2021, Vol. 40
直至20世纪80年代腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）及GS -15金属还原菌（Geobacter metallareducens）[1]的成功分离，人们才真正认识到异化铁还原过程是厌氧环境中铁形态转化最为重要的一部分[2]。异化铁还原过程是土壤和沉积物中Fe（Ⅲ）还原的主要形式[3]，已成为生物修复的重要手段[4]，具有重要的地球化学意义[5]。研究表明，Fe（Ⅲ）还原生成的Fe（Ⅱ）可催化还原U（Ⅵ）[6]、Cr（Ⅵ）[7]、Hg（Ⅱ）[8]、As（Ⅴ）[9-10]等高毒性离子[11]；利用异化铁还原过程可进行有机氯污染修复[12]以及地下水中芳香烃化合物的降解[13]；还有研究发现添加Fe（Ⅲ）氧化物可抑制甲烷产生，其主要原因是异化铁还原菌竞争使用了产甲烷所需的氢气和乙酸盐[14-16]。另外，异化铁还原菌还可以以电极为电子受体，将电子传递给电极从而产生电流，这在发展生物电池、生产清洁能源方面发挥了重要作用[17]。
天然腐植酸[18]和腐殖质同类物蒽醌-2，6-二磺酸盐（anthraquione-2，6-disulfonate，AQDS）[19]是异化铁还原过程中常见的电子传递物质。研究表明，添加腐植酸或AQDS可以促进Se（Ⅳ）、Te（Ⅳ）[20]、Cr（Ⅵ）、U（Ⅵ）[21]的还原；LOVLEY等[22]提出，AQDS对异化铁还原过程的促进作用不仅体现在其可加速Fe（Ⅲ）的还原，还体现在其扩大了异化铁还原菌对Fe（Ⅲ）的利用范围，提高了对Fe（Ⅲ）的利用能力。虽然国内外对添加电子传递物质促进重金属转化和有机污染物降解已开展了大量研究，但由于腐植酸结构复杂，具有大量活性官能团，因此针对不同来源天然腐植酸在异化铁还原过程中的作用差异还鲜有报道。
为强化异化铁还原过程，并为生物修复领域提供理论基础，本文以腐败希瓦氏菌为电子驱动力，以人工合成的Fe（OH）3为电子受体，通过加入不同浓度、不同来源的天然腐植酸及腐殖质同类物AQDS，考察了电子传递物质对异化铁还原过程的影响。同时对不同来源的腐植酸进行理化性质分析，以解释其对异化铁还原过程的作用差异。
1 材料与方法 1.1 实验试剂腐败希瓦氏菌购自广东省微生物研究所；艾略特土壤腐植酸（Elliott soil humic acid，ESHA）、泥炭湿地腐植酸（Pahokee peat humic acid，PPHA）均购自国际腐殖质协会。
Fe（OH）3的人工合成[23]：称取38.07 g FeCl3·6H2O于2 L大烧杯中，加入1 L去离子水，磁力搅拌使其溶解，滴加1 mol·L-1 NaOH溶液使pH=7.0~7.6，得到红褐色悬液。静置悬液，待悬液分层后倾出上层清液，加入去离子水搅拌，于4 000 r·min-1离心10 min，如此重复3次，以去除Na+的影响。最后加入1 L去离子水，搅拌得到人工合成的Fe（OH）3，其含铁量为8.09 g·L-1。
菌悬液的制备[24]：将培养至对数增长期的菌悬液于4 000 r·min-1下离心，倾去上清液，用25 mmol·L-1除氧、无菌的磷酸缓冲液洗涤、离心，如此重复3次后，用等体积的磷酸缓冲液悬浮菌体，制成菌悬液。控制菌悬液OD600 =0.8，保存于4 ℃冰箱中。
腐植酸储备液的制备：分别称取20 mg ESHA、PPHA溶于10 mL PIPES缓冲溶液中，用0.1 mol·L-1 NaOH溶液调节pH=7.0。磁力搅拌4 h后将腐植酸溶液过0.22 μm滤膜，得到两种腐植酸的储备液，并保存于4 ℃冰箱中。利用总有机碳分析仪测定ESHA、PPHA储备液的总有机碳质量浓度分别为1 950、1 740 mg · L-1，以溶解性有机碳（Dissolved organic carbon，DOC）计。
AQDS储备液的制备：称取0.412 3 g AQDS溶于超纯水中，并定容至100 mL，将定容后的溶液过0.22 μm滤膜，得到10 mmol·L-1 AQDS储备液，并保存于4 ℃冰箱中。
1.2 实验方法采用厌氧培养的方法，在若干个10 mL带盖样品瓶中，分别加入人工合成的Fe（OH）3 1 mL和5 g·L-1 NH4Cl溶液1 mL，加盖后于121 ℃灭菌20 min，冷却后开盖，加入过0.22 μm滤膜的25 mmol·L-1磷酸缓冲液（控制体系的pH=7.0）、电子传递物质、50 g·L-1葡萄糖（以C6H12O6计）各1 mL，菌悬液1 mL。以不加菌和电子传递物质（添加2 mL无菌水处理）作为对照组，同时以只加菌而不加电子传递物质（添加1 mL无菌水处理）作为实验组，最终溶液体积控制在6 mL。充氮除氧后压盖密封，于30 ℃恒温箱中培养，并定期测定Fe（Ⅱ）质量浓度[25]。对照组和实验组均设置3组平行。
1.3 测定方法 1.3.1 微生物Logistics方程异化铁还原是微生物介导的生物学过程，受微生物生长过程的影响，因此用表征微生物生长的Logistics方程对其进行拟合，以描述还原过程中Fe（Ⅱ）质量浓度的变化。其表达式为：
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式中：t为反应时间，d；ρt为反应时间t时体系中Fe（Ⅱ）的质量浓度，mg·L-1；a为Fe（Ⅱ）的最大积累量，mg·L-1；b为模型参数；c为速率常数。
最大还原速率Vmax=0.25ac；最大还原速率所对应的时间
采样时，各处理取出一瓶，摇匀开盖，吸取1 mL悬液加入4 mL 0.5 mol·L-1盐酸中，于180 r·min-1的振荡培养箱中浸提1.5 h。随后将浸提液过0.22 μm滤膜，在510 nm下用邻菲罗啉分光光度法测定Fe（Ⅱ）质量浓度[26]。Fe（Ⅲ）还原率为：
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式中：ρFe (Ⅱ) 终为最终测得的Fe（Ⅱ）质量浓度，mg·L-1；ρFe (Ⅱ) 初为空白对照组测得的初始Fe（Ⅱ）质量浓度，mg· L-1；ρFe (Ⅲ) 总为人工合成Fe（OH）3的含铁量，mg·L-1。
1.3.3 紫外-可见吸收光谱分析选取10 mg·L-1（DOC）腐植酸在TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计上进行扫描，扫描范围为200~600 nm[27]，扫描间距为1 nm。测定波长在254、436 nm下的吸光度E254、E436，并计算该波长下的吸光度与腐植酸所含DOC质量浓度的比值（E×100/ρDOC），并计作SUVA254、SUVA436；测定波长在465、665 nm下的吸光度E465、E665，计算E465/E665，简写为E4/E6。
1.3.4 傅里叶红外吸收光谱分析采用KBr混合压片法，通过傅里叶红外光谱（Fourier transform infra-red spectroscopy，FT-IR）测定腐植酸样品，扫描范围为4 000~400 cm-1。
1.4 数据处理与分析采用Excel 2019进行数据初步处理，采用Origin 8.0进行数据分析并做图，图表中数据均为平均值±标准差。
2 结果与讨论 2.1 不同来源腐植酸的性质 2.1.1 元素组成对两种腐植酸进行元素组成分析，并通过计算C/H、C/N的比值分析腐植酸来源和结构的差异性。结果如表 1所示。
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表 1 腐植酸的元素组成 Table 1 The elemental composition of humic acid |
由表 1可知，两种腐植酸的C、H、N、S含量差异不显著（P>0.05），说明两者在组成上无显著差异。C/H值可表示腐植酸的芳香性程度和脂肪性程度[28]，C/H值越大，芳香性程度越大，脂肪性程度越小。由此可知ESHA的芳香性程度高于PPHA，其含有更多的芳香性基团；而PPHA脂肪性程度更大，其含有更多的脂肪链结构。C/N值则表示腐植酸的腐殖化程度[29]，C/N值越小，腐殖化程度越大，因此可知ESHA的腐殖化程度更大，性质更稳定。
2.1.2 紫外-可见吸收光谱分析不同来源腐植酸的紫外-可见吸收光谱曲线如图 1所示。
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图 1 紫外-可见吸收光谱曲线 Figure 1 UV-Visible absorption spectrum curve |
腐植酸是含有苯环、羧基、酮基、羰基等各种官能团的大分子混合物，这些官能团的吸收峰靠得较近，因此在200~280 nm出现了吸收峰相互重叠的现象[30]。由图 1（a）可知，ESHA和PPHA在295 nm处均有一个吸收峰，其被认为与腐植酸中含有的木质素磺酸及其衍生物有关[31]。在此吸收峰下，相同质量浓度的腐植酸吸光度越大，腐殖化程度越高，由此可看出ESHA的腐殖化程度相比于PPHA更高，这与之前元素分析得到的结论一致。同时提供模型物AQDS的紫外吸收光谱图作为参考，如图 1（b）所示，在328 nm处出现了蒽醌特征峰。
研究表明，相同DOC的有机物在254 nm下吸光度的增加由含有碳-碳不饱和键的化合物（如芳香族化合物）引起，SUVA254为该波长下的吸光度与腐植酸所含DOC质量浓度的比值，该值越大，腐植酸芳香性、相对分子质量和腐殖化程度越大[32]。由表 2可见，ESHA的SUVA254值大于PPHA，说明ESHA较PPHA含有更多不饱和共轭组分，芳香性和腐殖化程度更强。
SUVA436为腐植酸在436 nm下吸光度乘以100再与DOC质量浓度的比值，其与有机物中的醌基含量呈正相关[33]。由表 2可知，来自土壤的ESHA醌基多于来自泥炭湿地的PPHA。
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表 2 腐植酸的紫外-可见吸收光谱特征参数值 Table 2 UV-Visible absorption spectrum eigenvalues parameters of humic acid |
腐植酸溶液在465 nm和665 nm下的吸光度比值E4/E6是表示腐植酸结构芳香缩合程度、相对分子质量的特征参数，该比值越低，芳香缩合程度越高，相对分子质量越大[34]。由表 2可知，ESHA的芳香缩合程度和相对分子质量大于PPHA。两种腐植酸E4/E6值均小于5，说明两者芳香缩合程度均较高，分子结构较复杂[34]。在465 nm下的吸光度E4值与醌基含量呈正相关[35]，说明ESHA的醌基含量多于PPHA，这与SUVA436所表示的结果一致。
对ESHA和PPHA各个紫外特征参数值进行方差分析，结果见表 3。SUVA254、SUVA436和E4的P值均小于0.05，说明两种腐植酸在腐殖化程度以及醌基含量上具有显著差异，而E4/E6的P>0.05，说明两种腐植酸在相对分子质量上无显著差异，均为大分子有机物。
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表 3 腐植酸紫外特征参数值的方差分析 Table 3 The variance analysis of UV-Visible eigenvalues parameters of humic acid |
由图 2可知，两种腐植酸出现了相似的吸收峰，说明两者具有相似的结构特征，但在吸收强度上略有区别。参考文献[36-38]的解释：3 300 cm-1处吸收峰由以氢键缔合的—OH伸缩振动形成；2 920 cm-1是脂肪族烷烃结构中C—H不对称及对称共振吸收峰，说明腐植酸含有脂肪碳链结构；1 710 cm-1和1 610 cm-1处为苯环C=C和形成氢键的羧基、醛基或羰基中的C=O以及N—H的伸缩振动吸收峰，说明腐植酸含有较多不饱和芳香族化合物；在1 230 cm-1处出现的吸收峰由羧基C—O和多糖类C—O—C伸缩振动所致。
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图 2 腐植酸红外光谱图 Figure 2 The FTIR spectra of humic acid |
设置腐植酸质量浓度分别为0、10、50、100、200、500 mg·L-1，以探讨其质量浓度对铁还原过程的影响，结果如图 3所示。对照组基本没有发生异化铁还原现象，只加菌的实验组Fe（Ⅲ）还原率为对照组的11.98倍，可见异化铁还原菌是异化铁还原的必要条件。由图 3（a）可见，与只加菌的实验组相比，不同质量浓度ESHA处理对异化铁还原过程的促进效果显著（P < 0.05），除100 mg·L-1外，Fe（Ⅲ）还原能力随ESHA质量浓度增加而增大。10、50、100 mg·L-1的ESHA对Fe（Ⅲ）还原的促进效果差异较小，200 mg· L-1ESHA在40 d后极大地促进了Fe（Ⅲ）的还原。当体系中含有500 mg·L-1 ESHA时，在20~40 d Fe（Ⅲ）迅速还原，在40 d时反应达到稳定，此时Fe（Ⅲ）还原率达到66.71%。如图 3（b）所示，相比于只加菌的实验组，添加不同质量浓度PPHA的处理均促进了Fe（Ⅲ）的还原，但各质量浓度之间的Fe（Ⅲ）还原率差异不显著（P>0.05），均在35%左右。对两种来源的腐植酸进行方差分析，发现两者对异化铁还原过程的促进效果差异显著（P < 0.05）。
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图 3 腐植酸对微生物介导的铁还原过程的影响 Figure 3 Effects of humic acid on microbial-mediated iron reduction |
设置AQDS浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、4.0、8.0 mmol·L-1，以探讨AQDS浓度对铁还原过程的影响，结果如图 4所示。由图 4可见，在体系中添加AQDS显著增强了Fe（Ⅲ）的还原效果，且还原效果整体与体系中的AQDS浓度呈正相关（P < 0.05）。体系中含有0.1~1.0 mmol·L-1 AQDS时，最终Fe（Ⅲ）还原率较只加菌的实验组仅提高了1.40~1.94倍。添加4.0 mmol·L-1 AQDS的实验组在25 d后Fe（Ⅱ）迅速累积，达到只加菌实验组的2.77倍。而当体系中含有8.0 mmol·L-1 AQDS时，从第8 d开始，Fe（Ⅲ）迅速还原，并在第16 d趋于稳定，最终Fe（Ⅲ）还原率达到87.98%。
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图 4 AQDS对微生物介导的铁还原过程的影响 Figure 4 Effects of AQDS on microbial-mediated iron reduction |
用Logistics方程拟合电子传递物质促进微生物介导的Fe（Ⅲ）还原过程中Fe（Ⅱ）的积累过程，结果如表 4和表 5所示。
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表 4 腐植酸对铁还原过程影响的动力学参数 Table 4 Kinetics parameters of the effects of humic acid on iron reduction process |
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表 5 AQDS对铁还原过程影响的动力学参数 Table 5 Kinetics parameters of the effects of AQDS on iron reduction process |
由表 4可知，添加了ESHA的体系中Fe（Ⅲ）还原的最大反应速率较只加菌的实验组有所增加，但高质量浓度（200、500 mg·L-1）ESHA反而小于低质量浓度（10~100 mg·L-1）ESHA处理。同时，相比于只加菌的实验组，添加低质量浓度ESHA时，Fe（Ⅲ）还原的最大还原速率所对应的时间提前了4.46~7.26 d，而添加高质量浓度ESHA时反而延后了约7 d。由此可知，低质量浓度ESHA主要在反应初期起加快Fe（Ⅲ）还原速率的作用，高质量浓度ESHA主要在反应后期起增加Fe（Ⅱ）产生量的作用。对PPHA而言，随着其质量浓度的增大，Fe（Ⅲ）还原率变化较小，最大还原速率减小，而最大还原速率所对应的时间相比于只加菌的实验组提前了5.01~8.26 d。由此可知，PPHA主要起加快Fe（Ⅲ）还原速率的作用，而对增加Fe（Ⅱ）产生量的作用不显著（P>0.05）。对比两种腐植酸的动力学参数，在10~100 mg·L-1质量浓度下，两者差异并不显著（P>0.05）；在200、500 mg· L-1下，ESHA达到Fe（Ⅲ）最大还原速率所对应的时间明显长于PPHA，但Fe（Ⅲ）还原率较PPHA增大了近1倍。
由表 5可知，随着体系中AQDS浓度的增大，Fe（Ⅲ）的最大反应速率呈现先减小后增大的现象。除4.0 mmol·L-1AQDS外，Fe（Ⅲ）最大还原速率所对应的时间相比于只加菌实验组均有提前。另外，添加了AQDS的体系中Fe（Ⅲ）最终还原率提高了0.40~2.22倍。由此可知，AQDS既能缩短Fe（Ⅲ）还原达到平衡的时间，还能大幅提高Fe（Ⅱ）的产生量。
2.3 腐植酸的作用机理腐植酸是一种结构复杂的大分子溶解性有机物（DOM），无法进入微生物细胞内部，从而难以被降解利用。但由于腐植酸具有的醌基等氧化还原活性基团，使其可以在Fe（Ⅲ）氧化物和微生物之间转移电子，发挥电子传递作用，从而克服了Fe（Ⅲ）和微生物必须直接接触的限制，促进了异化铁还原过程[39]。腐植酸作为一种电子传递物质，其转移电子的能力与其自身醌基基团的含量有关[40]。醌基是腐植酸在异化铁还原过程中发挥电子转移能力的主要基团[39]，其含量越多，越有利于Fe（Ⅲ）还原[41]。两种腐植酸的紫外特征参数（表 2）普遍得出ESHA所含醌基多于PPHA，这可能是ESHA促进Fe（Ⅲ）还原的能力要强于PPHA的原因。
研究发现，在加入DOM而未加入碳源时，Fe（Ⅲ）能少量被还原，其解释为小分子DOM（如氨基酸、有机酸等）可作为碳源被微生物利用代谢，而当同时加入DOM和碳源时，Fe（Ⅲ）还原作用明显，并且高出不加DOM而加入碳源实验组的51.2%。同时结合其对DOM电子供给量（EDC）的测定，发现DOM确实在Fe（Ⅲ）还原过程中存在电子转移[42]。在垃圾填埋过程中对DOM电子转移能力进行测定，发现加入DOM后的电子转移量显著大于微生物和Fe（Ⅲ）直接接触的电子转移量[43]。JIANG等[44]的定量实验显示，GS- 15向腐植酸和Fe（Ⅲ）传递电子的速率分别为617、23 μmol·min-1·g-1，而被微生物还原后的腐植酸向Fe（Ⅲ）传递电子的速率为微生物直接向Fe（Ⅲ）传递电子速率的7倍以上，证实了腐植酸在异化铁还原过程中的电子传递作用。在添加腐植酸而未添加碳源的异化铁还原体系中，Fe（Ⅲ）未发生还原，说明腐植酸不能作为碳源给微生物提供能量，只有在添加碳源后，腐植酸才能作为电子传递物质发挥作用[45-46]。可见，大分子腐植酸在异化铁还原过程中是作为电子传递物质发挥促进作用。
如图 5所示，在异化铁还原过程中，微生物通过厌氧呼吸氧化电子供体，腐植酸接受来自有机物氧化得到的电子而转为还原态，还原态腐植酸又将得到的电子传递给最终电子受体Fe（Ⅲ），而自身回到氧化态，如此循环往复[47]。电子传递物质与微生物和Fe（Ⅲ）氧化物分别接触的几率高于微生物和Fe（Ⅲ）直接接触的几率，当两者无法直接接触时，电子传递物质可起到桥梁作用[48]，将微生物呼吸链上的电子传递到Fe（Ⅲ）氧化物表面。不同来源腐植酸具有不同的电子传递能力，如土壤腐植酸的电子传递能力强于水体腐植酸，而电子供给能力弱于水体腐植酸[49]。RATASUK等[50]和SHARPLESS等[51]对不同来源腐植酸进行了电子传递能力测定，发现其与芳香化程度呈正比，这与本实验得到的结果一致。
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图 5 异化铁还原菌还原金属离子、有机污染物的机理 Figure 5 The mechanism of reduction of metal ions and organic pollutants by dissimilatory iron reducing bacteria |
（1）泥炭湿地腐植酸（PPHA）和土壤腐植酸（ESHA）在元素组成和结构上均具有一定的相似性，但ESHA相比于PPHA拥有更高的腐殖化程度及更多的醌基基团。
（2）ESHA对Fe（Ⅲ）还原的促进作用体现在低质量浓度ESHA在反应初期增大Fe（Ⅲ）还原速率，高质量浓度ESHA在反应后期增加Fe（Ⅱ）产生量；PPHA在Fe（Ⅲ）还原过程中主要起增大Fe（Ⅲ）还原速率的作用；腐殖质模型物蒽醌-2，6-二磺酸盐（AQDS）不仅能加快Fe（Ⅲ）的还原速率，还能大幅提高Fe（Ⅱ）的产生量。三者对异化铁还原过程的促进效果均呈现随着添加浓度增大而增强的趋势。
（3）腐植酸作为电子传递物质在异化铁还原过程中发挥作用，含有更多醌基基团的ESHA是更有效的电子传递物质。
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