一个重要指标，能较好地反映出堆肥过程中腐殖质的聚合程度[31-32]。如图 7 d所示，在整个堆肥过程中，各处理的HA/FA总体呈现增加的趋势。18 d后，接种处理HA/FA一直高于不接种处理组，42 d时，接种处理的HA/FA较未接种处理高出7.1%。有研究表明[33-34]，堆肥过程中HA/FA值在1.4以上，就可以判断堆肥腐熟。在42 d时，两组处理都超过1.4，说明堆肥结束时，两组堆肥都已腐熟。但接种处理的HA/FA在第36 d时已达到1.4，达到腐熟时间缩短了6 d。
结果表明，接种极端嗜热菌剂对猪粪堆肥腐殖质组成及含量的变化有着显著影响。接种菌剂促进了腐殖化进程，有利于胡敏酸的形成，提高了HA/FA，表明接种极端嗜热菌剂可以提高猪粪堆肥的腐殖化程度，提高堆肥产品质量。
3 结论(1) 本研究从高温堆肥环境中筛选出9株极端嗜热菌，经16S rDNA序列同源性比对，鉴定为:Geobacillus sp. 4株，Thermus sp. 3株，Parageobacillus sp. 1株，Rhodothermus sp. 1株。Geobacillus sp.和Thermus sp.是堆肥高温期常见优势菌株，Parageobacillus sp.和Rhodothermus sp.在堆肥中的应用少有报道，本研究为堆肥高温菌剂制备扩充了菌种资源。
(2) 所分离菌株最适生长温度均在65~70 ℃；NY-44、D和E最适生长pH为9.5，属于嗜碱菌，其中NY-44最适生长盐浓度是20 g·L-1，同时属于嗜盐菌；所分离土芽孢杆菌同时具有高温蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶活性，且部分土芽孢杆菌还兼具高温脂肪酶活性，有利于堆肥过程中大分子有机物的降解。
(3) 堆肥结束时，接种极端嗜热菌剂的处理与未接种相比，GI提高了14.8%，总腐殖质含量和胡敏酸含量分别增加了4.2%和7.8%，HA/FA高出了7.1%。可见，接种本研究的极端嗜热菌剂有利于加快堆肥腐熟，增强堆肥的腐殖化程度和堆肥产品质量。对复配菌株比例的优化可能会进一步提升该极端嗜热菌剂促进堆肥腐熟效果，有待后续研究确认。
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