有机质是土壤肥力的重要物质基础，其在土壤中的积累状态决定土壤养分积累和供应能力以及碳库的稳定性^[1]。通过农作物残体进入土壤的新鲜有机组分主要包括碳水化合物（纤维素、半纤维素等）、木质素、蛋白、树脂、蜡质等^[2]，各组分在土壤中的稳定性及其积累特性直接影响有机质的氧化稳定性，进而影响土壤肥力的发挥^{[3, 4, 5]}。一般来说，有机质中的木质素比其他组分更为稳定，其在土壤中的积累特征直接影响土壤有机碳的周转速度及碳库的大小^[6]。国际上一般采用木质素经氧化分解后的三类共八种分子标识物[V 类（即香草基酚类，包括香草醛、香草酮和香草酸）、S类（即紫丁香基酚类，包括丁香醛、丁香酮和丁香酸）以及C类（即肉桂基酚类，包括对香豆酸和阿魏酸）]的总和VSC来表征土壤中木质素的含量及其在土壤中的积累特性。V类和S类单体的酸醛比[（Ac/Al）V和（Ac/Al）S]指征土壤中木质素降解程度，该值越大表明木质素的降解程度越高^{[6, 7]}；S类和V类单体以及C类与V类单体的比值指征木质素在土壤中被微生物分解和利用的程度，该比值随着木质素氧化程度的降低而增大^{[7, 8, 9]}。

合理的土地利用方式和施肥措施是提高农田作物产量和土壤肥力的重要管理措施。关于施肥对土壤有机质稳定性的影响研究报道很多，基本阐明了化肥、有机肥施用在我国各种土壤类型和气候类型区的作用^{[10, 11, 12]}，但从木质素积累角度揭示农田土壤有机质的稳定性和积累状态的研究还较少。通常，土壤中的木质素具有一定的异质性^{[13, 14]}。前期研究表明，施用有机肥有利于农田中木质素的积累^{[15, 16]}，而施用化肥对农田土壤木质素的积累看法不一。意大利玉米长期定位试验结果表明，施用NP肥没有显著增加土壤中木质素的积累^[17]。也有研究发现，施用化肥（N、NP和NPK肥）利于木质素在黑土次表层（20~40 cm）中积累^[15]。红壤是我国亚热带丘陵区典型土壤类型，具有低pH、高度风化且养分有效性低下等特点，导致该区有机质变化异于其他土壤类型^{[18, 19]}。从木质素积累角度揭示不同土地利用方式下农田有机质的稳定性和积累状态的研究还较少，且伴随的农田培肥管理措施对贫瘠红壤有机碳截获与转化过程中木质素积累特性的影响尚不清楚。

本研究采用碱性氧化铜-固相萃取-气相色谱法，研究红壤区不同土地利用方式（旱地、水旱轮作地）下，两种典型施肥处理（单施化肥、秸秆还田配施化肥）土壤中木质素各单体含量及组成特征，并试图寻找影响木质素积累的关键因子，以期为解析红壤农田土壤有机碳库稳定性及其积累机制提供理论依据。

田间定位试验设在湖南省桃源县盘塘镇境内（111°31′36″E，29°13′48″N）。该区位于中亚热带北缘的红壤丘陵区，属亚热带湿润季风气候，年均温16.8 ℃，年均降雨量1230 mm，成土母质为第四纪红土，土壤肥力水平较低。根据红壤丘陵区耕地类型，选取紧邻的旱地和水旱轮作地进行田间定位试验。试验始于2000年，共设置7个处理，水旱轮作地设置5个处理。旱地和水旱轮作地土壤肥力水平均较低，代表本区的中低产田，选取旱地和水旱轮作地的两个相同施肥处理开展研究。两个处理分别为单施化肥（NPK）及稻草配施氮磷肥（S+NP，稻草的量按钾的施用量计算，不足的氮磷用化肥补齐，保证两个处理氮磷钾的总量一致），每个处理4次重复，随机排列，小区间用水泥板隔离（埋入深度≥30 cm）。旱地的种植制度为红薯-油菜，每个小区面积为23.3 m²；水旱轮作地的种植制度为玉米-水稻-绿肥（紫云英），每个小区面积为22.4 m²。磷肥全部作基肥，氮肥和钾肥70%作基肥、30%作追肥。施用的化肥品种分别为尿素、钙镁磷肥和氯化钾。

于定位试验开始前（本底，2000年）和长期施肥后（2013年）分别采集土壤样品。每个小区按“之”字采集五点并混合均匀，挑去植物残体及砾石，自然风干过筛保存用于木质素、土壤理化性质和酶活性分析。

采用鲍士旦《土壤农化分析》的方法^[20]测定土壤pH值、有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷及速效钾。

多酚氧化酶及过氧化物酶活性用邻苯三酚比色法，酶活性以3 h 后每克土壤中紫色没食子素的毫克数表示^[21]。

采用碱性氧化铜-固相萃取-气相色谱法氧化分解木质素^{[22, 23]}。气相色谱条件如下：色谱柱为HP-5毛细管柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm），载气为高纯氮气（纯度为99.999%），采用恒压模式，压力为8.589 psi（59.22 kPa）；氢气流速为30 mL·min^-1，空气流速为350 mL· min^-1。进样口温度300 ℃，进样量1 μL，采用分流进样，分流比5∶1，检测器温度300 ℃。色谱柱升温程序为：初始温度100 ℃，以8 ℃·min^-1升至140 ℃，再以4 ℃·min^-1升至170 ℃，保持5 min，最后以10 ℃·min^-1升到300 ℃，保持10 min。试验回收率为87%~95%。

以2013年施肥后的各指标为对象，土地利用方式（旱地、水旱轮作地）、施肥处理（无机肥NPK、秸秆配施无机肥S+NP）作为处理因子分别对土壤理化性质、酶活性及木质素进行双因素方差分析（Two-way ANOVA），处理间的多重比较用S-N-K法；以土壤理化性质、酶活性及木质素各单体为变量进行Pearson 相关性分析；以土壤理化性质、酶活性作为环境因子对木质素单体组成进行冗余分析。采用Excel 2010、SPSS 20.0、Origin 8.0以及Canoco 4.5完成。

与大多数研究结果相反（表 1），连续13年NPK和S+NP施肥处理均导致红壤旱地pH略有升高（P＜0.05），但水旱轮作地的NPK处理pH增加，S+NP处理则降低（P＜0.05）。长期施肥后旱地的有机质含量显著增加，增幅为（0.56±0.02）~（0.74±0.03）g·kg^-1·a^-1，水旱轮作地长期施用S+NP后有机质无显著差异，NPK则显著降低，损失幅度为（0.11±0.01）g·kg^-1·a^-1；土壤全量养分（全氮、全磷、全钾）长期施肥前后无显著差异（P＞0.05）；土壤速效养分（碱解氮、速效磷、速效钾）均在长期施肥后显著高于本底（P＜0.01），其中S+NP处理的碱解氮、速效磷显著高于NPK处理，速效钾表现为NPK处理显著高于S+NP处理（P＜0.05）。

表 1 长期施肥前后旱地和水旱轮作地土壤理化性质 Table 1 Basic physicochemical properties of red soil under different land use and long-term fertilization

表选项

同一土地利用方式下，施肥后旱地多酚氧化酶均显著低于本底，而水旱轮作地则趋势相反（P＜0.05），过氧化物酶在施肥后均呈现显著降低趋势（P＜0.05）；同一施肥处理，多酚氧化酶均表现为水旱轮作地高于旱地，过氧化物酶则为旱地高于水旱轮作地（P＜0.01）（图 1）。

图 1 长期施肥前后旱地和水旱轮作地土壤酶活性（A：多酚氧化酶；B：过氧化物酶） Figure 1 Soil enzyme activity under different land use and fertilization（A：Polyphenol oxidase; B：Peroxidase activity）

图选项

红壤旱地本底木质素含量显著高于水旱轮作地，前者为（414.46±46.59）μg·g^-1，后者为（201.56±9.13） μg·g^-1。与本底相比，长期施用NPK及S+NP均显著增加了旱地及水旱轮作地土壤中木质素含量（P＜0.05），其中S+NP处理木质素含量的增加显著高于NPK（P＜0.01），且水旱轮作地的木质素积累速率显著高于旱地（P＜0.05），具体表现如下：旱地木质素含量分别增加至（528.59±66.03）μg·g^-1和（2 092.40±43.40）μg·g^-1，比本底提高了55%和328%，积累速率分别为8.15 μg·g^-1·a^-1和119.85 μg·g^-1·a^-1，后者是前者的14倍；水旱轮作地相应增加至（448.88±21.30）μg·g^-1和（1 972.24±8.73）μg·g^-1，比本底提高了122%和869%±8%，积累速率分别为17.67μg·g^-1·a^-1和126.48 μg·g^-1·a^-1，后者是前者的7倍。旱地及水旱轮作地本底的木质素均以V类单体占优势，分别占所有单体总和的66%和57%；长期施肥显著增加了旱地及水旱轮作地木质素单体C的比例，其中C类单体在旱地NPK和S+NP处理中分别占所有单体总和的55%和63%，水旱轮作地则为42%和49%，且与V类单体间无显著差异（图 2）。

图 2 长期施肥前后旱地和水旱轮作地土壤中木质素（VSC）含量 Figure 2 Soil lignin content（VSC） under different land use and fertilization

图选项

长期施肥对旱地及水旱轮作地的木质素单体酸醛比的影响无明显规律，但总体上S类单体高于V类单体（图 3A）；木质素单体比C/V与S/V间有较好的线性相关性，R²=0.55（P＜0.05）。

图 3 土壤中木质素的降解特征（A：木质素单体酸醛比；B：木质素单体比相关性；n=24） Figure 3 Degradation characteristics of lignin in soil（A：Acid to aldehyde ratio; B：Correlationship; n=24）

图选项

双因素方差分析结果表明，土壤理化性质、酶活性及木质素各单体组成受土地利用方式及施肥措施的影响不一（表 2）。其中土地利用方式及施肥措施均显著影响木质素V、S、C单体含量（P＜0.01），二者的交互作用仅对木质素单体V及C有显著影响（P＜0.05）。

表 2 土地利用方式及施肥对各指标的双因素方差分析（n=16） Table 2 Two-way ANOVA results of land use, fertilization and their interactions on soil properties

表选项

相关性分析结果（表 3）表明，对于理化性质，土壤中木质素单体V、S、C及Sum（VSC）含量均与pH、全磷、全钾无显著相关性（P＞0.05）；V类单体与碱解氮、速效磷有显著相关性（P＜0.01）；S类单体与全氮、碱解氮、速效钾呈显著正相关关系（P＜0.05）；C类单体与有机质、全氮、碱解氮呈显著正相关关系（P＜0.01）；木质素含量Sum_(VSC)与有机质、全氮、碱解氮、速效钾呈显著正相关（P＜0.05）。对于酶活性，木质素V类单体与多酚氧化酶、C类单体与过氧化物酶均呈显著负相关关系（P＜0.05）。

表 3 土壤理化性质、酶活性与木质素的相关性分析（n=24） Table 3 Correlation coefficients between soil lignin, basic physicochemical properties and enzyme activity（n=24）

表选项

进一步冗余分析结果表明，本底及长期施肥后的NPK和S+NP处理间能较好的分开（图 4B ），表明不同驱动因素下环境响应的差异性，第一象限解释率高达71.8%；其中对土壤中木质素单体组成影响较为显著的因子（图 4A）为有机质、全氮、碱解氮（P＜0.05）、速效钾（P＜0.01）。

图 4 木质素单体组成与环境因子的冗余分析图（n=24） Figure 4 RDA ordination diagram of lignin with environmental variables（arrows）（n=24）

图选项

在本研究中，长期施用化肥及秸秆还田配施化肥均显著增加了土壤中木质素的总含量（图 2），但秸秆配施化肥比单施化肥的土壤木质素积累速率高，分析原因可能是由于不同施肥处理下木质素来源有所差异：一般农田中木质素主要来源于地上植物残体和地下植物根系，长期施用化肥主要通过作物根系输入^{[24, 25, 26, 27]}；秸秆还田配施化肥一方面以秸秆的添加为主，直接输入大量有机物质，另一方面地下根系为辅，使其土壤中木质素的增量显著高于单施化肥。另外，长期施肥显著增加了红壤中木质素C类单体的比例，其原因可能是通过农作物残体进入土壤的新鲜有机组分不同而引起的：农作物秸秆中木质素单体主要以C类为主^{[15, 23, 31]}，长期施用NPK及秸秆还田配施化肥均显著增加了农作物残体中有机化合物向土壤有机质的输入。

土地利用方式对木质素总含量无显著影响，但旱地与水旱轮作地的木质素单体含量及组成均有显著差异（表 3，图 4），说明在农田生态系统中研究土壤有机质的组分变化对碳库固持尤为重要。具体表现为水旱轮作地中C类单体的比例和绝对含量均低于旱地，V类单体的比例趋势则相反（表 1，图 2），有研究表明木质素单体稳定性V＞S＞C^{[23, 28, 29]}，说明水旱轮作地的木质素单体组成较旱地稳定。推测其原因可能是在水旱轮作条件下，季节性的干湿交替使土壤中的氧化还原反应交替进行，而旱地表层土壤则长期处于好氧条件，导致水旱轮作地和旱地中微生物种类、数量及其分泌的酶活性显著不同^{[30, 31, 32, 33]}，进而影响到土壤中木质素不同单体的降解^[34]。水旱轮作地的多酚氧化物酶活性显著高于旱地，过氧化物酶则显著低于旱地（图 1），且相关性结果表明多酚氧化酶与V类单体呈现负相关，水旱轮作地的过氧化物酶与C类单体显著负相关，最终表现为水旱轮作地与旱地在木质素单体含量及组成上的差异。

在木质素的量与组成上，土壤理化性质及酶活（多酚氧化酶、过氧化物酶）等对木质素积累的影响存在共性，总体表现为有机质、全氮、碱解氮、速效钾是影响红壤农田木质素积累的主要因子（表 3和图 4）。具体分析如下：Lobe等^[35]观测到在半干旱草原土壤中，木质素与土壤有机碳的损失速率几乎相同，作为土壤有机质的重要组分之一，木质素的量与组成对维持农田土壤有机碳库的大小和稳定性意义重大^[6]；氮素是生态环境系统中构成生命体的重要成分，长期施用化肥及秸秆配施无机肥均增加了土壤中全氮及碱解氮的含量（表 1），有研究表明有机质及氮素所带来的碳氮比的改变通过影响土壤中微生物的分解及矿化进而影响木质素的积累^{[36, 37]}；缺钾是限制南方红壤肥力提高的主要影响因素之一^[18]，速效钾受土地利用方式、施肥措施及其交互作用的影响显著（表 2），相关性分析及冗余分析均显示速效钾与木质素单体含量及组成密切相关（表 3和图 4），说明速效钾在木质素对有机碳截获与转化过程中，可能存在不容忽视的作用，但仍需通过单因素试验进行下一步验证。

本文pH值对不同土地利用方式及施肥处理下农田土壤中木质素积累无显著影响，但红壤低pH值的特性使其土壤中微生物可利用的底物和微生物群落结构与其他母质土壤差异显著^[38]，因此未来应进一步研究对木质素降解起直接作用的功能酶及关键微生物群，以深入揭示农田施肥措施对土壤有机碳截获、转化的特征与机制。

长期施用化肥及秸秆配施化肥均有利于红壤丘陵区典型旱地和水旱轮作地中木质素的积累，且同一种土地利用方式下，秸秆配施化肥比单施化肥的土壤木质素积累速率高7~14倍；尽管旱地土壤中木质素含量高于水旱轮作地，但水旱轮作地中木质素的积累速率显著高于旱地；两种施肥方式下水旱轮作地更有利于木质素的积累且其木质素稳定性高于旱地；有机质、氮素、速效钾可能是影响红壤丘陵区农田土壤木质素积累特性的关键因子，土壤氮素及钾素的有效性在中低产田土壤碳固持、有机碳水平及土壤肥力提升的调控中应被关注。