2020, Vol. 39
2. 江苏大学环境生态研究所, 江苏 镇江 212013
2. Institute of Environment and Ecology, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Chinas
工农业生产和人类日常活动产生的大量富含氮、磷的废水进入环境，造成水体富营养化，导致藻类大量繁殖，形成水华。我国近年来多次发生严重的水华，对我国的工农业生产和人民健康构成了极大的危害，造成了巨大的经济损失[1]。研究发现，受到藻类污染的天然水体中对人类健康构成严重危害的主要是微囊藻毒素（Microcystin）[2]，其是一类具有多种异构体的环状七肽化合物，具有很强的肝毒性及潜在的“三致”作用[3-6]，其中微囊藻毒素-LR（MC-LR）因分布最广、毒性最强而备受关注[7-8]。因此，国内外对饮用水及水产品中的MC-LR制定了残留限量标准，我国规定MC-LR的限量标准为1.0 µg·L-1[9]。MC-LR理化性质稳定，常规处理方法不能将其有效去除[10-11]。MC-LR不仅能够直接污染水体，对水生生物造成危害，还能通过灌溉、施肥等方式进入农田土壤，被农作物吸收富集，造成农产品安全问题，对人类健康产生危害[12-14]。因此亟需建立可靠、便捷的方法对农田水样中的MC-LR进行检测。
目前对MC-LR的检测技术是仪器分析方法和免疫分析方法。仪器分析方法能够精确定性定量，有赖于昂贵、精密的大型仪器，如高效液相色谱（HPLC）、液质联用（LC-MS/MS）等[15-18]，且对样品前处理、检测人员及环境要求较高，检测效率较低，不适用于样本的现场快速筛选检测，无法满足环境中MC-LR的实际监测需求。基于特异性生物识别材料（抗体、核酸适配体等）的免疫检测分析方法如酶联免疫吸附分析方法（ELISA）、免疫传感器分析方法被广泛应用于食品中MC-LR现场快速筛选检测[19-22]，但是特异性生物识别材料直接决定了分析技术的检测性能，而特异性生物识别材料制备成本高昂，周期较长，成为制约该项技术的主要瓶颈。表面增强拉曼散射技术作为一种新型分析技术，基本无需前处理，样品需求量少，适用范围宽，激发波长范围宽，SERS信号峰窄，特异性强，已被广泛应用于食品及环境分析检测等领域[23-24]。本研究拟以表面增强拉曼散射技术为检测手段，建立能够对农田水样中MC-LR进行检测的现场、快速、灵敏的检测方法，为农田水样中MC-LR的现场监测提供技术手段。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）：分析纯，购自天津市迈斯科化工有限公司，配制成1.0%的氯金酸溶液，4 ℃冰箱内放置备用；柠檬酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）：分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；硝酸银（AgNO3）：分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，配制成1.0×10-3 mol·L-1的溶液，4 ℃冰箱内放置备用；盐酸羟胺（NH2OH·HCl）：分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，配制成0.04 mol·L-1溶液，4 ℃冰箱内放置备用；对巯基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，4-MBA）：分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MC-LR：分析纯，购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备AR224CN电子天平，美国OHAUS公司；QT-1漩涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司；C-MAG HS4磁力搅拌器，德国IKA公司；BIOMATE 3S紫外-可见分光光度计，美国Thermo公司；Tecnai12透射电子显微镜，荷兰Philips公司；i-Raman Plus高灵敏度便携式拉曼光谱仪，必达泰克光电科技（上海）有限公司。
1.3 试验方法 1.3.1 拉曼光谱仪的参数设置激发波长780 nm，拉曼光谱波长范围：800~2 000 cm-1，功率300 MW，扫描时间20 s。
1.3.2 金种的制备将50 mL（1 mmol·L-1）氯金酸溶液置于250 mL的圆底烧瓶中，加热并剧烈搅拌，溶液沸腾后加入5 mL（38.8 mmol·L-1）柠檬酸三钠溶液，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续搅拌15 min，制备金种。
1.3.3 刺状金纳米颗粒的制备采用金种媒介增长法合成。在100 mL的烧杯中加入40 mL超纯水，依次加入1.6 mL 1%氯金酸溶液、2mL 4×10-2 mol·L-1 NH2OH·HCl溶液，室温下剧烈搅拌，分别加入0、20、100、200、500 µL和1 000 µL的1× 10-3 mol·L-1 AgNO3溶液，最后加入0.2 mL金种，搅拌至反应液呈棕色[25]。
1.3.4 刺状金纳米颗粒表征使用紫外分光光度计和Tecnai12透射电子显微镜对制备的金纳米颗粒进行表征。刺状金纳米颗粒的SERS增强效果的鉴定：以4-MBA作为探针分子，取1.0 µL SGNPs与1 µmol·L-1 4-MBA溶液依次滴在硅片上，晾干后使用便携拉曼光谱仪进行检测，检测条件为：激发波长为785 nm，扫描时间20 s。
1.3.5 SERS检测方法的建立标准曲线的建立：取1.0 mg MC-LR标准品，溶解于1.0 mL甲醇中，即为1.0 mg·mL-1标准储备液，避光4℃保存。使用超纯水制备0.001、0.01、0.1、1、10 µg·mL-1和100 µg·mL-1，以三角状金纳米颗粒为基底，使用锡箔纸代替硅片，采用1.3.4中的方法建立标准曲线。
1.3.6 农田水样中MC-LR的检测水样的采集：以镇江市内运粮河及古运河灌溉水渠作为取样点。采集深度为0.5 m，放入棕色玻璃瓶-20 ℃保存，一周内检测。
水样的前处理：将水样用0.22 μm的滤膜过滤待用。
天然水体样品添加回收试验：阴性天然水样（取自镇江市内金山湖，参照使用LC - MS/MS方法测定[26）]添加MC-LR标准储备液，使其终浓度分别为0.1、1、10 µg·mL-1和40 µg·mL-1。使用1.3.5的方法进行测定，每个水样平行测定3次，计算添加回收率。
农田水样的检测：分别在古运河和运粮河中游及下游取水口附近随机采集2次水样，使用1.3.5的方法对样品进行测定，每个样品平行测定3次。
2 结果与分析 2.1 不同形貌的金纳米颗粒对SERS活性的影响 2.1.1 不同形貌的金纳米颗粒的紫外表征和透射电镜图所制金种粒径约20 nm，最大吸收波长为518 nm，加入氯金酸、盐酸羟胺和一定体积的硝酸银溶液后，其最大紫外吸收峰红移，生成了新的纳米粒子，透射电镜显示为刺状的纳米粒子。图 1分别为本研究制备的金纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱和透射电镜图，球状金纳米颗粒、三角状金纳米颗粒、短刺状金纳米颗粒、长刺状金纳米颗粒、星形金纳米颗粒及海胆状金纳米颗粒的最大吸收波长分别为600、612、724、762、798 nm和794 nm。
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a.球状金纳米颗粒；b.三角状金纳米颗粒；c.短刺状金纳米颗粒；d.长刺状金纳米颗粒；e.星形金纳米颗粒；f.海胆状金纳米颗粒。下同 a. Au SNs; b. Au TNs; c. Au STs; d. Au LTs; e. Au STNs; f. Au NSUs. The same below 图 1 紫外-可见吸收光谱和透射电镜图 Figure 1 UV-vis spectrum and TEM |
以4-MBA作为拉曼探针分子，研究金纳米颗粒的SERS活性。如图 2所示，表征结果显示除海胆状金纳米颗粒的SERS活性较弱，其余刺状金纳米颗粒都表现出比球状金纳米颗粒更强的SERS活性，其中又以三角状金纳米颗粒的SERS活性最强，短刺状金纳米颗粒、长刺状金纳米颗粒、星形金纳米颗粒的SERS活性逐渐减弱。刺状金纳米颗粒因其表面的尖刺和粗糙的表面具有比球状金纳米颗粒更强的拉曼散射效应，按照拉曼散射机理，长刺状金纳米颗粒应产生最强的SERS活性，但这又与三角状金纳米颗粒的SERS活性最强的试验结果相矛盾，可能是由于三角状金纳米颗粒与短、长刺状金纳米颗粒相比相互之间更能紧密地贴合在一起，能产生很强的拉曼散射缝隙增强效应。星形金纳米颗粒和海胆状金纳米颗粒因表面刺状物长度和数量减少，尖端增强减弱，同时也没有很强的缝隙增强，从而SERS活性减弱。因此本研究选择三角状金纳米颗粒作为拉曼增强基底建立检测方法。
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图 2 基于不同形貌的刺状金纳米颗粒的4-MBA SERS谱 Figure 2 4-MBA SERS spectra of SGNPs with different morphologies |
MC-LR的拉曼光谱峰的振动归属如表 1所示。图 3为使用100 µg·mL-1 MC-LR溶液以SERS活性最强的三角状金纳米颗粒为增强基底得到SERS谱图。图中5条光谱，均出现了位于830、885、1 007、1031、1 309、1 380、1 457 cm-1和1 640 cm-1处的SERS峰，它们均属于MC-LR的拉曼信号。在这些峰中，1007 cm-1和1 309 cm-1处的峰最明显，且其峰强与浓度有明显的线性关系（图 4），因此选择此特征峰作为本检测方法的定量峰。
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表 1 4-MBA SERS光谱的谱峰归属 Table 1 SERS shifts of 4-MBA |
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图 3 100 µg·mL-1 MC-LR溶液以三角状金纳米颗粒为增强基底得到的SERS谱图 Figure 3 100 µg·mL-1 MC-LR SERS spectra of Au TNs |
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图 4 MC-LR溶液的浓度与其分别在1 007 cm-1和1 309 cm-1处的SERS峰强度之间的线性关系 Figure 4 The linear correlation diagram of SERS peak intensity at 1 007 cm-1 and 1 309 cm-1 with the concentrations ranging from 1 µg·L-1 to 100 µg·mL-1 |
以三角状金纳米颗粒为增强基底分别测定了0.001、0.01、0.1、1 µg·mL-1和10 µg·mL-1的MC-LR标准品溶液的SERS谱图（图 5），1 007 cm-1和1 309 cm-1处MC-LR浓度与峰强的线性方程分别为y= 16.798x+47.959和y=11.510x+114.825。方法检测限为1.0 µg·L-1。
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图 5 0.001、0.01、0.1、1 µg·mL-1和10 µg·mL-1的MC-LR溶液以三角状金纳米颗粒为增强基底得到的SERS谱图 Figure 5 0.001、0.01、0.1、1 µg·mL-1 and 10 µg·mL-1 MC-LR SERS spectra of Au TNs |
测试结果如图 6和表 2所示，本研究建立的检测方法的回收率为80%~102%，符合检测要求。MC-LR在农田水样中的最低检测限为1.0 µg·L-1。结果显示该方法能够应用于农田水样中MC-LR的检测。
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图 6 农田水样中添加0.1、1、10 µg·mL-1和40 µg·mL-1的MCLR溶液，以三角状金纳米颗粒为增强基底得到的SERS谱图 Figure 6 0.1、1、10 µg·mL-1 and 40 µg·mL-1 MC-LR SERS spectra of Au TNs added to irrigation water samples |
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表 2 农田水样测量MC-LR的结果和回收率 Table 2 Determination and recoveries of MC-LR in irrigation water samples |
应用本研究建立的方法以及LC-MS/MS方法对镇江市内运粮河及古运河水样中的MC-LR进行检测。结果显示（表 3），本研究建立的方法与LC-MS/ MS检测结果基本一致，具有较好的相关性，相关系数为0.84。5个样本中，有两个样本中检出MC-LR，检出率为40%，含量最高为1.81 µg·L-1。
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表 3 环境样品分析 Table 3 Analysis of environmental samples |
高效液相色谱法等大型仪器分析法需要对样品进行前处理，检测方式依赖大型仪器及专业分析人员，检测成本较高，无法满足现场检测需求。基于特异性生物识别材料（抗体、核酸适配体等）的免疫检测分析方法被广泛应用于食品中MC-LR现场快速筛选检测，但是特异性生物识别材料制备成本高昂，周期较长，成为制约该项技术的主要瓶颈。本研究建立的基于三角状金纳米颗粒的SERS检测技术对农田水样中的MC-LR进行检测，采用现场无标记检测技术，无需使用价格昂贵且难以制备的抗体或核酸适配体，仅依据MC-LR可以产生强拉曼指纹峰的特性进行检测。表面增强拉曼光谱激发波长范围宽，SERS信号峰窄，特异性强，其对于样品制备没有特殊要求，基本无需前处理，样品需求量少，适合微量和痕量样品检测，同时，适用范围宽，对环境要求低，极易测量含水样品。本研究使用的便携拉曼仪器不同于大型仪器，成本低，轻巧便携，操作简便，对实验人员技术要求低，现场适用性优异。
文献中已报道过一些基于表面增强拉曼相关技术的毒素或农药残留的检测，但目前检测领域的SERS相关技术还属于新兴的研究领域，关于微囊藻毒素的相关检测研究仅有一篇[27]，检测限仅为1.0 mg·L-1，远高于本研究1.0 µg·L-1的检测限。此外，目前研究中使用的SERS增强基底多为金、银纳米粒子，银的拉曼增强效应强于金，但易于氧化[28-29]。球状金纳米粒子稳定易制备但增强效果差，金纳米星、金纳米棒等由于尖端效应，其拉曼增强效应远强于金，但这些结构不易制备，在实际环境中不稳定，易熟化[30]。本研究制备的SGNPs稳定易制备，缝隙增强效应较尖端效应更显著，具有很强的SERS活性。
本研究首次建立基于三角状金纳米颗粒的SERS检测技术并对农田水样中MC-LR进行检测，操作简便，现场适用性优异，检测限（LOD）为1.0 µg·L-1，回收率为80%~102%。该方法可适用于对水体中MCLR的现场残留检测，国家标准中MC-LR的残留限量为1.0 µg·L-1。镇江市内运粮河和古运河灌溉水样的检测结果显示，MC-LR的检出率为40%，含量最高达1.81 µg·L-1，检测结果与LC-MS/MS比对，相关系数为0.84，可以进行实际样本检测。
4 结论（1）以4-MBA作为标识物比较不同形貌的SGNPs的SERS增强效果，其中三角状的金纳米颗粒SERS增强效果最为明显，作为本研究的SERS增强基底。
（2）利用MC-LR会产生拉曼特征峰的特性，使用基于表面增强拉曼光谱的检测方法检测农田水样中的MC-LR，用三角状的金纳米颗粒作为基底，检测限（LOD）为1.0 µg·L-1，回收率为80%~102%，满足残留检测要求。
（3）基于GSNPs的表面增强拉曼光谱技术于农田水样中MC-LR的检测方法简便可靠，为现场快速检测MC-LR提供了新的技术手段。
| [1] |
丰茂武, 吴云海. 国内外湖泊富营养化的防治对策与展望[J]. 广州环境科学, 2006, 4: 8-11. FENG Mao-wu, WU Yun-hai. Measures for the control of lake eutrophication at home and abroad[J]. Guangzhou Environmental Science, 2006, 4: 8-11. |
| [2] |
De Figueiredo D R, Azeiteiro U M. Microcystin-producing blooms:A serious global public health issue[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2004, 59: 151-163. |
| [3] |
贺燕, 黄先智, 丁晓雯. 微囊藻毒素毒性及其作用机理研究进展[J]. 食品科学, 2020, 41(5): 290-298. HE Yan, HUANG Xian-zhi, DING Xiao-wen. Advances in research on toxicity and mechanism of action of microcystins[J]. Food Science, 2020, 41(5): 290-298. |
| [4] |
孔繁翔, 曹焕生, 谭啸. 水华蓝藻复苏的研究进展与水华预测[J]. 环境监控与预警, 2010, 2(1): 1-4. KONG Fan-xiang, CAO Huan-sheng, TAN Xiao. Development of research on recruitment of bloom-forming Cyanobacteria and blooms forecast[J]. Environmental Monitoring and Forewarning, 2010, 2(1): 1-4. |
| [5] |
叶冠琛, 王一如, 徐立红. 微囊藻毒素对多种靶器官的毒性作用研究进展[J]. 中国细胞生物学学报, 2019, 41(6): 1193-1200. YE Guan-chen, WANG Yi-ru, XU Li-hong. Research progress on the toxicity of microcystins to mulitiple target organs[J]. Chinese Journal of Cell Biology, 2019, 41(6): 1193-1200. |
| [6] |
李雪, 周伟杰, 钮为民, 等. 微囊藻毒素(MC-LR)在太湖螺蛳体内积累规律的研究[J]. 食品科学, 2012, 33(7): 280-283. LI Xue, ZHOU Wei-jie, NIU Wei-min, et al. Accumulation rule of microcystins(MC-LR) in herbivorous aquatic snail[J]. Food Science, 2012, 33(7): 280-283. |
| [7] |
Calado S L, Vicentini M, Santos S, et al. Sublethal effects of microcystin-LR in the exposure and depuration time in a neotropical fish:Multibiomarker approach[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 183: 1-10. |
| [8] |
Rivasswau C. Determination of some physicochemical parameters of microcystins(Cyanobacterial toxins)and trace level analysis in environmental samples using liquid chromatography[J]. J Chromatogr A, 1998, 799(1/2): 155. |
| [9] |
中华人民共和国卫生部.生活饮用水卫生标准GB 5749-2006[S].北京: 中国标准出版社, 2006. Ministry of Health of the People's Republic of China. Standards for drinking water quality GB 5749-2006[S]. Beijing: Standards Press of China, 2006. |
| [10] |
Bojaria Z, Tamera T L, Metica F. Alteration of intracellular GSH levels and its role in microcystin-LR-induced DNA damage in human hepatoma HepG2 cells[J]. Mutation Research, 2006, 611(1): 25-33. |
| [11] |
Weng D, Lu T L, Wei Y, et al. The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice[J]. Toxicology, 2007, 232(1/2): 15-23. |
| [12] |
黄会, 刘慧慧, 李佳蔚, 等. 水产品中微囊藻毒素检测方法及污染状况研究进展[J]. 中国渔业质量与标准, 2019, 9(2): 32-43. HUANG Hui, LIU Hui-hui, LI Jia-wei, et al. Progress on study of detecting methods and pollution condition of microcysins in aquatic products[J]. Chinese Fishery Quality and Standards, 2019, 9(2): 32-43. |
| [13] |
林丹.乌江渡水库网箱鱼汞和微囊藻毒素的污染状况及其可能对人体的危害[D].贵阳: 贵州医科大学, 2018. LIN Dan. Pollution of mercury and microcystins in cage fish in Wujiangdu Reservoir and its possible harm to human body[D]. Guiyang: Guizhou Medical University, 2018. |
| [14] |
李士杏, 付登强, 骆永明. 微囊藻毒素在土壤中的环境行为及污染风险[J]. 生态毒理学报, 2009, 4(3): 324-331. LI Shi-xing, FU Deng-qiang, LUO Yong-ming. Environmental behavior and risks of microcystins in soil[J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2009, 4(3): 324-331. |
| [15] |
全国食品工业标准化技术委员会.水中微囊藻毒素的测定GB/T 20466-2006[S].北京: 中国标准出版社, 2006. National Technical Committee on Food Industry of Standardization Administration of China. Determination of microcystins in water GB/T 20466-2006[S]. Beijing: Standards Press of China, 2006. |
| [16] |
梁丽丽, 弓爱君, 李红梅, 等. 高效液相色谱法检测水体中微囊藻毒素[J]. 分析化学, 2010, 10(5): 740-742. LIANG Li-li, GONG Ai-jun, LI Hong-mei, et al. Determination of microcystins in aquatic environment with high performance liquid chromatography[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2010, 10(5): 740-742. |
| [17] |
Oehrle S A, Southwell B, Westrick J. Detection of various freshwater cyanobacterial toxins using ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Toxicon, 2011, 55(5): 965-972. |
| [18] |
余秀娟, 樊继鹏. 高效液相色谱-质谱联用法测定饮用水中微囊藻毒素(MC-LR)的不确定度评定[J]. 环保科技, 2019, 2: 41-43, 48. YU Xiu-juan, FAN Ji-peng. Evaluation of uncertainty in determination of microcystin(MC-LR) in drinking water by LC-MS-MS[J]. Environmental Protection and technology, 2019, 2: 41-43, 48. |
| [19] |
Liu L Q, Xing C R, Yan H J, et al. Development of an ELISA and immunochromatographic strip for highly sensitive detection of microcystin-LR[J]. Sensors (Basel, Switzerland), 2014, 14(8): 72-85. |
| [20] |
Pyo D, Hahn J H. Determination of trace amount of cyanobacterial toxin in water by microchip based enzyme-linked immunosorbent assay[J]. J Immunoassay Immunochem, 2009, 30(1): 97-105. |
| [21] |
陈思锐, 侯建军, 刘细霞, 等. 基于核酸适配体的微囊藻毒素LR纳米金生物传感检测方法的建立及其识别机制研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2019, 10(17): 5748-5753. CHEN Si-rui, HOU Jian-jun, LIU Xi-xia, et al. Establishment of gold nanoparticles biosensor method for detection of microcystin LR based on aptamer and research on its recognition mechanism[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2019, 10(17): 5748-5753. |
| [22] |
吕佳佳.基于上转换纳米材料的微囊藻毒素LR检测与降解方法研究[D].无锡: 江南大学, 2017. LÜ Jia-jia. Study on the detection and degradation methods of microcystin-LR based on upconversion nanoparticles[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2017. |
| [23] |
谭文渊, 陈雨琴, 付大友, 等. 表面增强拉曼散射技术对白酒中克百威残留的定性检测[J]. 食品科学, 2019, 40(10): 318-324. TAN Wen-yuan, CHEN Yu-qin, FU Da-you, et al. Surface-enhanced Raman scattering spectoscopy for qualitative detection of carbofuran residues in Chinese liquor[J]. Food Science, 2019, 40(10): 318-324. |
| [24] |
袁景.基于表面增强拉曼光谱的真菌毒素和农药残留的检测及其应用[D].上海: 上海师范大学, 2016. YUAN Jing. Detection and application of fungal toxins and pesticide residues based on surface-enhanced Raman spectroscopy[D]. Shanghai: Shanghai Normal University, 2016. |
| [25] |
Yuan H, Ma W H, Chen C C, et al. Shape and SPR evolution of thorny gold nanoparticles promoted by silver ions[J]. Chem Mater, 2007, 1592-1600. |
| [26] |
张艳, 张彩虹, 陈剑刚. 液相色谱-串联质谱法检测水中微囊藻毒素LR和RR[J]. 中国卫生检验杂志, 2012, 7(22): 1481-1483. ZHANG Yan, ZHANG Cai-hong, CHEN Jian-gang. Determination of microcystin LR and RR in water by HPLC-MS/MS[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2012, 7(22): 1481-1483. |
| [27] |
Rebecca A H, Peter J V. Drop coating deposition Raman(DCDR)for microcystin-LR identification and quantitation[J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(13): 44-51. |
| [28] |
Huang Y P, Yang H, Li X, et al. Fabricating Au-Ag core-shell composite films for surface-enhanced Raman scattering[J]. Materials Science, 2008, 43: 5390-5393. |
| [29] |
刘诗马.新型银基纳米复合材料的抗菌性研究[D].上海: 上海大学, 2019. LIU Shi-ma. Study on the antibacterial activity of new silver-based nanocomposites[D]. Shanghai: Shanghai University, 2019. |
| [30] |
Esenturk E N, Hihgt A R. Surface-enhanced Raman scattering spectrosopy via gold nanostars[J]. J Raman Spectrosc, 2009, 40: 86-91. |