2021, Vol. 40
2. 海南大学海洋学院, 海口 570228
2. College of Oceanology, Hainan University, Haikou 570228, China
敌草快是广泛应用的联吡啶类季铵盐除草剂，世界卫生组织按照农药毒性分级标准，将其列为中等毒性农药[1]。已有研究表明，敌草快对人类和其他哺乳动物可造成肝、肾、肺等器官损伤，并且可能导致帕金森病[2-6]。敌草快具有良好的水溶性，在农田施用后会随地表和地下径流进入水体[7]，对水生生物的健康与安全产生不可避免的风险[7-9]。目前，相关研究报道仍然较少，而且缺少对水生生物的毒性效应及作用机制研究[10]。
农药对环境与生物的污染已经引起了我国政府的高度重视，《化学农药环境安全评价试验准则》专门针对化学农药对于水体中鱼类的毒性风险评估作出了统一规范。斑马鱼（Brachydanio rerio）具有发育快、繁殖周期短、易培养和方便操作等优点，因此常用作化学农药环境安全评价的鱼类模式生物[11]。敌草快对生物的毒性是由活性氧（ROS）引起的氧化应激，肝、肾是哺乳动物被损害的主要脏器[1]。肝脏作为鱼类重要的代谢器官，具有解毒、免疫等的生理功能，是药物毒性反应的主要靶器官之一；鳃是鱼类呼吸的重要器官，也是水体中污染物首先攻击的靶器官[12]。本研究以斑马鱼为试验材料，研究敌草快对斑马鱼的鳃和肝脏组织的损伤作用，并通过测定肝脏超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）的活性，以及丙二醛（MDA）和甘油三酯（TG）含量评估敌草快对斑马鱼肝脏的损害作用，旨在揭示敌草快对环境生物尤其是鱼类的毒性作用机制，为今后深入研究敌草快的水生生态毒理效应以及环境生物对敌草快的解毒机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物挑选健康、成熟、平均体长为（3.5±0.5）cm的斑马鱼，水温（25±2）℃，pH为6.8~7.8，溶解氧 > 6 mg·L-1，室内驯养1周。
1.1.2 主要试剂200 g·L-1敌草快水剂，购于山东三农生物科技有限公司；SOD测试盒、GST测试盒、MDA测试盒、TG测试盒购于南京建成生物工程研究所；总蛋白定量测试盒购于上海碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 急性毒性和暴露试验根据预试验，确定在敌草快中暴露96 h的最高LC0为3 mg·L-1，24 h最低LC100为40 mg·L-1。按等对数间距法，设定各组的敌草快浓度分别为39.09、20.58、10.83、5.17、3.00 mg·L-1，并设置空白对照组，每组3个重复，随机选取10尾斑马鱼放入3 L试验用液中。采用静态试验法，试验前24 h停止喂食，试验期间禁食，记录各试验组中斑马鱼的临床症状以及死亡情况，并及时捞出死鱼。统计24、48、72 h和96 h的斑马鱼存活数量，利用Probit模型计算得到半致死浓度（LC50）和安全质量浓度（SC）。以96 h LC50的1/2、1/4、1/10设置敌草快处理组，同时设置空白对照组，每组10尾斑马鱼，方法同上。96 h后从每组存活的斑马鱼中随机取3尾，解剖收集鳃、肝脏组织。
1.2.2 慢性暴露试验分别以96 h LC50的1/10、1/20、1/50作为敌草快暴露浓度，并设置空白对照，各组养殖30尾斑马鱼作为试验鱼放入20 L试验用液中，采用半静态试验法，每24 h更换1/3的试验用液，试验期间每日喂食两次，投食总质量不超过鱼体总质量的3%。分别在7、14 d和28 d取8尾斑马鱼的肝脏组织，漂洗后用滤纸拭干，按鱼组织质量（g）：生理盐水（mL）为1∶9加入预冷的生理盐水进行匀浆，在4 ℃、2 500 r·min-1条件下离心10 min，取上清液备用。
1.2.3 组织切片与观察组织块用4% 多聚甲醛固定48 h，经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，用石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，树脂封片，显微镜观察、拍照。
1.2.4 肝脏酶学和生化指标检测采用上海碧云天生物的BCA蛋白浓度试剂盒测定总蛋白含量。SOD、MDA、GST、TG的测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，WST-1法测定SOD活性，比色法测定GST活性，TBA法测定MDA含量，GPO-PAP法测定TG的含量。
1.2.5 数据统计分析所得数据用Excel 2007处理作图，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）。
2 结果与分析 2.1 敌草快对斑马鱼的急性毒性暴露于39.09、20.58 mg·L-1敌草快中的斑马鱼最初出现无规则快速游动，随后部分试鱼长时间浮于水表面，口舒张，鳃部扩张、体色变深，随着处理时间的延长，鱼体出现失衡、侧翻游动，最终丧失游动能力；暴露于10.83、5.17 mg·L-1敌草快中的斑马鱼最初出现快速泳动现象，后期未出现其他明显症状；暴露于3.00 mg·L-1敌草快中的斑马鱼在处理过程中未出现明显的不良症状。中毒死亡个体体色发暗、胸鳍张开、鳃丝暗红、体表有黏液。利用SPSS 19.0软件中的Probit模型统计得到敌草快对斑马鱼24、48、72、96 h的LC50分别为27.85、21.36、17.95、16.92 mg·L-1，敌草快安全质量浓度为1.69 mg·L-1（SC=96 h LC50×0.1）。
2.2 敌草快对斑马鱼鳃和肝脏的形态损伤斑马鱼暴露于8.46、4.23 mg·L-1和1.69 mg·L-1浓度敌草快中96 h后，分别取空白对照组和各处理组斑马鱼的鳃和肝脏组织进行切片分析。
鳃组织切片观察结果显示（图 1、表 1）：空白对照组斑马鱼鳃的组织结构完整，呼吸上皮细胞排列整齐、规则，紧贴在鳃小片表面（图 1A）；在1.69 mg·L-1的敌草快溶液中暴露96 h后，斑马鱼鳃组织中的鳃小片呼吸上皮细胞发生水肿浮离，排列不规则，并且出现部分脱落（图 1B）；在4.23 mg·L-1的敌草快中暴露后，鳃小片上皮细胞肿胀、大量脱落或黏滞于鳃小片间，鳃小片末端膨大，损伤加重（图 1C）；8.46 mg·L-1的敌草快暴露则造成了鳃小片卷曲、萎缩，鳃丝组织细胞解离、空泡化，基部细胞增生，呼吸上皮与毛细血管分离严重，形成空腔（图 1D）。
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SL: 鳃小片；REC: 呼吸上皮细胞；ES: 上皮细胞肿胀；BP：基部增生。 SL: Secondary gill lamella; REC: Respiratory epithelial cells; ES: Epithelial swell; BP: Basal proliferation 图 1 敌草快对斑马鱼鳃组织结构的影响（400倍） Figure 1 Effect of diquat on the histopathology of zebrafish gills(400 times) |
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表 1 急性敌草快胁迫对斑马鱼鳃组织结构的影响 Table 1 Acute effect of diquat exposure on histopathology of gill in zebrafish |
肝组织切片观察结果显示（图 2、表 2）：空白对照组斑马鱼肝细胞分布均匀，连接紧密呈网状，细胞结构完整，细胞边界清晰，细胞核圆且位于中央（图 2A）；当斑马鱼暴露在1.69 mg·L-1敌草快水溶液中96 h后，肝脏部分细胞核偏移，细胞肿大，出现空泡（图 2B）；暴露在4.23 mg·L-1敌草快中的斑马鱼其肝细胞肿胀，部分肝细胞破裂，细胞轮廓不清晰，核仁模糊或解体（图 2C）；暴露在8.46 mg·L-1的敌草快96 h后，斑马鱼肝脏组织结构紊乱，肝细胞严重变形，出现大量无核肝细胞，炎性反应明显，伴有细胞坏死、溶解现象（图 2D）。
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*：空泡；NEC：坏死 *: Vacuolation; NEC: Necrosis 图 2 敌草快对斑马鱼肝脏组织结构的影响（400倍） Figure 2 Effect of diquat on the histopathology of zebrafish liver (400 times) |
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表 2 急性敌草快胁迫对斑马鱼肝组织结构的影响 Table 2 Acute effect of diquat exposure on histopathology of liver in zebrafish |
斑马鱼在1.69、0.84、0.34 mg·L-1的敌草快中暴露后，各处理组肝脏的SOD活性呈现降-升-降的趋势（图 3）。暴露7 d，各处理组斑马鱼肝脏的SOD活性降低，且随敌草快浓度的增大，活性下降更明显，其中浓度为0.84 mg·L-1和1.69 mg·L-1处理组与空白对照组存在极显著差异（P < 0.01）；暴露14 d，各处理组斑马鱼肝脏的SOD活性升高，其中浓度为0.34 mg·L-1和0.84 mg·L-1处理组的SOD活性与空白对照组相比存在显著差异（P < 0.05），浓度为1.69 mg·L-1处理组与空白对照组存在极显著差异（P < 0.01）；暴露28 d时，各处理组斑马鱼肝脏的SOD活性下降，与空白对照组之间均无显著差异（P > 0.05）。
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处理组与对照组之间存在显著差异（P < 0.05）和极显著差异（P < 0.01）分别用*和**表示。下同 Significant differences between zebrafish exposed to diquat and their control counterpart are denoted with *(P < 0.05)or ** (P < 0.01). The same below 图 3 敌草快对斑马鱼肝脏SOD活性的影响 Figure 3 Effects of diquat on the activities of SOD in the liver of zebrafish |
敌草快对斑马鱼肝脏的GST活性影响如图 4所示。在敌草快28 d的持续暴露过程中，浓度为0.84 mg·L-1和1.69 mg·L-1处理组斑马鱼肝脏的GST活性在第7 d出现增强，7~28 d的暴露过程中活性持续降低；暴露28 d后，浓度为0.84 mg·L-1处理组斑马鱼肝脏GST活性显著低于空白对照组（P < 0.05），浓度为1.69 mg·L-1处理组极显著低于空白对照组（P < 0.01）。浓度为0.34 mg·L-1处理组斑马鱼肝脏的GST在暴露过程中活性变化不显著（P > 0.05）。
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图 4 敌草快对斑马鱼肝脏GST活性的影响 Figure 4 Effects of diquat on the activities of GST in the liver of zebrafish |
敌草快对斑马鱼肝脏MDA含量影响如图 5所示。暴露7 d，各处理组斑马鱼肝脏MDA含量与空白对照组相比无明显变化；暴露14 d，各处理组斑马鱼肝脏MDA含量均受到敌草快暴露的轻微诱导，但与空白对照组无显著性差异（P > 0.05）；暴露28 d，浓度为0.84 mg·L-1和1.69 mg·L-1的处理组MDA含量与空白对照组相比极显著升高（P < 0.01）。
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图 5 敌草快对斑马鱼肝脏MDA含量的影响 Figure 5 Effects of diquat on the contents of MDA in the liver of zebrafish |
敌草快对斑马鱼肝脏TG含量的影响见图 6。暴露7 d，各处理组斑马鱼肝脏TG未表现出明显的改变，暴露14 d，各处理组斑马鱼肝脏TG与空白对照组相比均出现上升，浓度为0.34 mg·L-1和0.84 mg·L-1的处理组与空白对照组之间有显著性差异（P < 0.05），暴露28 d，各处理组斑马鱼肝脏TG含量仍高于对照组，浓度为0.84 mg·L-1和1.69 mg·L-1的处理组显著大于空白对照组（P < 0.05），浓度为0.34 mg·L-1的处理组与空白对照组差异不显著（P > 0.05）。
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图 6 敌草快对斑马鱼肝脏TG含量的影响 Figure 6 Effects of diquat on the contents of TG in the liver of zebrafish |
半致死浓度通常可以反映物质的毒性程度，常被作为急性毒性试验的重要检测指标[13]。本研究的结果发现敌草快对斑马鱼96 h LC50为16.92 mg·L-1，与成云峰等[14]的研究结果基本一致（96 h LC50=17.5 mg· L-1）。根据化学物质对鱼类急性毒性分级标准[13]，敌草快对斑马鱼的毒性分级属于中等毒性。敌草快对鱼类的急性毒性较高，毒性的差异与鱼类的种类、所处发育阶段、代谢能力有密切关系，斑马鱼对敌草快的耐受力略高于肖龙等[10]报道的中华鳑鲏鱼（Rhodeus sinensis Günther）对敌草快的耐受力。
3.2 敌草快对斑马鱼鳃和肝组织结构的急性损伤作用急性损伤试验可以为敌草快胁迫的应激反应评估提供依据，选择的敌草快最高剂量浓度为96 h LC50的1/2，在试验过程中2尾斑马鱼死亡，该浓度的敌草快可以对斑马鱼造成明显的毒性作用；最低剂量浓度为急性毒性试验得到的安全浓度1.69 mg·L-1[15-16]，该浓度接近敌草快的田间施用浓度[17]。
鳃是鱼类进行气体交换的器官，在排氨和参与渗透压调节、维持离子稳态中有重要作用，其组织结构易遭受水环境中污染物的破坏[18]。有研究表明，轻度的呼吸上皮水肿和细胞增生在不破坏鳃正常功能的情况下，可以阻挡外界污染物进入内部组织，避免造成进一步的损伤[18]。本研究发现：低浓度的敌草快处理，斑马鱼鳃小片呼吸上皮出现水肿浮离、细胞增生，表明低浓度条件下，会诱导斑马鱼出现应激防御反应；随着敌草快浓度的增加，斑马鱼鳃组织结构损伤加重，鳃小片呼吸上皮细胞出现坏死、脱落、毛细血管扩张、破裂、空泡化和空腔等严重的损伤现象，与百草枯对大盖巨脂鲤（Colossoma macropomum）和蓝线鳍鱼（Trichogaster trichopterus）鳃组织的损伤结果相一致[19-20]。作为百草枯的同类除草剂，敌草快进入呼吸上皮细胞和毛细血管壁细胞，在细胞内诱导产生大量的活性氧自由基，导致产生防御反应，阻碍鳃细胞的正常气体交换，随着浓度的增加，防御平衡被打破，组织结构被破坏，严重影响鳃的正常生理功能，引起鱼类死亡。
对哺乳动物的研究表明，百草枯主要导致肺损伤和肺组织纤维化，而敌草快主要损害的脏器是肝和肾，其肝脏代谢产物的毒性进一步增强[1, 21]。肝脏是鱼类解毒的主要器官，鱼类在污染的水体中肝脏组织会发生结构和生理变化[22]。已有研究发现，有毒物质会引起鱼类肝细胞线粒体肿胀，活性氧自由基增加，导致脂质过氧化，破坏细胞膜系统的结构和功能，使细胞出现空泡化[23]。本研究中，短时间暴露在低浓度敌草快中的斑马鱼肝细胞出现肿大和空泡化，表明敌草快诱导肝脏产生了氧化应激，肝功能可能受到了影响；当敌草快浓度增加时，肝脏组织损伤更明显，空泡化严重、细胞界限模糊，并引起肝细胞溶解，说明细胞膜系统遭受了破坏，肝功能已经受到了影响，肝组织细胞变形、核仁消失的现象也是细胞坏死的先兆；最终当敌草快达到一定浓度时，肝细胞出现明显的坏死现象，使肝脏失去正常功能，导致鱼类死亡[18]。
3.3 敌草快对斑马鱼肝脏的慢性损害肝脏是脊椎动物体内最大的腺体，对糖类代谢、脂类代谢、解毒等生命活动起着非常重要的作用。鱼类的肝脏和哺乳动物肝脏一样，是鱼类物质代谢以及解毒的重要场所。由于鱼类自身栖息的环境相对其他动物更为独特，环境水体中有毒有害物质更容易使肝脏遭受损伤，从而影响其正常的生理与代谢功能。随着人类生产生活中除草剂的普遍使用，越来越多的研究证明除草剂类有毒物质已经严重威胁到环境生物尤其是水生鱼类的健康与安全，且对鱼类的肝脏产生直接毒害作用。肝细胞SOD和GST的活性以及MDA和TG的含量，是评估肝脏在有毒环境条件下受损伤程度的重要指标[24-25]。为了研究长期接触敌草快对斑马鱼肝脏的损害作用，本研究选择96 h LC50的1/10、1/20和1/50作为暴露浓度，考察了以上指标的变化，敌草快最低剂量浓度为0.34 mg·L-1，相当于农田中喷洒敌草快后的环境浓度[17]。
氧化应激是敌草快对人类和其他哺乳动物肝脏功能损伤与毒性作用的基础，敌草快通过诱导细胞发生氧化应激反应引起肝细胞抗氧化酶活力的改变，损伤程度取决于暴露时间和浓度[26]。已有研究报道，敌草快可诱导斑马鱼胚胎氧化应激产生过量的超氧阴离子等活性氧自由基[21]。当体内活性氧自由基超过抗氧化体系的清除能力时，会对肝脏细胞产生毒性作用，影响抗氧化酶活性。SOD具有清除超氧阴离子能力，是维持机体内活性氧动态平衡的重要抗氧化酶，其活力直接反映了机体清除氧自由基的能力[27]。本研究发现，敌草快处理14 d时，肝细胞中SOD活性增加，表明低浓度的超氧阴离子会诱导该酶的活性，但随着体内超氧阴离子的积累，并达到肝组织损伤的阈值时，会破坏肝脏的抗氧化防御系统。因此，敌草快处理28 d时，该酶的活性出现下降，表明肝脏抗氧化系统的功能受到了影响。
GST具有抗氧化酶和Ⅱ相代谢酶的双重功能，催化还原性谷胱甘肽与内源性和外源性亲电子化学物反应，不仅可以与其他抗氧化酶在细胞内共同起到缓解氧化应激的作用，而且可以帮助细胞解毒[28]。另外，当肝细胞受损害时，GST易于通过肝细胞膜而被释放到血液中，是检测肝脏受损的敏感性指标[29]。在高浓度敌草快处理初期，斑马鱼肝组织中GST活性被诱导，可能是该酶表现出的应激反应，以帮助机体缓解敌草快的毒性作用。Sanchez等[30]的研究表明，222 μg·L-1和444 μg·L-1的敌草快诱导也同样使三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）肝脏中GST的活性增加。随着细胞内活性氧和有毒物质的累积，GST的活性出现下降，并随时间延长持续降低，提示敌草快长期胁迫造成了肝脏氧化还原失衡、解毒能力降低，并且肝细胞可能受到了损害。
MDA是体内脂质过氧化作用的标志性产物，也被认为是自由基诱导生物膜脂质过氧化反应的直接产物，其含量的变化可间接反映生物受自由基攻击后膜系统的氧化损伤程度[31]。暴露在联苯菊酯、甲氰菊酯等农药中的鱼类，其肝脏组织中MDA含量显著增加[32-33]。本研究发现，敌草快处理28 d时，斑马鱼肝细胞中MDA含量极显著增加。表明敌草快引起斑马鱼肝细胞内自由基增多，肝脂质过氧化水平升高，这可能是造成细胞膜通透性改变、细胞轮廓模糊的原因之一。
肝是机体TG代谢的主要器官，与脂肪组织共同调控能量代谢。一些有毒物质造成动物肝损伤，引发氧化应激反应，导致脂质代谢异常和肝细胞内TG增加[22, 34]。本研究发现，暴露在较高浓度敌草快中的斑马鱼肝脏中的TG含量上升，斑马鱼肝脏脂质代谢受到影响。敌草快暴露造成斑马鱼肝脏细胞的空泡化，活性氧自由基增加导致脂质过氧化破坏细胞膜是细胞空泡化产生的原因之一，另外空泡形成往往与糖脂代谢紊乱有关，TG在肝脏细胞内沉积，也会形成可以观察到的空泡[25-26]。
4 结论（1）急性敌草快胁迫可导致斑马鱼鳃和肝脏组织产生病理学改变，剂量越大，损伤越严重。
（2）长期敌草快刺激使斑马鱼肝脏氧化还原状态受到破坏，发生脂质过氧化，肝脏Ⅱ相代谢酶——谷胱甘肽-S转移酶的活性降低，并且使肝脏脂质代谢出现障碍。
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