随着畜禽养殖业的发展，集约化养殖模式逐渐取代了传统养殖模式^[1]。畜禽养过程中，动物自身、粪便以及垫料携带的微生物易于气溶胶化，进而逸散至气中形成生物气溶胶^[2]。生物气溶胶是具有生命的气溶胶粒子（包括细菌、菌、病毒等的微生物粒子）^[3]，在集约化养殖过程中，畜禽舍内空气中生物溶胶浓度高，且富含致病微生物，不仅威胁到动物和工作人员健康^[4]，而且通过空气长距离传播，污染周边环境^[5]。

自20世纪70年代起，人们开始对畜禽养殖过程中逸散的生物气溶胶展开研究^{[6, 7]}。结果显示，畜禽舍内空气中可培养细菌气溶胶浓度高达10⁵ cfu·m^-3[8]近些年，研究人员开始利用分子生物学手段对畜禽舍内空气微生物进行分析发现生物气溶胶的群落结构受到畜禽种类、养殖阶段和养殖方式等多种因素响^{[1, 9, 10, 11]}。在不同养殖方式下，空气中生物气溶胶的不同群落结构可导致殖工人患病种类的差异^[11]。因此，掌握畜禽舍内空气微生物的浓度和菌群构将有助于深入理解生物气溶胶对从业人员和畜禽健康的影响。然而，目前内对该方面研究少有报道。

本研究对集约化养鸡场舍内空气中细菌气溶胶进行研究，分析笼养和网上养殖种典型养殖方式下，禽舍内细菌气溶胶的浓度以及群落结构，以期为集约化场空气环境中生物气溶胶的健康风险评估提供基础数据。

本研究在北京市怀柔和平谷两个区进行。对肉鸡（采样8次）和蛋鸡（采样7次养殖场舍内细菌气溶胶进行采集，其中蛋鸡采用笼养，肉鸡采用网上养殖。时对相应的采集时间、养殖密度、鸡龄、舍内温度和湿度等信息进行记录，体见表 1，其中A和B代表 2个蛋鸡场，C、D、E和F代表 4个肉鸡场。

表 1 鸡场中细菌气溶胶采样信息 Table 1 Sampling information of airborne bacteria in poultry houses

表选项

可培养细菌气溶胶采样时间为早上10：00—11：00之间，避开清粪作业和捡蛋料等作业。采集使用六级撞击式采样器（JWL 6，北京）。该仪器将空气中的菌粒子按其空气动力学直径大小分别捕获在各级培养皿上：（Stage Ⅵ）.65~1.1 μm，（Stage Ⅴ）1.1~2.1 μm，（Stage Ⅳ）2.1~3.3 μm，Stage Ⅲ）3.3~4.7 μm，（Stage Ⅱ）4.7~7.0 μm和（Stage Ⅰ）>7.0 μ。采样高度为1.5 m，样品采集时间为2 min，气体流量为28.3 L·min^-1。每采样前用流量计（余姚）对采样泵的流量进行校准，每个采样点重复取样3次空气温度和相对湿度用温湿度计检测（WD-35612，OAKTON，Germany）。

培养皿采用9 cm平皿，灭菌后在无菌条件下加入20 mL培养基。细菌采用牛肉膏白胨培养基，30 ℃培养箱内培养2 d。采集的样品在进行菌落计数时，采用ositive hole method 方法对菌落数进行校正。

根据采样时间和气体流量，利用下式计算各级空气带菌粒子的数量：

总细菌气溶胶的采集使用TSP采样器（2030，青岛，崂应），将生物气溶胶中的生物过滤到直径为90 mm的滤膜（MUNKTELL，Germany）上。流量为100 L·h^-1，从早上10：00开始采集，采样时间为48 h，达到采样时间后，将吸附生物溶胶的滤膜保存在-80 ℃冰箱中，以备后续分析。

采用试剂盒（MO-BIO PowerSoil® DNA Isolation Kit）对滤膜表面的细菌气溶进行DNA提取。之后对细菌16S rRNA保守区的PCR扩增，引物为341F和534R（GC夹），扩增体系为50 μL。PCR反应程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 40 s，55 1 min，72 ℃ 2 min，循环30次；72 ℃ 10 min。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）采用8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度35%~70%，上量为25 μL。电泳条件：1×TAE缓冲液，100 V电泳10 h。电泳结束后，使用UPER GreenⅠ染色30 min，用Bio-Rad公司成像仪采集图像，用Quantity One oftware（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图像进行采集。

切胶回收目标条带，进行PCR扩增（引物341F和534R），产物进行纯化（欧米伽2561-02，美国）之后连接至载体pMD18-T。经蓝白筛选后，将阳性转化子送至科希林公司测序，再经NCBI数据库比对测序结果。

Shannon指数计算参照已报道文献^[12]，戴斯系数（Dice coefficient）用uantity One Software（Bio-Rad，USA）软件计算。

利用SPSS 21.0计算描述性统计参数，当P值小于0.05时，表明在95%的置信区间具有统计学意义上的显著差异。

本研究采集了笼养（蛋鸡）和网上养殖（肉鸡）舍内的细菌气溶胶样本，经培和计数，得出空气中可培养细菌浓度，结果如图 1所示。

图 1 笼养和网上养殖鸡舍内可培养细菌气溶胶浓度 Figure 1 Concentration of culturable airborne bacteria in layer and broiler houses

图选项

由图 1可知，本研究所调查鸡舍内最高和最低浓度的细菌气溶胶分别在蛋鸡（A5和肉鸡（C2）舍内检出，分别为1.3×10⁵、1.9×10³ cfu·m^-3。同时，结果示采用笼养的蛋鸡舍内和网上养殖的肉鸡舍内细菌气溶胶的平均浓度分别为.8×10⁴、3.7×10⁴ cfu·m^-3。笼养鸡舍内细菌气溶胶浓度高于网上养殖舍内度（P＜0.01）。

除浓度之外，群落结构是描述细菌气溶胶特点的另一个重要参数。本研究利用GGE对笼养和网上养殖鸡舍内细菌气溶胶生物群落结构差异进行检测。对饲养件较相近的2个蛋鸡舍（A5、A6、B1、B2）和4个肉鸡舍（C1、C2、C3、C4、DE、F）样本进行分析，其变性梯度凝胶电泳结果如图 2所示。

图 2 笼养和网上养殖鸡舍内细菌气溶胶生物群落DGGE图谱 Figure 2 Denatured gradient gel electrophoresis（DGGE） profiles of airborne bacteria in layer and broiler houses

图选项

由图 2可知，蛋鸡和肉鸡舍内空气微生物中细菌群落结构相似，但优势菌存在差。整体上，蛋鸡舍内细菌气溶胶的生物多样性较肉鸡舍内丰富。为验证以上论，对笼养和网养舍内细菌气溶胶的Shannon指数进行对比分析。Shannon指是描述生物群落结构复杂程度的参数，其数值大小与生物多样性相关，结果图 3所示。

图 3 笼养和网上养殖鸡舍内细菌气溶胶生物群落 Shannon指数分析 Figure 3 Shannon index of airborne bacteria in layer and broiler houses

图选项

由图 3可知，笼养和网上养殖舍内空气中生物群落结构复杂程度不同，最高和最Shannon指数分别在蛋鸡B舍和肉鸡F舍内检测到，蛋鸡舍内空气中细菌的hannon指数高于肉鸡舍内。同时，本研究利用戴斯系数（Dice coefficient）算各样品群落结构之间的相似比值，进一步对不同养殖方式下鸡舍内细菌气胶的群落结构相似度进行分析，结果如表 2所示。

表 2 笼养和网上养殖鸡舍内细菌气溶胶生物群落相似性矩阵 Table 2 Similarity of airborne bacteria in layers and broiler houses using Dice coefficients

表选项

由表 2可知，蛋鸡舍内细菌气溶胶群落结构相似度在26.3%~55.4%之间，4个肉鸡内（C4、D、E和F）空气样本之间的相似度在47.7%~71.1%之间，平均值为8.7%；4个肉鸡舍（C4、D、E、F）与2个蛋鸡舍（A5、A6、B1、B2）的相似率9.0%~67.2%之间，平均相似度为41.8%。

对蛋鸡和肉鸡舍内细菌气溶胶中的优势条带进行测序分析，基因序列结果通过CBI数据库进行比对，得到14个条带的最相似菌属结果如表 3所示。

表 3 笼养和网上养殖鸡舍内细菌气溶胶优势菌属 Table 3 Predominant bacteria in layer and broiler houses

表选项

由表 3可知，所调查的鸡舍内空气细菌主要有三类：拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。在所检测的优菌属中，包括类芽孢杆菌属、泛菌属、库特氏菌属，黄杆菌属、肠杆菌属、希氏菌属、柠檬酸杆菌属、假单胞杆菌属、产醋杆菌属和不动杆菌属。

在所进行的15次调查中，鸡舍内细菌气溶胶的浓度范围在1.9×10³~1.3×10⁵ fu·m^-3，与魏磊等^[13] 对潍坊市鸡舍内细菌气溶胶浓度的检测结果相近，略于莱芜市蛋鸡舍内浓度^[14]。值得注意的是，检测结果中有10次超出我国《禽场环境质量标准》的限值（2.5×10⁴ cfu·m^-3）。鸡舍内部细菌气溶胶的度受到多种因素影响^{[3, 15]}，如养殖密度、家禽日龄、消毒手段及清粪周期，而本文研究的肉鸡和蛋鸡所采用的消毒手段和清粪周期存在差异。蛋鸡的毒方式是带鸡作业，该方式很难彻底去除空气微生物；肉鸡则是待鸡出栏后空鸡舍进行清理和消毒，确保了空气微生物的有效去除。此外，粪便作为舍生物气溶胶的主要来源，可能对空气细菌产生影响^[16]。所调查蛋鸡舍内清周期较短，机械扰动作用加速了粪便中微生物气溶胶化，导致空气中微生物度较高。

由DGGE图谱（图 2）可知，同一生产类群、同种养殖方式下不同鸡舍空气中的群结构存在差异，如采用笼养的A和B，即使在鸡龄相似条件下仍然可以观察到同鸡舍内空气细菌的群落结构差异（A6和B1）。在所调查的4个肉鸡场（网养的空气细菌群落结构中，也观察到不同鸡舍之间群落结构存在差异的现象C4、D、E、F）。对比分析同一鸡舍不同鸡龄条件下DGGE图谱（A5和A6；B1和2；C1、C2、C3和C4），发现随着鸡龄的增长，空气中细菌气溶胶多样性呈现少的趋势（除C4之外）。

在同一个鸡舍内，随着鸡龄的增加，Shannon指数减小（除了C4之外）。这与GGE图谱观察结果一致。对比分析图 1和图 2，本研究并没有发现细菌气溶胶浓和生物多样性之间的相关性。由戴斯系数分析结果可知，相同养殖类型鸡舍间，群落结构的相似度要高于不同养殖类型之间，如肉鸡舍内空气中细菌气胶群落结构之间的相似率要高于肉鸡和蛋鸡之间的相似率（P＜0.05）。对不鸡龄肉鸡舍内细菌气溶胶群落结构相似度分析，发现C2、C3、C4与C1的相似逐渐由82.2%降低到62.0%，说明随着鸡龄的增加，空气中细菌气溶胶的群落构与原有结构的差异逐渐增大。目前国内关于鸡舍细菌气溶胶群落结构方面研究还未见报道。国外学者对笼养和网上养殖鸡舍空气中细菌气溶胶进行研，同样发现两种养殖方式下细菌气溶胶群落结构存在较大差异，其相似性小30%^[11]。

所调查的鸡舍内空气细菌主要有三类：拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。这与Hong等^[10] 对美国养鸡调查结果相似。本研究所检测到的优势菌中，包括埃希氏菌属、泛菌属以及单胞杆菌属中某些人类条件致病菌种。国外学者也在集约化畜禽养殖环境检到泛菌属^[17]和假单胞菌^[18]。

蛋鸡和肉鸡舍内检测出的优势菌种类存在差异，如：条带9（Enterobacter）在鸡舍普遍存在，且亮度较高，是蛋鸡舍的优势细菌气溶胶；条带10Paenibacillus）和11（Flavobacteriaceae）只在蛋鸡舍内空气中检测到；带8 （Escherichia）在所有空气样品中虽然均有检出，但在肉鸡舍内空气中度高，为肉鸡舍内优势细菌气溶胶。同种养殖方式不同鸡舍空气中细菌气溶的优势菌属同样存在差异，如条带7（Acinetobacter）、8（Escherichia）9（Enterobacter）和10（Paenibacillus）在A6中浓度较高，而在相似鸡龄B1中各条带的亮度较低。肉鸡舍内优势细菌气溶胶种类同样有所不同（C4、DE、F），如在鸡舍E中浓度较高的条带13（Clostridium），在其他肉鸡舍内度较低或未检出。本研究在肉鸡不同鸡龄阶段，检测到优势细菌气溶胶的变，如条带9（Enterobacter）在养殖末期第34 d，浓度突然增加。粪便中微生随鸡龄的改变可能是造成该现象的主要原因。同时，舍内垃圾、饲料以及尘等附着的微生物的变化也可能导致舍内优势细菌气溶胶种类变化。

本研究结果表明，笼养舍内细菌气溶胶浓度和生物多样性均高于网上养殖；舍优势菌属在不同养殖方式、鸡龄和鸡舍间有所不同。本研究结果将为评估集化养鸡场舍内空气环境质量，以及不同养殖类型鸡舍内生物气溶胶污染控制术的建立提供基础数据。