2021, Vol. 40
2. 山西医科大学药学院, 太原 030001
2. College of Pharmacy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
随着铬酸盐生产、电镀、制革等工业活动的发展[1]，越来越多的铬废弃物、铬渣排入土壤中。铬在土壤中最常见的化合物是以三价和六价形态存在，而六价铬一般不易被土壤中的有机物和胶体吸附，其在土壤中活性较高，与三价铬相比更容易被植物吸收，而且其还会通过食物链影响人类健康。三价铬主要以Cr（H2O）63+、Cr（H2O）3+、CrO2-等形式存在于环境中，相比六价铬，三价铬流动性小，对环境的危害较弱[2-3]。因此，近几年环境介质中六价铬污染的去除受到众多学者关注[4-7]。
对于铬污染土壤，现在主要的修复方法有电动修复法、化学还原法和微生物修复法。其中微生物修复法是一种环境友好、成本低的治理技术，具有较好的发展前景。许多微生物如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）[8-9]已被分离出来并发现对Cr（Ⅵ）污染土壤有良好的修复效果。熊智慧等[10]的研究发现，接种Alcaligenes sp. qz-1改善了铬（Cr2O72-）胁迫下玉米的生长特性，增加了玉米根部对铬（Cr2O72-）的吸收，降低了铬（Cr2O72-）对玉米的毒害。杜艳影等[11]通过实验证实，S. oneidensis MR-1在对Cr（Ⅵ）进行还原的同时也伴有少量的吸附作用。
生物炭（Biochar）是近年来新兴的一种新型高效土壤改良材料，含碳丰富，可增加农田土壤碳汇，提高土壤肥力。而且其孔隙度和比表面积较大，具有很好的吸附性能，能够为微生物提供附着载体，也为微生物的生长提供碳源和营养源，对土壤重金属污染的钝化具有良好的效果。研究表明，施加生物炭可以显著降低土壤重金属活性[12]，并减少农作物对重金属的吸收[13]。此外，生物炭改良土壤后不会造成二次污染，也不易发生反弹，即生物炭对土壤重金属的修复具有持久性[14]。因此，利用微生物和生物炭联合修复重金属污染土壤受到了众多学者的重视，夏梦莲等[6]的研究发现，巴氏芽孢杆菌菌液与生物炭复合修复铬污染土壤的效果要优于菌液和生物炭的单独修复。姜庆宏等[7]的研究发现，利用生物炭-藤黄微球菌复合材料修复Cr（Ⅵ）污染土壤，能有效降低土壤中Cr（Ⅵ）含量，而且对玉米的促生效果显著。
光合细菌是具有原始光能合成体系的原核生物，能在厌氧光照条件下进行不放氧光合作用。特别是紫色非硫细菌中的球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides），其不仅能在厌氧光照条件下光能自养生长，而且还能在好氧黑暗条件下利用有机物生长，这种随着生活环境而灵活改变代谢类型的特征，使其较其他微生物具有优越性[15]，同时，该菌还是一种益生菌。LI等[16]和FAN等[17]利用球形红细菌修复镉或铅污染的土壤，修复后的土壤上种植的小麦根和叶中镉和铅的积累都有所减少。前期研究工作表明球形红细菌H菌株能有效还原水中Cr（Ⅵ），其机制包括生物还原和积累[18]。但有关球形红细菌H菌株和生物炭联合修复铬污染土壤的研究鲜有报道，基于此，本研究采用球形红细菌H菌株和生物炭为修复材料，模拟铬污染土壤为研究对象，在H菌株处理过程中辅以添加生物炭，通过盆栽试验研究了H菌株、生物炭及H菌株与生物炭联合对铬污染土壤中铬的稳定化效果以及对小白菜生长的影响，以期为光合细菌和生物炭在铬污染土壤修复方面提供理论和实践依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验土样取自山西省太原市尖草坪区上兰村，0~20 cm土层，按照国际制土壤质地分类属于壤土。土样取回实验室后去除杂质，风干磨碎过2 mm尼龙筛，将一定量的K2Cr2O7（分析纯）溶解于去离子水中，搅拌均匀，配制成铬浓度为50 mg·kg-1的土壤，平衡30 d，备用。试验所用光合细菌H菌株系紫色非硫菌群红细菌属的球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides），由本实验室提供。研究所用生物炭购自江苏华丰农业生物工程有限公司，是由小麦秸秆在裂解炉600 ℃限氧环境下热裂解2 h所得，将其磨细过1 mm筛备用，生物炭理化性质由公司提供。供试作物选用四季小白菜。土壤和生物炭的基本性质见表 1和表 2。
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表 1 供试土壤的基本性质 Table 1 The basic properties of the tested soil |
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表 2 生物炭的理化性质 Table 2 Physical-chemical properties of biochar |
菌种培养：在光合细菌液体培养基中接种一定量的指数生长期的菌体培养液，置于人工气候箱（温度为30 ℃、光照强度为2 500 lx）培养至OD590 nm为1.2，经5 000 r·min-1离心分离30 min，弃上清液，加入等量超纯水制备成菌悬液（1.0×109 CFU·mL-1），备用。CK组不添加生物炭和菌悬液，用等量的超纯水代替菌悬液。
将平衡好的土壤平均分装到塑料花盆中（规格为上口径20 cm，下口径12 cm，高8 cm），每盆中的土壤质量为1 kg，将生物炭和制备好的菌悬液按照试验设计加入到土壤中，混合均匀，具体设计见表 3。将每个花盆用保鲜膜密封，并在人工气候箱中（温度为30 ℃、光照强度为2 500 lx）培养30 d，试验过程中每隔2 d加入超纯水保持土壤含水率为60%（烘干-称量法测定），1个月后，测定土壤中酶活性、H菌株的数量以及铬的形态含量。
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表 3 不同处理组中生物炭和菌株的添加量 Table 3 Correspondence table of biochar and strain addition amount in different treatment groups |
选取饱满、大小一致的小白菜种子浸种、催芽后均匀种植于上述花盆中，每盆定植5棵白菜，间隔均匀，每组3个平行，试验过程中每隔2 d加入超纯水保持土壤含水率为60%（烘干-称量法测定），随机置于室内自然光下生长，40 d后收获小白菜。先用自来水将植株冲洗干净，再用去离子水润洗，吸干表面水分后分成地上部分和地下部分，保存，待测。
1.4 测定项目与方法土壤酶活性的测定参照文献[19]中的方法：过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定；脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定；转化酶活性采用二硝基水杨酸比色法测定；碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定。
菌液和土壤中H菌株的数量测定：采用稀释平板培养法计数。
土壤中5种形态铬的提取方法及测定：称取部分烘干土样，采用Tessier连续提取法[20]，分别提取可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机质结合态、残渣态，土壤样品用HNO3-HCl-HClO4电热板消解，采用ICP-OES进行铬含量的测定。生物可利用性=（可交换态+碳酸盐结合态）/5种形态总和×100%
对CK、T6处理组采用X射线光电子能谱仪分析Cr（Ⅵ）污染土壤修复前后的元素组成与价态变化；利用XRD衍射分析仪分析Cr（Ⅵ）污染土壤修复前后的晶体结构。
植株中铬含量的测定：收获植株的根、茎、叶于105 ℃下杀青0.5 h，75 ℃烘干至恒质量，称取适量的地上部分和根系干质量，用HNO3∶HClO4=4∶1进行消解，消解液中铬含量采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定。采用转移系数（TF）表示铬在小白菜各部位中的迁移特性。TF=植株地上部分的铬含量（mg·kg-1）/植株根系的铬含量（mg·kg-1）
小白菜的株高和根长：收获小白菜后，用自来水清洗植株和根部，测量3次株高和根长，并取平均值。
植物中叶绿素含量的测定采用丙酮浸提法[21]。可溶性糖含量的测定采用苯酚硫酸法[22]。
1.5 数据处理与分析试验数据采用Microsoft Excel 2010和Origin 8.5软件分析与作图，并使用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，采用Duncan双因素方差分析进行处理间差异显著性检验。
2 结果与分析 2.1 不同处理对铬污染土壤中酶活性和H菌株数量的影响土壤中的酶活性与土壤肥力水平密切相关，本研究对铬污染土壤中修复后的酶活性和培养30 d的H菌株的数量进行测定，结果见表 4。与CK组相比，只添加H菌株时，4种酶活性在T2处理组增加效果最显著，只添加生物炭时，T4处理组效果最佳，可见，H菌株和生物炭均有助于土壤酶活性的提高。当利用二者联合修复后，铬污染土壤中4种酶活性均显著升高，过氧化氢酶变化趋势表现为T6>T7>T5>T10>T11> T9、脲酶为T6>T7>T5>T10>T11>T9、转化酶为T6> T7>T11>T10>T5>T9、碱性磷酸酶为T6>T7>T10>T11> T5>T9。T6处理组变化最显著（P < 0.05），过氧化氢酶、脲酶、转化酶和碱性磷酸酶活性比CK组分别升高了58.72%、98.25%、136.58% 和61.03%。结果表明H菌株和生物炭的联合作用对土壤酶活性有显著影响（P < 0.05）。另外，H菌株添加到铬污染土壤中30 d后，菌落数量有所减少。
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表 4 不同处理对铬污染土壤中酶活性和H菌株数量的影响 Table 4 Effects of different treatment groups on enzyme activity and number of H strain in chromium contaminated soil |
图 1是不同处理对污染土壤中铬形态分布的影响。由图 1可知，H菌株和生物炭单一及联合施用都会改变土壤中铬的形态分布，CK组土壤中铬以残渣态和可交换态为主。经修复剂处理后，各处理组土壤中铬的碳酸盐结合态和可交换态含量降低，残渣态和有机结合态含量增加，铁锰氧化物结合态含量变化较小。单加H菌株时，T2处理组效果最好，生物可利用性比CK组降低了11.39%；单加生物炭时，T4处理组效果最佳，生物可利用性比CK组降低了10.31%；当H菌株和生物炭联合修复时，T5、T6、T7、T9、T10和T11处理与CK组相比，生物可利用性分别降低了13.03%、17.42%、15.11%、11.47%、14.41% 和12.93%，可见，生物可利用性在H菌株和生物炭的联合作用下显著降低，并且T6处理修复效果最好（P < 0.05）。
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图 1 不同处理对污染土壤中铬形态分布的影响 Figure 1 Effects of different treatment groups on morphology distribution of chromium in contaminated soil |
为了探究H菌株和生物炭对铬污染土壤的修复机制，对修复前后的土壤进行XPS分析和XRD分析。图 2a和图 2b分别为铬污染土壤修复前后的XPS全谱图和修复后土壤中Cr元素的XPS窄谱图。由图 2可以看出，修复前后土壤中主要含C、O、Cr和N元素，Cr元素（580.7 eV）为Cr（Ⅵ），且修复后的土壤在578.5 eV处有新峰出现，该峰已被证实是Cr2O3的峰，说明在Cr（Ⅵ）污染土壤的修复过程中，部分Cr（Ⅵ）被还原为Cr（Ⅲ）。
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图 2 Cr（Ⅵ）污染土壤的XPS全谱图（a）和Cr2p的窄轨道谱图（b） Figure 2 XPS spectra(a)and Cr2p(b)of Cr (Ⅵ)contaminated soil |
图 3是Cr（Ⅵ）污染土壤修复前后的XRD图，由图 3可知，修复前土壤中铬主要以K2Cr2O7的形式存在，其衍射峰出现在2θ为26.7°和29.5°处，修复后Cr（Ⅵ）污染土壤在2θ为24.5°、33.6°、36.1°、39.9°和54.9°处出现了Cr2O3沉淀峰，在2θ为49.1°处还出现了HCrO2的峰，这是造成土壤中Cr（Ⅲ）存在的主要原因。并且修复后土壤中K2Cr2O7含量减少，其中一部分转化为Cr2O3。
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图 3 Cr（Ⅵ）污染土壤修复前后的XRD图 Figure 3 XRD patterns of Cr (Ⅵ)contaminated soil before and after remediation |
不同处理对铬污染土壤中小白菜各组织铬含量的影响见表 5。由表 5可知，各处理中根系的铬含量要高于地上部分，即铬主要在根中积累；经修复剂处理后，小白菜各组织铬含量均有所下降，相应的转移系数也在降低。在相同生物炭添加量条件下，H菌株添加量为108 CFU·g-1时，小白菜地上部分和根系的铬含量降低显著（P < 0.05），相同H菌株添加量条件下，生物炭添加量为1% 的效果较好，同时，在H菌株和生物炭的联合作用下效果更加显著（P < 0.05），并且在T6处理时，两者达到最佳配施量，与CK组相比，地上部分和根系铬含量分别降低了26.67% 和14.84%。
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表 5 不同处理对铬污染土壤中小白菜各组织铬含量的影响（mg·kg-1） Table 5 Effects of different treatment groups on the chromium content of pakchoi tissues in chromium contaminated soil （mg·kg-1） |
不同处理对铬污染土壤中小白菜株高和根长的影响见图 4。由图 4可知，单加H菌株时，小白菜的株高和根长随着菌株添加量的增加先升高后降低，并且在添加量为108 CFU·g-1时效果最好，此时与CK组相比，株高和根长分别增加了6.5% 和5.92%；单加生物炭时也表现出相同的规律，在生物炭添加量为1% 时效果最好，株高和根长较CK组提高了5.26% 和4.37%，生物炭添加量为3% 的处理对小白菜生长的促进作用减弱，但始终高于CK组。当H菌株和生物炭联合修复时，相同H菌株添加量条件下，生物炭添加量为1%的效果要优于3%，相同生物炭添加量条件下，H菌株添加量为108 CFU·g-1时效果显著（P < 0.05），并且在H菌株添加量为108 CFU·g-1且生物炭添加量为1%时，小白菜的株高和根长增加最显著（P < 0.05），分别比CK组增加了13.25%和10.63%。
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不同大写字母表示生物炭添加量相同、H菌株添加量不同的处理间差异显著（P < 0.05）；不同小写字母表示H菌株添加量相同、生物炭添加量不同的处理间差异显著（P < 0.05）。下同 Different capital letters indicate that the addition amount of biochar is the same, and the addition amount of H strain is different, the difference between the treatments is significant(P < 0.05). Different lowercase letters indicate that the addition amount of H strain is the same, and the addition amount of biochar is different, the difference between the treatments is significant (P < 0.05). The same below 图 4 不同处理对铬污染土壤中小白菜株高和根长的影响 Figure 4 Effect of different treatment groups on plant height and root length of pakchoi in chromium contaminated soil |
不同处理对铬污染土壤中小白菜叶绿素和可溶性糖含量的影响见图 5。由图 5可知，一定浓度的H菌株可以促进铬污染土壤中小白菜叶绿素和可溶性糖含量升高，且最适添加量为108 CFU·g-1，与CK组相比，叶绿素和可溶性糖含量分别增加了10.81% 和11.21%；而且添加适量的生物炭也会对小白菜的生长有利，当生物炭添加量为1% 时，表现出较好的效果，与CK组相比，小白菜的叶绿素和可溶性糖含量分别增加了9.84%和10.38%；当H菌株和生物炭联合修复时，相同H菌株添加量条件下，生物炭添加量为1% 时效果显著，相同生物炭添加量条件下，H菌株添加量为108 CFU·g-1时效果显著，并且在H菌株添加量为108 CFU·g-1和生物炭添加量为1% 时，小白菜的叶绿素和可溶性糖含量增加最显著（P < 0.05），分别比CK组增加了30.08%和17.39%。
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图 5 不同处理对铬污染土壤中小白菜叶绿素和可溶性糖含量的影响 Figure 5 Effects of different treatment groups on chlorophyll and soluble sugar content of pakchoi in chromium contaminated soil |
土壤酶参与土壤中各种生物化学过程，是判断土壤生物化学过程强度及评价土壤肥力的重要指标之一[23]。本试验结果显示，H菌株和生物炭及其联合作用对土壤中的酶活性显著提高，特别是在两者共施条件下的促进作用更加明显，这与李琋等[24]利用微生物协同生物炭修复石油烃-镉复合污染土壤得出的结论一致，可能原因是H菌株以加入的生物炭为能源在土壤中进行细胞代谢，加快土壤中氮素循环和有机磷的水解，增加了全氮、速效氮和速效磷含量，进而对脲酶和碱性磷酸酶活性产生了显著影响。蔗糖酶活性可以表征土壤有机碳的转化情况[19]，本研究中，施用生物炭增加了蔗糖酶含量，有利于土壤有机质的提高，促进了过氧化氢酶的活性。同时，铬化学形态的改变对土壤酶活性也有不同程度的影响，结合图 1可知，H菌株和生物炭可以使土壤中铬的生物毒性降低，因此有利于土壤中酶活性的升高。本研究结果也表明（表 4），添加适量的生物炭会促进H菌株数量的增加，主要原因是生物炭独特的结构能够为H菌株提供有利的繁殖场所，且其含有的丰富营养物质有利于H菌株的生长[25]。
除此之外，微生物和生物炭还可以通过改变土壤中重金属的形态分布来降低其生物有效性，进而减少植物对重金属的积累。张海波等[26]的研究发现，菌糠生物炭可促进土壤中的Pb、Cd由活性较高的形态向较稳定的形态转化，降低Pb、Cd的生物有效性，进而减少甜菜各部位对Pb、Cd的吸收，促进甜菜生长。姜庆宏等[7]通过实验得出，藤黄微球菌和生物炭复合，对Cr（Ⅵ）污染土壤修复效果显著，各个处理均减少了玉米地上、地下部分对铬的吸收，降低了铬通过食物链对人体产生的危害。本研究结果显示，H菌株和生物炭及其联合作用下铬污染土壤中小白菜各组织铬含量均显著减少，且铬的5种形态含量也发生明显变化，即由不稳定态铬转化为稳定态铬。这和夏梦莲等[6]和李冉等[27]的研究结果类似。
多数研究表明[28-30]，施用微生物和生物炭不仅可以降低重金属生物有效性、提高土壤肥力，还可以促进作物生长并提高产量，并且两者联合修复的效果更好。MARYEM等[31]的研究表明，在生物炭和细菌（Pseudomonas japonica和Bacillus cereus）联合修复过的Cr（Ⅵ）污染土壤上种植小麦，小麦的株高和生物量显著增加。也有研究证明，添加光合细菌与猪场粪污能提高生菜的生长与品质指标，相比单独添加光合细菌和猪场粪污具有更好的效果[32]。本研究结果表明，添加H菌株和生物炭对铬胁迫下小白菜的促生效果显著，并且在T6处理组小白菜的株高、根长、叶绿素和可溶性糖含量均达到最大值，说明此时土壤孔隙中的H菌株和生物炭添加量基本趋于饱和，继续添加不仅会加剧微生物之间的竞争，还会影响根系对矿质营养元素的吸收[33]。最适添加量条件下，微生物和生物炭可以提高土壤水分和养分的保持能力，增加土壤中有机质的含量，从而促进植物的生长[34]。同时，H菌株对Cr（Ⅵ）具有一定的生物还原作用[18]，土壤中的部分Cr（Ⅵ）被有效还原为Cr（Ⅲ），降低了铬的毒性，增强了合成叶绿素有关酶的活性；生物炭能够吸附重金属污染物，改善土壤环境[35]，为微生物的生长繁殖提供营养物质和栖息场所，促进铬胁迫下小白菜的生长，提高其叶绿素和可溶性糖含量。
综上所述，推测H菌株和生物炭修复Cr（Ⅵ）污染土壤的机理如图 6所示：首先，球形红细菌H菌株以生物炭为能源[36-37]，增强了对土壤中某些碳源的利用能力，从而诱导自身产生Cr（Ⅵ）还原酶，并且将该酶排出体外，将土壤中的部分Cr（Ⅵ）还原为Cr（Ⅲ）[38]，还原后的Cr（Ⅲ）主要以Cr2O3和少量HCrO2的形式存在于土壤环境中；另一方面，生物炭表面带正电荷的官能团对带负电荷的六价铬基团（Cr2O72-）具有静电吸附作用[39]，从而限制了重金属离子的游离状态，降低了其生物有效性，改变了土壤中铬的形态分布，使土壤中的铬向稳定态转化，最终降低土壤的毒性，促进小白菜的生长。
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图 6 推测机理示意图 Figure 6 Schematic diagram of speculation mechanism |
（1）球形红细菌H菌株和生物炭单一及联合修复铬污染土壤30 d的研究表明，联合处理组的修复作用明显优于单一处理组，使土壤中铬的生物可利用性和毒性大幅度下降，土壤酶活性显著升高，并且当菌株添加量为108 CFU·g-1和生物炭添加量为1% 时，修复效果最好。
（2）盆栽试验结果表明，添加H菌株和施加生物炭均对小白菜的生长有明显的促生作用，且两者联合作用的效果更加显著（P < 0.05）。说明H菌株和生物炭对铬污染土壤和小白菜具有较好的修复和促生效果。
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