20世纪末以来，由于温室气体导致的全球变暖问题引起了科学家的广泛关注。氧化亚氮（N₂O）是一种重要的温室气体，不仅导致全球变暖，而且破坏平流层中的臭氧层^[1-2]。在百年尺度内，N₂O的相对增温潜势是CO₂的310倍，大气中的N₂O浓度已由工业革命前的0.27 μg·L^-1增加到了0.32 μg·L^{-1 [3]}。农业土壤N₂O排放量约占全球人为活动排放总量的60%^[4]。因此，减少农业源N₂O排放是一项刻不容缓的任务。

目前，大量研究报道硝化抑制剂的施用可以有效减少N₂O排放。AKIYAMA等^[5]通过荟萃分析表明硝化抑制剂施用可显著减少N₂O排放达38%。双氰胺（DCD）是最常用的一种硝化抑制剂，具有挥发性小、可降解、无毒性残留等优点。前期针对潮土的研究发现，DCD通过抑制氮肥施用后NO₂^--N的大量累积来减少N₂O的排放^[6]。硝化作用和反硝化作用是土壤N₂O的主要产生过程^[7]。NO₂^--N不仅是硝化和反硝化过程的中间产物^[8]，同时也是化学反硝化、硝化细菌反硝化和异养反硝化的底物^[9]。在华北平原典型玉米-小麦轮作的潮土中，氮肥施用后N₂O主要通过硝化作用产生^[10]。前期通过高压灭菌试验证明了化学反硝化对潮土中N₂O排放的贡献仅为1.1%^[6]。HUANG等^[11]的研究发现氨氧化过程是石灰性潮土中N₂O产生的引擎。硝化过程产生N₂O包括的氨氧化和硝化细菌反硝化两个途径，均由氨氧化细菌完成^[9]。前人的研究结果表明，硝化抑制剂减少N₂O排放的主要机制是其抑制了亚硝化单胞菌属的活性，同时延迟NH₄⁺-N向NO₂^--N转化，从而减少了硝化反硝化的底物^[12-13]。DCD在抑制氨氧化细菌活性的同时，是否会间接影响NO₂^--N相关的生物转化过程，从而影响N₂O的排放还未可知。

为此，本文选取典型旱地潮土作为研究对象，采用室内好氧培养方法，分别以氯化铵（NH₄Cl）和亚硝酸钠（NaNO₂）作为NH₄⁺-N和NO₂^--N的氮源，研究DCD对NH₄⁺-N和NO₂^--N转化过程中N₂O排放和无机氮含量的影响；同时设置不同NO₂^--N添加量，模拟NO₂^--N累积对土壤CO₂和N₂O排放的影响，深化对DCD减少农田土壤N₂O排放机理的认识，以期为硝化抑制剂的推广应用提供重要的理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试土壤

供试土壤采自河南省封丘县中国科学院封丘农业生态试验站（35°00′ N，114°24′ E）的旱地土壤，土壤类型为黄河冲积物发育而成的砂质潮土，采样深度为0~20 cm。土样采集后于室温下风干，压碎过2 mm筛，剔除微小根系，于室温下保存。土壤的基本理化性质见表 1。

1.2 试验设计 1.2.1 DCD对NH₄⁺-N和NO₂^--N转化过程的影响

试验设置5个处理：CK为不施肥对照处理；NH₄⁺-N+ DCD为添加NH₄Cl和DCD处理；NH₄⁺-N为添加NH₄Cl处理；NO₂^--N+DCD为添加NaNO₂和DCD处理；NO₂^--N为添加NaNO₂处理。每个处理采气组设4次重复，采土组设3次重复。

称取相当于20 g烘干土的风干土于250 mL三角瓶中，加入蒸馏水调节土壤水分含量至最大持水量（WHC）的40%，盖上封口膜，于30 ℃恒温培养箱中预培养一周，以激活土壤微生物。预培养后，不同形态氮肥和DCD均以溶液的形式加入到土壤中，加入量为2 mL，其中含氮量均为100 mg·kg^-1（以干土计），DCD的用量为施氮量的4%。同时加入蒸馏水调节水分含量至65% WHC，盖上封口膜，扎3个小孔保证通气，继续于30 ℃恒温培养箱中培养30 d，每隔2~3 d称质量补充一次水分。

气体样品于培养后的2 h和1、2、3、5、7、10、15、22、30 d采集。每次采集气样前先去掉三角瓶的封口膜，盖紧硅橡胶塞，于固定装置上抽真空1 min后充入室内空气1 min，反复3次，每次2 min，使N₂O和CO₂浓度与大气浓度平衡，并采集培养瓶上部空气气体样本，作为初始气体浓度，记录采样时间。将培养样品置于30 ℃恒温培养箱中培养4 h后用连有三通阀的10 mL一次性螺口式注射器采集第二针气体，并再次记录采样时间。每次抽取气样前用注射器反复抽提瓶内气体3次以混匀气体。

土壤样品于培养后的2 h和1、2、3、5、7、30 d采集，破坏性取样，随机从各处理中取出3个培养瓶（作为3次重复），按水土比5∶1加入2 mol·L^-1 KCl溶液（已将加水量考虑在内），并于25 ℃、250 r·min^-1恒温振荡1 h，定量滤纸过滤，收集滤液于塑料瓶中，以备测定NH₄⁺-N、NO₂^--N和NO₃^--N含量。

1.2.2 NO₂^--N对土壤N₂O和CO₂排放的影响

试验设置6个NO₂^--N添加量处理：0、50、100、150、200 mg·kg^-1和250 mg·kg^-1，每个处理设4次重复。预培养后，每个处理依次加入0、2.46、4.93、7.39、9.86、12.32 g·L^-1的NaNO₂溶液2 mL，用移液枪逐滴加入，使其尽可能均匀地分布于土壤。继续于30 ℃恒温培养箱中培养14 d，每隔3~4 d称质量补充水分。分别在加入NO₂^--N后的2 h和1、3、5、7、10、14 d采集气体样品。培养结束后，三角瓶中土壤浸提后测定土壤浸提液中NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N含量和pH值。气体采集和土壤浸提的方法同上。

1.3 分析测定方法

土壤pH值（水土比2.5∶1）采用pH计（Sartorius，PB-10）测定。土壤全氮、全碳含量采用元素分析仪（Vario MAX）测定。土壤质地采用激光粒度仪（Beckman Coulter）测定。土壤浸提液中的NH₄⁺-N、NO₂^--N和NO₃^--N含量采用全自动间断化学分析仪（Smartchem 200S/N1104238，WESTCO，France）测定。气体样品中N₂O和CO₂浓度用带电子捕获（ECD）和氢火焰离子化（FID）检测器的气相色谱（安捷伦7890A）测定。

1.4 数据处理

N₂O和CO₂排放通量根据密闭4 h前后三角瓶内N₂O和CO₂浓度差值计算。计算公式为：

(1)

式中：F为N₂O-N或CO₂的排放速率，μg·kg^-1·h^-1或mg·kg^-1·h^-1；dc/dt为单位时间内培养瓶内N₂O-N或CO₂浓度增加量，μg·L^-1·h^-1或mg·L^-1·h^-1；V_m为气体的摩尔体积，22.4 L·mol^-1；M为N₂O中N或CO₂的摩尔质量，28 g·mol^-1或44 g·mol^-1；V为培养瓶中气体的有效空间体积，L；T为培养时的温度，℃；m为培养瓶中烘干土质量，kg。

培养期间N₂O和CO₂累积排放量为前后2次采样测定的排放通量平均值与时间间隔乘积的累加，计算公式为：

(2)

式中：S为N₂O-N或CO₂累积排放量，μg·kg^-1或mg·kg^-1；F为N₂O-N或CO₂的排放速率，μg·kg^-1·h^-1或mg·kg^-1·h^-1；t为培养后的天数，d；i为采样次数。

净硝化速率（Net nitrification rate）为单位培养天数内的净硝化量，计算公式为：

(3)

式中：N_t为净硝化速率，mg·kg^-1·d^-1；[NO₃^-]为土壤中NO₃^--N含量，mg·kg^-1；t为培养时间，d；t₀为培养初始时间，d。

试验所得的数据采用Excel整理计算，数据结果采用SPSS 16.0软件进行方差分析（One-way ANOVA）及多重比较，采用LSD法进行差异显著性检验（α = 0.05），用Origin 9.0制图。

2 结果与分析 2.1 DCD对NH₄⁺-N和NO₂^--N转化过程中N₂O排放和无机氮含量的影响

同对照处理相比，无论是否添加DCD，施用NH₄⁺-N和NO₂^--N处理均显著提高了N₂O排放通量（P < 0.05，图 1a）。施用NO₂^--N的处理中，N₂O排放通量均在培养初期最大，然后随着培养时间的延长逐渐降低。添加DCD处理中N₂O排放通量最大值为1.60 μg·kg^-1·h^-1，而不添加DCD处理中的最大值为1.33 μg·kg^-1·h^-1，但是整个培养过程中两处理间的N₂O总排放量差异不显著（P > 0.05，表 2）。施用NH₄⁺-N处理的土壤中N₂O排放通量在培养的第2 d达到排放峰值，其中只加NH₄⁺-N处理的N₂O排放峰值为0.88 μg·kg^-1·h^-1，是同时添加DCD处理的2.29倍。与只施NH₄⁺-N处理相比，同时添加DCD的处理可以显著减少培养期间N₂O累积排放量，其排放量约为施NH₄⁺-N处理的41.5%（表 2）。

添加NO₂^--N的土壤中NH₄⁺-N含量并没有增加的趋势，随着培养时间的延长基本没有变化，并且与对照处理相比没有显著差异。但是，随着硝化作用的进行，添加NH₄⁺-N处理中的NH₄⁺-N含量则逐渐下降，其中添加DCD后，NH₄⁺-N含量的下降幅度变慢（图 1b）。各处理中NO₂^--N含量的变化趋势与N₂O排放通量变化呈现一致性（图 1c）。添加NO₂^--N处理中的NO₂^--N含量随着培养时间延长逐渐降低，添加DCD对NO₂^--N含量变化没有显著影响。而在只施用NH₄⁺-N处理中，NO₂^--N含量在培养后的第3 d达到峰值，为21.85 mg·kg^-1，添加DCD的处理中没有观测到明显的NO₂^--N峰值。在培养初期，各处理中NO₃^--N含量均随着培养时间的延长逐渐增加，在培养的第7 d达到各自的峰值。其中，同时添加NH₄⁺-N和DCD的处理中，NO₃^--N含量显著低于其他各处理，比仅施NH₄⁺-N处理中少约51 mg·kg^-1（图 1d）。

培养7 d和30 d后土壤净硝化速率如图 2所示。培养后第7 d，NH₄⁺-N+DCD处理中土壤净硝化速率极显著低于NH₄⁺-N处理（P < 0.01），而NO₂^--N+DCD处理中土壤净硝化速率显著高于NO₂^--N处理（P < 0.05），NH₄⁺-N处理与NO₂^--N处理之间差异不显著。培养30 d后，DCD添加对于NH₄⁺-N和NO₂^--N处理的净硝化速率影响均不显著（P > 0.05），但是施用NH₄⁺-N+DCD处理中的净硝化速率显著低于NO₂^--N和NO₂^--N+DCD处理（P < 0.05）。

2.2 不同NO₂^--N添加量对土壤N₂O和CO₂排放的影响

在不添加NO₂^--N的处理中，土壤N₂O排放通量随培养时间几乎没有变化，而添加NO₂^--N的处理中，N₂O排放通量均在培养后的2 h达到最大值（图 3a）。在培养前7 d，土壤N₂O排放通量在NO₂^--N施用量100 mg·kg^-1以下时随培养时间的延长而逐渐下降，但是当施用量为150 mg·kg^-1时，培养后的第1 d和第3 d N₂O排放通量差异不显著，高于150 mg·kg^-1时，第3 d N₂O排放通量显著高于第1 d，并且施用250 mg·kg^-1 NO₂^--N处理下第3 d的N₂O排放通量与第1 d之间的差异极显著（P < 0.01）。但从培养后3 d起，不同NO₂^--N处理的N₂O排放通量开始逐渐下降，在培养第3 d时，50 mg·kg^-1 NO₂^--N处理N₂O排放通量同对照处理差异不显著，培养第5 d时，100、150 mg·kg^-1 NO₂^--N处理N₂O排放通量同对照处理差异不显著，培养第7 d时所有处理间差异均不显著（图 3a）。

同不添加NO₂^--N处理相比，添加NO₂^--N显著增加了土壤中N₂O累积排放量，且随NO₂^--N添加量的增加而增加，其中250 mg·kg^-1 NO₂^--N处理中N₂O累积排放量最大，达到230.07 μg·kg^-1（表 3）。

不同培养时间CO₂排放通量见图 3b，在培养2 h时，添加NO₂^--N的处理同不添加处理相比差异不显著。但培养1 d后，添加NO₂^--N的处理CO₂排放通量显著高于不添加处理。培养5 d后250 mg·kg^-1 NO₂^--N处理的CO₂排放通量显著低于其他处理（P < 0.05），培养第5~10 d，添加NO₂^--N处理的CO₂排放通量显著低于不添加处理（P < 0.05）。但在培养结束时，不同处理间差异不显著。

从整个培养期间CO₂累积排放量来看，施用50、100、150 mg·kg^-1 NO₂^--N处理下CO₂累积排放量同不添加处理差异不显著（表 3），但是施用200、250 mg·kg^-1 NO₂^--N处理显著降低了CO₂排放量，较不添加处理分别减少了13.23%和26.41%（表 3）。

2.3 不同NO₂^--N添加量对土壤无机氮及全氮含量的影响

不同添加量的NO₂^--N对好氧培养14 d后土壤无机氮含量的影响见图 4。培养结束后，250 mg·kg^-1 NO₂^--N处理下NH₄⁺-N含量显著高于其他处理，但其他处理间差异不显著（图 4a）。土壤中NO₂^--N的残留量很低，低于0.2 mg·kg^-1，不同NO₂^--N处理之间差异不显著（图 4b）。NO₃^--N含量在不同NO₂^--N处理间差异极显著（P < 0.01），随NO₂^--N添加量的增加而逐渐增加（图 4c）。除了添加100、250 mg·kg^-1 NO₂^--N土壤浸提液的pH值显著高于不添加处理外，其他处理与不添加处理差异均不显著（图 4d）。

3 讨论 3.1 NO₂^--N产生N₂O的途径

添加外源NO₂^--N显著增加了N₂O的排放，而且在培养2 h时N₂O排放通量最高，N₂O排放量与NO₂^--N含量之间呈现极显著的正相关关系（r=0.96，P < 0.01），这与前人的研究结果一致^[14]。硝化细菌反硝化、异养反硝化以及化学反硝化都能产生N₂O，作为这些过程的反应底物，NO₂^--N添加促进了土壤N₂O排放的增加。在本研究中，硝化细菌反硝化很可能是NO₂^--N产生N₂O的主要途径，原因如下：一是有研究指出^[15]亚硝酸盐不稳定，容易分解，但NO₂^--N只有在酸性条件下才会通过化学反硝化等途径损失，在本研究中同土壤原pH值相比，添加NO₂^--N培养14 d后的土壤pH并没有降低，仍保持在碱性范围内（7.46~7.59），因此在本土壤中NO₂^--N通过化学反硝化途径损失的可能性较小。前期研究发现灭菌处理的N₂O排放约占非灭菌处理的1.1%，进一步说明化学反硝化的贡献量可以忽略；二是在土壤中添加不同量NO₂^--N后，在培养结束时NO₂^--N转化为NO₃^--N的比例达到106%~113%（图 4），这部分多出的NO₃^--N可能是通过土壤的矿化作用产生的，因为在不加氮的对照土壤中，培养结束时NO₃^--N含量达到39.36 mg·kg^-1，外来氮的加入还能够激发土壤矿化作用，从而使土壤中的全氮含量大于添加的NO₂^--N量。土壤中残留的NO₂^--N很少而NO₃^--N大量累积，并且与NO₂^--N的添加量呈现极显著的正相关关系（r=0.999 7，P < 0.01），说明该土壤反硝化作用较弱，可能与土壤含碳量较低有关^[16]，因此，NO₂^--N通过异养反硝化途径产生N₂O的可能性也比较小；三是250 mg·kg^-1 NO₂^--N处理中的NH₄⁺-N含量显著高于其他处理，这部分NH₄⁺-N可能来源于硝酸盐异化还原成铵的途径，但是NH₄⁺-N含量仅有2.71 mg·kg^-1，说明即使本途径存在，对N₂O的贡献也很小；四是DCD显著降低了NH₄⁺-N的硝化速率而对NO₂^--N没有影响（图 2），说明硝化作用对N₂O排放的贡献远大于反硝化作用；五是本试验是在好氧条件下进行的，土层较薄（< 1 cm）且均匀分布在250 mL的三角瓶底部，而且水分含量设置在65% WHC，有利于硝化作用的进行。氨氧化过程中产生的NO₂^--N在自养硝化细菌作用下进一步还原为N₂O和N₂的过程即为硝化细菌反硝化，在本研究土壤中添加外源NO₂^--N产生的大量N₂O很有可能是硝化细菌反硝化占主导，未来的研究中需要使用直接测定的方法，进一步明确硝化反硝化的贡献。

3.2 DCD对NO₂^--N产生N₂O的影响

NH₄Cl施用于土壤后，随着硝化作用的不断进行，NH₄⁺-N含量逐渐下降（P < 0.01），而硝化反应过程的中间产物（NO₂^--N）在土壤中不断积累。这可能与高铵、高pH值条件有利于NO₂^--N累积有关^[6]。施用DCD后，在培养初期，NO₂^--N排放通量的峰值显著低于NH₄⁺-N处理（图 1a），同SHEN等^[17]的研究结果相一致。在本研究中，培养后第7 d，DCD仅降低了施用NH₄⁺-N土壤中的净硝化速率，而对施用NO₂^--N土壤没有影响（图 2），说明DCD对硝化反应的第一步有抑制作用^[18]，从而推迟了NH₄⁺-N向NO₂^--N的氧化，使得土壤中的氮以NH₄⁺-N形式存在，促进了NH₄⁺-N的累积。虽然高铵有利于NO₂^--N的积累，但由于参与硝化反应的底物NH₄⁺-N减少，致使产生的NO₂^--N减少。施用于土壤中的铵态氮肥，除作物吸收和损失以外，最终都应被硝化和反硝化。培养30 d后，NH₄⁺-N+DCD处理中土壤净硝化速率与NH₄⁺-N处理没有显著差异（图 2），说明DCD施入土壤后会被逐步降解，这与前人的研究结果一致^[19]。在培养后期，不同处理间NO₃^--N含量差异不显著，均达到相对稳定的最大值，而且NH₄⁺-N也降到最低，说明土壤中的NH₄⁺-N最终都转化为NO₃^--N，但NO₂^--N的产生量在培养后期并没有显著增加，原因可能是随着硝化反应的进行，NH₄⁺-N不断消耗，高NH₄⁺-N对NO₂^--N向NO₃^--N转化的抑制作用逐渐下降甚至消失，生成的NO₂^--N很快转化为NO₃^--N。

前人研究发现高浓度NO₂^--N对微生物有毒害作用^[15]，CO₂排放速率通常用来表征土壤微生物活性，本研究发现CO₂排放量与NO₂^--N含量之间存在显著的负相关关系（r=-0.84，P < 0.05），当NO₂^--N添加量高于200 mg·kg^-1时，CO₂累积排放量显著低于不添加处理，说明NO₂^--N对微生物活性的抑制作用有临界值。目前世界上施用的全部氮肥中，铵态氮肥和酰胺态氮肥数量占90%以上，施用DCD有效避免了NO₂^--N的积累，不仅可以减少N₂O排放，还能缓解NO₂^--N引发的毒害作用。但是DCD对NO₂^--N处理中N₂O减排效果不显著，而硝化细菌反硝化在NO₂^--N产生N₂O的过程中扮演着重要角色，因此亟需研发能够同时抑制氨氧化和硝化细菌反硝化过程的产品，从而更大程度地减少石灰性土壤N₂O排放，并改善高浓度NO₂^--N对土壤微生物活性及植物的毒害作用。

4 结论

（1）短期好氧培养条件下添加外源NO₂^--N明显促进了N₂O排放，而且NO₂^--N施用量与N₂O排放量呈显著正相关。硝化细菌反硝化很可能是NO₂^--N添加下N₂O产生的主要途径。

（2）双氰胺通过抑制氨氧化过程避免NO₂^--N累积，减少硝化细菌反硝化的底物，从而在减少N₂O排放的同时避免高浓度NO₂^--N产生的毒害作用，但对NO₂^--N产生N₂O没有影响，因此亟待研发适于抑制NO₂^--N产生N₂O的新产品。