2021, Vol. 40
土壤重金属污染具有隐蔽性、持久性和不可逆性等特点，是关乎生态环境安全和人类健康的全球性问题[1]。20世纪80年代以来，我国农田土壤重金属污染不断加剧[2]，根据原环境保护部和原国土资源部2014年联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》，我国耕地土壤点位超标率为19.4%，主要污染物为Cd、Ni、Cu、As、Hg、Pb等[3]。其中，矿山开采和有色金属冶炼、电镀和电子废物拆解等工业活动，均被认为是农田土壤Cd、Cu、Pb和Zn等重金属的重要来源，这些重金属可对生物体产生毒性，对土壤环境质量、人群健康和生态系统安全造成重大影响[4-5]。
目前，常用的土壤污染修复技术有物理修复、化学修复和生物修复等[6]，对于轻中度污染土壤，施用钝化剂降低重金属有效性是有效的修复措施[7]。现有钝化剂主要包括矿物材料(如石灰石、蒙脱石)、含磷材料(磷灰石、钙镁磷肥)、有机物料(有机肥、生物炭) 等，其机理主要为沉淀、吸附和螯合[8]。石灰石和蒙脱石作为两种常规的天然矿物材料，具有容易获取、成本低廉和施加简便等优点，对其已有较多的研究和应用[9]。例如，陈炳睿等[10]研究发现，石灰石能够有效降低土壤中交换态Pb、Cd的含量，并且明显减少土壤中Pb、Cd的毒性浸出量。将蒙脱石按5%(质量比)添加至受重金属污染的土壤中，能够有效降低土壤中Cd、Cu、Pb、Zn的弱酸提取态含量，且蒙脱石钝化效果整体优于生物炭[9]。尽管石灰石和蒙脱石对重金属具有较好的稳定效果，但其作用机理并不相同。同时，现有的研究主要关注材料施加对土壤重金属有效性和作物重金属吸收量的影响[11-12]，极少关注材料施加后土壤环境健康的变化。当前，在国家“土十条”的推动下，各地深入实施受污染耕地的安全利用，大范围的钝化材料施加将对农田土壤生态系统产生较高的潜在风险。
土壤微生物因直接参与土壤物质循环和能量流动，具有维持动植物生长和净化环境污染等生态系统功能，因而反映了土壤生态系统的健康状况[13]。与植物相比，土壤微生物和酶活性对土壤重金属污染的反应更为灵敏，通常作为重金属污染土壤评价的敏感指标[14]。本研究拟通过高通量测序技术，以土壤酶活性、微生物多样性和群落结构作为指标，评价石灰石和蒙脱石两种不同钝化机理的材料对土壤健康的恢复程度，旨在为重金属污染农田土壤的可持续修复及其效果评估方法的确定提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试土壤样品采自清远市电子废物拆解区农田耕作土，其为重金属污染酸性水稻土，土壤pH 4.93，全氮2.76 g·kg-1，全磷0.48 g·kg-1，有机质35.20 g· kg-1，Cd 0.93 mg · kg-1，Cu 310.26 mg · kg-1，Pb 250.56 mg·kg-1，Zn 576.73 mg·kg-1。采集表层0~20 cm土壤样品，自然风干，过4 mm尼龙筛，保存备用。
采用的钝化剂为石灰石(广州艺峰矿业科技有限公司)和蒙脱石(信阳信和矿业有限公司)，供试材料的基本理化性质见表 1。
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表 1 供试材料的基本性质 Table 1 Basic properties of materials used in the present study |
供试水稻品种为粤农丝苗。
1.2 试验设计试验设3个处理，分别为对照(CK，不施加钝化剂)、0.6% 石灰石(LS)和0.6% 蒙脱石(MM)，每个处理设5次重复，石灰石和蒙脱石按照质量比添加至土壤中。盆栽所用的花盆外口直径约30 cm，底部直径约20 cm，高度约23 cm。水稻幼苗移栽前1周，每盆装土4.0 kg，按照添加量为0.6%的比例将钝化剂与土壤混匀，加入底肥(3.0 g尿素、1.5 g NH4H2PO4和3.0 g K2SO4)，加水淹过土面4~5 cm。水稻育苗完成后(约20 d)，挑选健康且长势一致的水稻幼苗移植到花盆中，每盆2穴，每穴1株，水稻全生育期土面上保持4~ 5 cm的水层。
1.3 样品采集及测试方法 1.3.1 样品采集方法植物样品收获方法：水稻成熟后(约3个月)，采集茎叶和根系，依次用自来水和去离子水清洗，自然晾干水分，分别称量茎叶和根系的鲜质量，然后放入烘箱中105 ℃杀青30 min，并在70 ℃下烘干至恒质量，分别称量茎叶和根系的干质量，粉碎、研磨后待测。
土壤样品采集方法：水稻收获的同时收集根际附近4~5 cm的土壤，将其装入20 mL离心管中，于-20 ℃冰箱保存，用于测定土壤微生物指标。以四分法取约500 g土壤，去除植物根系和残体，风干后分别过10、20、60目筛，保存待测。
1.3.2 土壤性质分析方法土壤、植物样品分析方法：土壤pH和电导率(EC)按照土水比1∶2.5采用电位法测定；土壤阳离子交换量(CEC)采用乙酸铵交换法测定；土壤有机质(SOM)采用重铬酸钾容量法测定；土壤有效磷(AP) 采用0.50 mol·L-1 NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定[15]；土壤过氧化氢酶活性的测定采用KMnO4滴定法(μmol·g-1，以每克土KMnO4计)，脲酶活性的测定采用靛酚蓝比色法[16](mmol·g-1，以每克土NH3-N计)；土壤有效态Cd、Cu、Pb、Zn含量采用0.01 mol·L-1 CaCl2以1∶5的土水比浸提，土壤样品用盐酸-硝酸-氢氟酸进行消解，水稻植物样品采用硝酸-高氯酸消解，浸提液和消解液中的Cd、Cu、Pb、Zn含量采用原子吸收分光光度法测定(PE-PinAAcle 900 T)。样品分析过程中加入国家标准物质土壤(GBW07430)和菠菜(GBW10015)进行质控，全程做空白试验和加标回收，重金属检测过程加标回收率分别控制在Cd 77%~ 105%、Cu 92%~110%、Pb 80%~106%、Zn 86%~111%。
土壤微生物测定：基于16S rRNA高通量测序技术，利用双末端测序的方法，构建小片段文库进行测序。通过对Reads拼接过滤，OTUs聚类，并进行物种注释及丰度分析，揭示样品的物种构成；并进一步进行多样性分析和显著物种差异分析。
1.4 数据分析方法生物富集系数(Biological concentration factor，BCF)[17]：
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转运系数(Translocation factor，TF)[17]：
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试验数据初步分析均采用Microsoft Excel 2013进行，试验数据均采用5次重复的平均值±标准偏差表示，采用SPSS 23进行数据统计分析，采用Canoco 5 Tutorial及Microsoft Excel 2013作图。
2 结果与分析 2.1 钝化剂对土壤理化性质的影响水稻收获后，根际土壤的基本理化性质见表 2。可以看出，与CK相比，LS和MM处理均可显著提高土壤pH(P＜0.05)，且LS的增幅更为明显，达2.16个单位；两种处理CEC均无显著变化，但LS可使土壤AP含量显著增加(P＜0.05)，AN和SOM含量显著降低(P＜0.05)，而MM对土壤AP和AN含量影响较小。
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表 2 不同处理对土壤理化性质的影响 Table 2 Effects of different treatments on the physical and chemical properties of soil |
根际土壤重金属的有效态含量如图 1所示。可以看出，与CK相比，LS处理显著降低了土壤重金属有效态Zn、Cd、Cu、Pb含量(P＜0.05)，降低幅度依次为99.1%、91.4%、85.6%、46.1%；而MM处理Cd、Cu、Pb、Zn有效态含量均无显著变化，但有效态Pb含量降低幅度达到了19.5%。
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不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)。下同 Different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P < 0.05). The same below 图 1 不同处理对土壤重金属有效态含量的影响 Figure 1 Effects of different treatments on the availabilities of heavy metals in soils |
水稻收获后，根际土壤过氧化氢酶和脲酶活性的结果如图 2所示。结果发现，土壤样品中添加石灰石可显著提高过氧化氢酶和脲酶活性(P＜0.05)，两种酶的活性均较CK提高1.6倍；同时，MM处理也可显著提高过氧化氢酶的活性(P＜0.05)，为CK的1.4倍，但脲酶活性提高不显著(P>0.05)。
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图 2 不同处理对土壤酶活性的影响 Figure 2 Effects of different treatments on the activities of urease and catalase in soils |
水稻成熟后，通过测定水稻地上部分(茎叶)和地下部分(根系)的重金属含量，计算出水稻的BCF和TF，如表 3所示。与CK相比，LS处理显著降低了水稻茎叶、根系Cd和Zn的BCF(P＜0.05)，降幅分别为85.5%(茎叶Cd)、62.6%(根系Cd)、61.9%(茎叶Zn)、43.4%(根系Zn)，LS处理根系Pb的BCF有所降低，但未达到显著水平；MM处理水稻茎叶、根系中的重金属BCF均无显著变化(P>0.05)。与CK相比，LS处理Cd和Zn的TF显著降低(P＜0.05)，降幅分别为62.5% 和30.0%；MM处理的各种重金属TF均无显著变化(P>0.05)。
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表 3 不同处理下水稻各部位的生物富集系数(BCF)和转运系数(TF) Table 3 Biological concentration factors(BCF)and translocation factors(TF)of rice under different treatments |
不同处理下土壤微生物的OTUs数和群落多样性指数的变化情况见表 4。通过16S rRNA基因MiSeq测序，3组处理15个样本共获得1 772 148条序列，各群落的序列数在90 872至159 204之间。各处理高通量测序覆盖率均大于99%，说明本次测序结果样本中物种被检测出的覆盖率高。与蒙脱石相比，施加石灰石更明显增加了土壤微生物群落的多样性，其中，LS处理的Shannon指数增加了2.23%，而MM处理的Shannon指数下降了3.85%；从微生物群落丰富度看，LS处理组的ACE和Chao1指数分别增加了2.16% 和2.12%，微生物多样性增加显著(P＜0.05)，而MM处理组的这两种指数与CK组无显著差异。
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表 4 不同处理土壤微生物多样性指数变化 Table 4 Changes of microbial community diversity indices in soils under different treatments |
土壤微生物门的相对丰度结果显示(图 3)，3个处理样品微生物归属22个门，其中8个门的相对丰度>1%。丰度由高到低的顺序分别为变形菌门(Proteobacteria，19.12%~37.76%)、绿弯菌门(Chloroflexi，10.80%~43.15%)、放线菌门(Actinobacteria，7.37%~ 17.40%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，4.50%~ 21.41%)、酸杆菌门(Acidobacteria，3.44%~12.95%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，1.89%~19.95%)、蓝藻细菌门(Cyanobacteria，0.76%~8.71%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，1.33%~2.89%)。施加钝化剂后，LS处理变形菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、蓝藻细菌门相对丰度均明显增加，而绿弯菌门、放线菌门、酸杆菌门相对丰度均显著降低，疣微菌门相对丰度略有降低；MM处理绿弯菌门、变形菌门、蓝藻细菌门、疣微菌门相对丰度均略有增加，放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门相对丰度均略有降低。
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图 3 不同处理对土壤微生物群落门水平结构的影响 Figure 3 Effects of different treatments on the soil microbial community structure at phylum level |
在土壤微生物属水平，不同钝化处理下的微生物群落结构发生了明显变化(图 4，选择丰度变化>0.5% 的28种属进行分析)。其中，LS处理土壤中相对丰度较大的优势微生物属有f_Gemmatimonadaceae、f_BIrii41、Gerbera_hybrid_cultivar和c_KD4-96。CK、MM处理与LS处理不同，两者土壤中优势微生物属相近，包括f_JG30-KF-AS9、o_Acidobacteriales、c_KD4- 96、o_Gaiellales。
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图 4 不同处理对土壤微生物群落属水平结构的影响 Figure 4 Effects of different treatments on the soil microbial community structure at genus level |
通过RDA进一步揭示微生物群落结构的影响机制，结果见图 5。两个坐标轴共解释了微生物群落和土壤理化因子总方差的90.7%，其中横向坐标轴解释86.5%，纵向坐标轴解释4.2%，能较好地反映土壤理化性质对土壤微生物群落结构的影响。经不同钝化剂处理过的土壤明显分布于不同的坐标轴，LS处理位于RD1轴的右边，其AP含量、pH和EC含量较高，有效态重金属含量较低。CK和MM处理则位于RD1轴的左边，有效态重金属浓度含量较高。蒙特卡罗检验结果表明，对土壤微生物群落结构影响最大的环境因子为pH、AP和SOM含量(P＜0.05)。
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图 5 土壤微生物群落与理化性质及有效态重金属含量的RDA分析 Figure 5 RDA of chemical properties and availabilities of heavy metals on the microbial community structure in soils |
由图 5可知，优势微生物属如溶杆菌属(Lysobacter)、Polycyclovorans、Phycicoccus、Dongia、OM27_ clade等与AP、pH、EC含量呈正相关，与有效态重金属含量呈负相关；生孢噬纤维菌属(Sporocytophaga)、uncultured_bacterium_f_JG30-KF-AS9、uncultured_ bacterium_c_AD3、uncultured_bacterium_o_Saccharimonadales等与AP、pH、EC含量呈负相关，与有效态重金属含量呈正相关。
3 讨论 3.1 钝化剂对重金属生物有效性和植物吸收的影响分析水稻收获后根际土壤的理化性质，发现石灰石和蒙脱石两种材料对土壤理化性质产生了不同影响，两种处理均显著增高了土壤pH(表 2)，但LS处理对提高土壤pH的效果明显优于MM，这可能是由于石灰石本身具有较高的pH(pH 11.21)。因此，与蒙脱石相比，相同用量下石灰石对提高土壤pH的效果更显著。LS处理可使土壤AP含量显著增加，但使AN和SOM含量显著降低，这与谭川疆等[18]的研究结果一致，其主要原因可能是供试土壤为赤红壤，其中的磷主要为闭蓄态磷，施用石灰石能够减弱土壤对磷的固定作用，促使闭蓄态磷的释放，从而提高有效磷含量[19]；AN含量显著降低则可能是因为施加石灰石后，土壤pH提高，微生物活性增加，从而加速了对铵态氮的分解，这与前人的研究结果一致[20]。此外，施加石灰石可以改善微生物活动条件，加快含碳有机质转化，促进有机质分解，从而降低了SOM含量[21]。
土壤中重金属的有效态是能被植物直接吸收利用的形态，它决定于土壤中重金属的全量及其活性。研究水稻收获后根际土壤中重金属的有效态含量发现，LS处理可使土壤Cd、Cu、Pb、Zn有效态含量显著降低，这与LS处理显著增高了土壤pH，使重金属形成氢氧化物，促使有效态含量降低有关[22-23]。此外，有研究表明，施用石灰石可使土壤中弱酸提取态Cd、Zn向土壤可氧化态、可还原态及残渣态Cd、Zn转化，这降低了土壤中Cd、Zn的有效性[24]。而MM处理有效态Cd、Cu、Pb、Zn的含量与CK相比均无显著变化，说明在对Cd、Pb等重金属的稳定化中，通过提高土壤pH的沉淀作用可能比通过表面羟基位交换的吸附作用更为有效。
比较研究LS和MM两种处理下水稻茎叶、根系重金属的BCF以及TF发现，LS处理水稻茎叶、根系Cd和Zn的BCF以及Cd、Zn的TF均显著下降，表明随着土壤中重金属有效态含量的下降，石灰石还有效抑制了水稻各部位对Cd、Zn的吸收，这与董海霞等[25]的研究结果一致。本研究受试土壤呈酸性(pH 4.93)，石灰石的施用使土壤pH显著提高，这增加了土壤表面电荷，从而增加了对Cd2+的吸附量，降低了Cd的可迁移性[26]。此外，水稻根系向地上部运输重金属，还受向地上部运输的转运蛋白作用的影响[27]，如OsNRAMP1和OsNRAMP5蛋白参与水稻根系向地上部分转运Cd的过程，影响Cd2+从根部向茎部的运输[28-29]。因此，施加石灰石调控土壤pH，可能进而影响了转运蛋白的作用，从而导致水稻根系、茎叶对不同重金属元素具有不同的转运能力。
3.2 钝化剂对土壤酶活性的影响土壤酶活性与土壤重金属的污染程度具有明显的相关性。土壤生物指标的改善是评价土壤重金属修复成功与否的关键[30-31]。土壤酶为土壤生物化学过程的直接参与者，对土壤理化性质等环境因素的变化响应敏感[32]。脲酶是土壤氮循环的重要成分，而过氧化氢酶可促进过氧化氢的分解，从而防止过氧化氢对生物体的毒害作用[33]，因此常用土壤酶活性来表征土壤修复效果[34]。本研究结果表明，添加石灰石和蒙脱石对土壤中过氧化氢酶和脲酶活性均有显著影响，其中LS处理显著提高了过氧化氢酶和脲酶活性。通过皮尔逊相关性分析可知，过氧化氢酶与pH(r=0.729，P＜0.01)、EC(r=0.606，P＜0.05)、AP(r=0.594，P＜0.05)呈显著正相关，与AN(r=-0.668，P＜0.01)、SOM(r=-0.666，P＜0.01)、Cd(r=-0.628，P＜0.05)、Cu(r=-0.708，P＜0.01)、Pb(r=-0.588，P＜0.05)、Zn(r=-0.709，P＜0.01)呈显著负相关。说明石灰石的添加有效降低了土壤中重金属的生物有效性，改善了土壤微生物的生境，从而提高了酶活性，这与前人的研究结果一致[35-36]。脲酶与土壤理化因子相关性较过氧化氢酶小，但也与pH、EC和AP呈显著正相关(P＜0.05)，与SOM、Cu和Zn呈显著负相关(P＜0.05)。由此可知，土壤重金属有效性和pH、AP等理化因子是影响土壤酶活性的关键因素。
3.3 钝化剂对土壤微生物多样性与群落结构的影响土壤修复不仅要关注土壤重金属有效性的降低，更要关注土壤环境健康的变化。微生物对土壤重金属污染具有极强的敏感性，可以作为土壤环境质量的预测与评估指标。本研究利用高通量测序技术对各处理土壤中的微生物多样性进行了深入研究，结果表明，LS处理对微生物多样性有显著影响，施用石灰石的土壤表现出较高的微生物多样性，包括OTUs、ACE、Chao1和Shannon。这一结果说明石灰石会引起微生物群落结构和多样性的变化，施用石灰石能丰富土壤不同功能菌群，提高土壤功能。
在门水平，对照土壤中微生物群落组成最丰富的依次是变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloro⁃ flexi)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gem⁃ matimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)，这与其他受重金属污染土壤的研究结果相似，上述微生物均为优势菌群[37-38]。进一步的分类结果表明，在属水平，不同处理之间微生物群落结构发生了明显变化，f_Gemmatimonadaceae、f_BIrii41、Gerbera_hybrid_cultivar和c_KD4-96在LS处理土壤中检出丰度最高。已有的研究表明，微生物群落结构能够反映土壤环境因子的变化[39]，这主要受土壤污染物水平与土壤理化性质的共同影响[40]。f_Gemmatimonadaceae被认为是一种有益菌属，对磷酸盐分解、微生物氮代谢和土壤呼吸作用至关重要[41]；f_BIrii41菌属在其他的研究中也被发现为特定土壤的优势菌属[42-43]；c_KD4-96则被发现与土壤中总磷呈正相关关系[39]，其对磷的溶解释放具有促进作用，是各类型土壤中的主要微生物种群[38, 44]；Gerbera_hybrid_cultivar由于缺乏纯培养研究，目前其在受重金属污染土壤中的作用尚不明确。
与石灰石相比，MM与CK处理中土壤有益菌属f_Gemmatimonadaceae、f_BIrii41丰度较低，这两种菌属在LS处理土壤中的丰度分别是CK处理的6倍和18倍，这进一步表明石灰石的施加能够显著促进部分土壤有益菌群的生长，改善土壤环境健康状况。
3.4 土壤理化性质与微生物群落结构的关系RDA分析结果表明，土壤理化性质对土壤微生物群落结构影响较大，其中pH、AP和SOM是最重要的影响因素。在之前的多个研究中均得出pH是影响微生物群落关键因素的结论，这主要由于pH能够影响多种环境因素，包括土壤重金属形态、营养物质及酶活性[45-47]。通过RDA结果还发现，土壤pH和某些特定微生物相对丰度存在正相关关系，如Ramlibacter、Dongia和Gerbera_hybrid_cultivar，其中Ramli⁃ bacter、Dongia为特定类型土壤中的优势微生物属[46, 48]。有研究发现，在一定的pH变化范围内，优势微生物群落在土壤生态系统中具有较强的稳定性，这种结构的稳定性说明有可能通过调控稳定的优势微生物群落来实现稻田土壤的功能调节[49]。与此相反，微生物c_AD3、o_Saccharimonadales、o_Acidobacteriales、o_Gaiellales以及Occallatibacter、Jatrophihabitans等与pH呈显著负相关，说明pH对这些微生物有抑制作用。有研究表明，AP、SOM与稻田土壤微生物群落存在显著相关性，是影响土壤微生物群落结构和功能多样性的关键因素[50-51]，这与本研究结果一致。本研究土壤中添加石灰石后，土壤理化指标AP、AN、SOM和EC发生显著变化，微生物群落结构较CK组和MM组也发生显著变化，与本研究结果不同的是，有研究表明添加石灰石虽提高了土壤pH，但对土壤化学性质和微生物群落没有显著影响[52]，这可能与石灰石的添加量及土壤本身的种类和性质有关。
对于重金属污染酸性土壤，石灰石施加可以提高土壤养分循环能力，从而改善土壤养分状况，提高土壤微生物生物量、微生物多样性和活性[8, 53]。本研究同样发现，石灰石的添加提高了土壤pH、AP和EC，并显著降低了土壤中重金属Cd、Cu、Pb、Zn的有效性，最终提高了土壤微生物多样性和酶活性。本研究表明，针对酸性的重金属污染农田土壤，基于土壤环境健康，通过提高土壤pH的沉淀作用开展土壤修复，比通过离子交换、吸附等作用更为有效。本研究结果可为我国尤其是华南地区科学开展重金属污染农田的治理修复提供技术支撑。
4 结论(1) 施加石灰石显著降低了土壤Zn、Cd、Cu、Pb有效性，降低幅度依次为99.1%、91.4%、85.6%、46.1%；添加蒙脱石降低了土壤Pb有效性，降低幅度为19.5%；和蒙脱石处理相比，石灰石处理降低了水稻茎叶、根系各种重金属的生物富集系数和根到茎叶中的转运系数，说明石灰石对土壤重金属的修复效果优于蒙脱石。
(2) 施加石灰石显著提高了土壤过氧化氢酶和脲酶活性，土壤pH、EC和AP等理化因子以及土壤Cd、Pb等重金属是影响土壤酶活性的关键因素。
(3) 施加石灰石可更有效地增加土壤微生物多样性，提升土壤有益菌群丰度，从而改善土壤环境功能，其中pH、有效磷和有机质含量是影响微生物群落结构的关键因素。
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