铜既是生物生长必需的营养元素，又是一种污染 元素。近几十年来，随着工农业生产的快速发展，铜的 用途越来越广泛，用量也迅速增加。铜矿的过度开采， 农业生产上含铜杀菌剂和畜牧业中含铜饲料的大量 使用及工业生产中含铜污染物的大量排放，导致农田 土壤中铜含量严重超过正常范围，铜污染已成为世界 性问题^[1]。当土壤中铜含量超过一定浓度时会产生很 高的植物毒性^[2]，影响其生长发育及产量，同时通过富 集作用累积到作物体内进入食物链对人体造成危害。 如何预防和修复土壤重金属污染已成为亟须解决的 重要问题。植物间作体系能够充分利用资源分布的 异质性，提高资源的利用效率，将其应用于土壤重金 属污染的修复，被认为是一条有效的新途径^[3]。蒋成爱 等^[4]研究表明，将东南景天与不同根系植物间作，发现 与玉米和大豆间作，可以显著提高东南景天地上部对 Zn、Pb、Cd 3种重金属的吸收。王吉秀等^[5]研究表明玉 米和不同蔬菜间套模式是抑制作物可食部分吸收累 积重金属Pb、Cu、Cd含量的有效措施。在没有重金属 胁迫的条件下，Xia 等^[6]田间试验表明，玉米和豆科作 物（蚕豆、鹰嘴豆和大豆）间作能够减少玉米籽粒中铜 元素的含量。在有重金属胁迫的条件下，玉米间作番 茄也能降低玉米地上部和根系铜含量^[7]。Jiang 等^[8]将 重金属超富集植物与低累积作物玉米间作，超富集植 物提取重金属的效率比单种超富集植物明显提高，同 时能够生产符合卫生标准的玉米产品，是一条不需要 间断农业生产、较为经济合理的治理方法。Evans等^[9] 通过将豌豆PsMTA 基因导入酵母菌及拟南芥中，发 现豌豆该基因具有抗重金属铜功能。针对江西近年来 迅猛发展的畜牧业，大量的畜禽粪污对环境的污染也 是急需解决的难题，特别是饲料中大剂量使用铜、锌 元素导致农田环境污染，破坏土壤质地和微生物结 构，甚至影响作物产量和品质^[10]。

江西玉米种植面积达2.81×10⁴ hm²，而豆类作物 （大豆和豌豆为主）种植面积达到1.59×10⁵ hm^2[11]，是 江西省旱地重要的种植作物，其中亦有部分种植面积 为玉米间作豆类作物。综合来看，通过作物间作来修 复江西红壤铜污染可能是一种合理的植物修复方法。 因此，本文以玉米和豌豆间作体系为研究对象，通过 研究不同Cu²⁺添加量对间作和单作玉米干重、铜含量 以及根和叶中抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响，以 期探讨间作模式对铜污染条件下玉米抗氧化酶系统 及质膜损伤机理的影响机制，为合理利用间作修复土 壤铜污染及合理的有机肥施用量提供一定的理论依 据。 1 材料与方法 1.1 供试材料

供试土壤采自江西农业大学农业科技园红壤试 验地表层（0~20 cm）红壤，土壤先于室内自然风干，剔 除植物根系后，过2 mm 筛备用。试验土壤基本理化 性状为：pH 3.96，有机质含量31.34 g·kg^-1，全氮1.74 g·kg^-1，碱解氮121.33 mg·kg^-1，有效磷31.68 mg·kg^-1， 速效钾163.67 mg·kg^-1，全铜含量为33.52 mg·kg^-1，有 效态铜含量为2.31 mg·kg^-1。供试作物玉米（Zea mays） 品种为中糯103，豌豆（Pisum sativum L.）品种为中豌 4号，均购于南昌市种业公司。 1.2 盆栽试验与采样

本试验设置2 种种植模式和5 种铜浓度，共10 个处理（表 1），每处理重复3 次，共30盆。盆钵高7.5 cm，盆口直径5 cm，每盆装土250 g。于7月30 日按 每千克土壤0、100、200、400、600 mg 铜离子量添加铜 溶液（CuSO₄·5H₂O，分析纯），平衡45 d。9月4日进行 玉米和豌豆育苗，9月16 日移栽，玉米每盆定植1 株；间作豌豆每盆定植2 株。自播种之日起，每3 d用 30 mL Hoagland 营养液（四水硝酸钙945 mg·L^-1，硝酸 钾506 mg·L^-1，硝酸铵80 mg·L^-1，磷酸二氢钾136 mg· L^-1，硫酸镁493 mg·L^-1，铁盐溶液2.5 mL，pH6.0，蒸馏 水）浇灌，以保证玉米和豌豆生长及土壤水分。11月5 日进行取样，取样时沿土面将玉米地上部和地下部分 离，以去离子水将玉米和豌豆植株洗净，分别称取去 除叶脉后叶片和及白根各0.2 g 用于测定抗氧化酶活 性及丙二醛含量，剩余部分称鲜重后105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干至恒重，根据折干率换算用于测定酶 活及丙二醛含量的植株样品干重。利用湿式消解法处 理植株样品，原子吸收分光光度法测定植株中的铜含 量。

表 1 铜污染盆栽实验设计 Table 1 Pot experiment design for copper pollution

表选项

分别剪取各处理玉米根系和叶片（去除叶脉）0.3 g 置于预冷的研钵中，加入50 mmol·L^-1 pH7.8 的磷酸缓 冲液5 mL（内含2%聚乙烯吡咯烷酮）研磨匀浆，4 ℃ 10 000 r·min^-1离心0.5 h，上清即为酶粗提液。 1.3.2 超氧化物歧化酶（Super oxide dismutase，SOD） 活性的测定

利用SOD 对氮蓝四唑（NBT）的光抑制作用来测 定^[12]。在试管中分别加入不同体积的0.05 mol·L^-1磷 酸缓冲液（pH7.8）、0.13 mol·L^-1Met 溶液、0.75 mmol·L^-1 的NBT 溶液、0.1 mmol·L^-1 的EDTA-Na2 溶 液、0.02 mmol·L^-1的核黄素溶液、粗酶液和蒸馏水，混 匀后把其中一支对照管遮光，与其他各管同时置于 4000 lx 的日光灯下反应20 min，用黑布罩上试管终 止反应。以遮光的对照管作为空白调零，在560 nm波 长下测定各管的吸光度。 1.3.3 过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性的测定

利用愈创木酚法测定^[12]。取粗酶液0.5 mL于试管 中，加入0.05 mol·L^-1 的磷酸缓冲液（pH7.8）1.5 mL， 25 mmol·L^-1愈创木酚0.5 mL，0.2 mol·L^-1H₂O₂ 0.5 mL， 摇匀立即计时3 min，每隔1 min 读数一次，以0.5 mL 0.05 mol·L^-1磷酸缓冲液替代粗酶液470 nm下调零。 1.3.4 过氧化氢酶活性（Catalase，CAT）的测定

利用紫外吸收法测定^[12]。取粗酶液0.05 mL 于试 管中，加入0.05 mol·L^-1 的磷酸缓冲液（pH7.0）3 mL， 0.2 mol·L^-1的H₂O₂ 0.05 mL，摇匀立即计时3 min，每 隔30 s读数一次，以0.5 mL 0.05 mol·L^-1 磷酸缓冲液 替代粗酶液470 nm下调零。 1.3.5 丙二醛含量（Malondialdehyde，MDA）测定

利用硫代巴比妥酸法测定^[12]。取粗酶液1 mL 于 试管中，加入0.5%硫代巴比妥酸2 mL 混匀后，沸水 浴20 min 立即放于冰水浴中，冷却后3000 r·min^-1 离 心10 min，于532、600、450 nm 比色，以0.5%硫代巴 比妥酸为空白。 1.3.6 植株铜含量测定

植物样品采用硝酸-高氯酸消煮，用火焰原子吸 收分光光度法测定^[13]。 1.4 数据统计

用Microsoft Excel 2010 进行数据处理，SPSS 17.0 统计软件进行方差分析。 2 结果与分析 2.1 铜胁迫和间作对玉米和豌豆干重的影响

从表 2 来看，两种种植模式下，玉米干重均随着 铜浓度升高而降低，当铜浓度达到Cu4 时干重达到 最小，与对照干重存在显著差异，其他各浓度处理均 与对照无显著差异。铜胁迫对豌豆干重的影响与玉米 表现一致，当铜浓度达到Cu2 时，与对照不存在显著 差异，Cu3 和Cu4 处理干重均与对照存在显著差异， 铜浓度达到Cu4 时，豌豆干重最小，且Cu2 与Cu4 之 间豌豆干重存在显著差异。

表 2 铜胁迫与间作对玉米及豌豆干重及玉米铜含量的影响 Table 2 Effects of copper stress and intercropping on dry weight of maize and peas and maize Cu content

表选项

与单作相比，间作地上部与地下部的干物质累积 量表现较为一致。Cu0~Cu2胁迫的间作玉米地上部干 重较单作分别降低了22.32%、16.37%、26.03%，而 Cu3 胁迫的间作地上部干重则与单作持平，当铜胁迫 达到Cu4 时，间作玉米地上部干重较单作提高了 16.67%，但差异均未达到显著水平。在Cu0~Cu2胁迫 下间作玉米地下部较单作分别降低了23.65%、 11.13%、4.22%，Cu3胁迫下间作地上部干重则与单作 持平，当铜浓度胁迫达到Cu4 时，间作玉米地上部干 重较单作提高了24.47%，但差异均未达到显著水平。 这说明高浓度铜胁迫下，间作模式对玉米生长有一定 的保护作用，且对地下部的促进作用高于地上部。

从植株铜元素含量看（表 2），与单作相比，不同铜 浓度胁迫下（Cu1~Cu4），间作模式均降低了玉米地上 部铜含量，分别降低了86.81%、44.57%、22.01%、 11.11%；但一定程度上提高了玉米地下部的铜含量， 分别提高78.89%、24.79%、35.29%、13.31%。不同铜浓 度胁迫下，间作模式玉米植株地上部铜含量与单作的 差值存在显著差异，但二者差值随着铜浓度升高而减 小，在Cu4 胁迫下差值最小；间作模式下玉米植株地 下部铜含量与单作的差值也存在显著差异，但二者差 值随着铜浓度升高而增大，在Cu3胁迫下差值达到最 大，而Cu4 胁迫可能由于铜浓度过高，导致间作玉米 与单作差值减小，但与对照相比差异显著。 2.2 铜胁迫和间作对玉米SOD活性的影响

SOD 是生物体内超氧阴离子自由基的清除剂，能 有效地防止它们对生物体的损害，参与植物体对重金 属胁迫所做出的各种生理生化反应，是植物体内一种 很重要的抗氧化酶类^[14]。由图 1 可以看出，无论玉米 单作还是间作，玉米根或叶的SOD 活性均表现为随 着土壤中铜浓度增加逐渐升高，在Cu4 时，SOD 活性 达到最高值，与田胜尼等^[15]通过盆栽实验研究铜对 鸭跖草SOD 活性的影响有较为一致的结果。在高浓 度Cu²⁺处理下，重金属参与植物体内的氧化还原循 环，引起活性氧的变化，在一定浓度范围内活性氧作 为信号分子可提高SOD 活性。随着铜离子浓度的上 升，间作模式中玉米叶的SOD 活性均有一定的提 高。与对照（ICu0）相比，ICu1 处理的玉米叶SOD 活 性无显著增加，而ICu2、ICu3 和ICu4 的玉米叶SOD 活性均有显著提高，但3 个Cu²⁺浓度之间没有显著 差异。对于玉米单作来说，与对照（SCu0）相比，只有 SCu4 玉米叶SOD 活性有显著提高。不同浓度Cu²⁺胁 迫对玉米根的SOD 活性均不存在显著影响。

不同大写字母表示同一浓度下两种种植模式根和叶存在 显著差异（P<0.05），不同小写字母表示同一种植模式下相 同玉米器官，在不同铜浓度下存在显著差异（P<0.05）。下同 Activities with different capital letters at the same cropper concentration indicate significant differences in leaves or roots between two cropping patterns at P<0.05; Activities with different lowercase letters in the same cropping pattern and the same maize tissue indicate significant differences between different copper concentrations at P<0.05. The same as below 图 1 铜胁迫与间作对玉米SOD活性的影响 Figure 1 Effects of copper stresses and intercropping on SOD activity in leaves and roots of maize

图选项

在相同浓度的Cu²⁺胁迫下，不同种植模式下的玉 米SOD 活性也表现了一定的差异。在Cu0 中，间作模 式下玉米根的SOD 活性显著高于单作玉米根，活性 提高了167.36%，但间作模式的玉米叶SOD 活性与 单作模式的无显著差异。Cu1 和Cu2 的结果比较一 致，间作玉米根的SOD 活性均显著高于单作玉米根， 分别提高了97.61%和117.27%，间作玉米叶SOD 活 性较单作也有一定的增加趋势，但无显著差异。Cu3 和Cu4处理，间作玉米叶和根的SOD 活性均高于单 作玉米，但差异不显著。在Cu²⁺胁迫下，间作模式在一 定程度上影响了玉米叶和根的SOD 活性，提高了玉 米对Cu²⁺胁迫的适应能力。 2.3 铜胁迫和间作对玉米POD活性的影响

POD 是植物体内酶促防御系统的一种保护酶， 能有效催化过氧化氢分解成水，从而有效阻止过氧化 氢在植物体内的累积，排除其对植物细胞膜结构的潜 在伤害^[16]。从图 2 可以看出，无论是单作还是间作玉 米根和叶的POD 活性均表现为一致的趋势，随着 Cu²⁺浓度升高，玉米POD 活性逐渐增强，在Cu4 时玉 米POD 活性达到最高值。在间作条件下，与Cu0 相 比，Cu1 的玉米叶POD 活性无显著差异，但Cu2、 Cu3、Cu4 的玉米叶POD活性均有显著提高，分别提 高了341.48%、380.92%和411.85%；玉米根的POD 活性，仅Cu4 时与Cu0 相比提高了120.03%，差异达 到显著水平。单作条件下，与Cu0 相比，玉米叶和根 的POD 活性随着Cu²⁺浓度升高均有提高，仅Cu4 时 达到显著水平，分别提高了94.45%和105.35%。

图 2 铜胁迫与间作对玉米POD 活性的影响 Figure 2 Effects of copper stresses and intercropping on POD activity in leaves and roots of maize

图选项

在相同浓度的Cu²⁺胁迫下，玉米单作和间作模式 下的POD活性存在一定的差异。在Cu0 中，相比玉米 单作，间作模式显著降低了玉米叶的POD 活性，降低 了158.77%，但间作模式下的玉米根SOD 活性无显 著差异。在有Cu²⁺胁迫时，相比玉米单作，间作模式下 玉米叶POD 活性有一致的增加趋势，间作模式下玉 米根的POD 活性在Cu1 和Cu2 时有降低的趋势，但 在Cu3 和Cu4 时有增大的趋势，在Cu4 时达到最大。 种植模式在Cu²⁺胁迫的条件下对玉米POD 活性没有 显著影响，但没有Cu²⁺胁迫时间作模式显著降低了玉 米叶POD 活性。在Cu0、Cu1、Cu2时间作模式能在一 定程度上缓解重金属铜对玉米的胁迫。 2.4 铜胁迫和间作对玉米CAT活性的影响

CAT与过氧化氢具有较高的亲和力，主要清除线 粒体电子传递、脂肪酸氧化过程中产生的过氧化氢， 其含量变化是植物体内过氧化氢在体内变化的标志 性反应^[17,18]。由图 3可以看出，当Cu²⁺浓度为Cu0~Cu3 时，随着Cu²⁺浓度的提高，间作玉米叶的CAT 活性逐 渐升高，Cu3 时CAT活性达到最大。随着Cu²⁺浓度的 继续提高，CAT 活性逐渐降低，与其他浓度处理的 CAT活性存在显著差异，呈现典型的单峰变化趋势。 当Cu²⁺浓度在Cu0~Cu2 范围时，间作玉米根和单作 玉米叶的CAT 活性逐渐下降，Cu2 时CAT 活性达到 最小；当Cu3 时间作玉米根和单作玉米叶的CAT 活 性上升，Cu²⁺浓度超过400 mg·kg^-1后，玉米CAT 活性 迅速下降。单作玉米根的CAT 活性随着Cu²⁺浓度的 上升而逐渐降低，但Cu4 时单作根的CAT 活性最低， 明显低于其他浓度处理的CAT活性。

图 3 铜胁迫与间作对玉米CAT活性的影响 Figure 3 Effects of copper stresses and intercropping on CAT activity in leaves and roots of maize

图选项

在相同浓度的Cu²⁺胁迫下，玉米单作和间作模式 下的CAT 活性表现出较为一致的规律。Cu4 时玉米 间作和单作叶CAT 活性无显著差异，其余Cu²⁺浓度 （Cu0、Cu1、Cu2、Cu3）胁迫下，均表现为间作玉米叶 CAT 活性均显著高于单作，分别提高了71.37%、 140.40%、229.80%和161.75%。在中低浓度Cu²⁺胁迫 下（Cu0~Cu2）均表现为单作玉米根CAT 活性高于间 作，当Cu²⁺浓度达到Cu3~Cu4 时，则表现为间作玉米 根CAT活性高于单作，且差异均达到显著水平。上述 结果表明，在较低浓度的Cu²⁺胁迫下，间作模式有利 于提高玉米叶适应Cu²⁺胁迫环境，过高浓度的Cu²⁺胁 迫，破坏了玉米的CAT活性。 2.5 铜胁迫和间作对玉米MDA含量的影响

MDA 是膜脂过氧化的最终分解产物，是植物细 胞膜质过氧化程度的体现，其含量可以反映植物遭受 逆境伤害的程度^[19]。丙二醛含量高，说明植物细胞膜 质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。从图 4 可 以看出，间作叶和单作根的MDA 含量随着Cu²⁺浓度 的上升而逐渐上升，但各处理之间没有显著差异。在 低浓度时（Cu0、Cu1），单作玉米叶的MDA 含量随着 Cu²⁺浓度的升高而增加，Cu2、Cu3 时MDA 含量随着 Cu²⁺浓度的上升而下降，Cu4 时MDA 含量达到最大 值，但各处理之间无显著差异。

图 4 铜胁迫与间作对玉米MDA含量的影响 Figure 4 Effects of copper stresses and intercropping on MDA content in leaves and roots of maize

图选项

在相同浓度的Cu²⁺胁迫下，玉米单作和间作模式 下的MDA含量表现出较为一致的规律。在Cu0~Cu2 时，叶中MDA 含量均表现为单作高于间作，而Cu3~ Cu4 时，则表现为间作高于单作，但两种模式比较，玉 米MDA 含量均无显著差异。根中MDA 含量均表现 为单作高于间作，在Cu0~Cu1 时，两种种植模式下玉 米根的MDA 含量均无显著差异，而Cu2~Cu4 时均表 现为单作玉米根MDA 含量显著高于间作玉米，分别 提高了181.93%、120.50%和142.27%。 3 讨论

铜是植物生长必需元素，植物体可作为多种酶的 辅基，且对非催化蛋白质也具有很强的亲合力。当铜 含量超过一定限度时，则会对植物生长、呼吸、光合等 生理过程产生明显的抑制作用，直接或间接启动膜质 的过氧化作用，导致膜的损伤和叶绿素分解。而植物 亦可通过累积脯氨酸、增强抗氧化酶活性等方式来提 高自身对铜的抵抗能力^[20]。综合来看，玉米间作豌豆受 盆栽空间所限，由于种间竞争，在低浓度Cu²⁺胁迫下 反而降低了玉米的干重，而高浓度Cu²⁺胁迫下，种间 竞争减小，间作优势体现在玉米干物质累积量。高浓 度的Cu²⁺胁迫致使玉米叶中的超氧自由基含量升高， 导致SOD 活性上升，催化超氧自由基转变为H₂O₂，与 金进等^[21]研究结果较为一致。Cu²⁺处理下间作玉米叶 和根的SOD 活性均高于单作玉米，可能是由于间作 模式下，两种作物根系分泌物，尤其是豌豆分泌的有 机酸可能活化土壤中的铜，使得土壤有效态铜含量升 高，促进了玉米对Cu²⁺的吸收。当较多的Cu²⁺进入玉米 后，致使玉米体内的超氧自由基含量高于单作，而 SOD 为超氧自由基清除剂，进而增强SOD 活性来清 除过多的超氧自由基，故表现为间作模式下玉米SOD 活性高于单作玉米。POD 活性与SOD 活性表现出较 为一致的规律，SOD 将超氧自由基氧化成H₂O₂，随着 H₂O₂含量不断升高，POD 和CAT 活性也呈现上升趋 势，这是玉米体内的一种自我保护机制^[22]。随着Cu²⁺胁 迫的加剧（600 mg·kg^-1），CAT 活性开始呈现下降趋 势，表明玉米体内的保护性酶系统可能开始受到破 坏，由SOD催化产生的H₂O₂已无法进一步分解，使得 H₂O₂在玉米体内大量累积，H₂O₂成为玉米体内胁迫的 主要物质。而POD具有双重性，既能催化H₂O₂与其他 底物进行氧化反应而被清除，又能催化超氧自由基和 H₂O₂转变为羟自由基而加重过氧化作用^[23]。在高浓度 Cu²⁺胁迫下玉米体内产生H₂O₂及过氧化物，POD活性 上升，可能导致羟自由基增多，引起叶片膜脂过氧化 加剧，使得MDA 含量增加^[24]。 4 结论

（1）高浓度Cu²⁺胁迫下，玉米间作豌豆能提高玉 米地上部和地下部的干物质累积量，从而保持玉米在 高浓度Cu²⁺胁迫下的生长。

（2）与单作相比，间作模式显著降低了玉米地上 部铜含量，而显著提高了玉米地下部铜含量，且随着 铜浓度的升高，二者之间的差值呈下降趋势。

（3）在一定范围内的Cu²⁺胁迫下，玉米体内的SOD、 POD、CAT 活性和MDA 含量均随着Cu²⁺胁迫浓度的 增加而提高，但Cu²⁺浓度达到600 mg·kg^-1时，玉米体 内的CAT活性有所下降。

（4）相同的Cu²⁺浓度胁迫下，与单作相比，玉米 间作豌豆能增强玉米叶和根中的SOD 和CAT 活性。 在高浓度Cu²⁺胁迫下，提高了间作玉米根的POD 活 性，降低了间作玉米根中MDA 含量和质膜氧化损伤 程度。