随着农业和畜牧业的不断发展，农田秸秆和禽畜粪便大量积累，造成环境污染^[1,2]。堆肥化处理具有安全性和可持续性，将秸秆与粪肥按适宜比例混合制成肥堆，便可在微生物作用下将有机物降解为稳定腐殖质，从而减少有机废物对环境造成的压力^[3]。目前，堆肥已经成为处理有机固体废物最有效的方法之一^[4]。

反硝化作用在土壤氮素循环中承担着重要角色，在酶的催化下将硝酸盐还原成N₂O或N₂^[5,6]。其中，N₂O还原酶（nosZ基因）参与反应最后一步，可检测反硝化作用是否完全^[7]。同时，可催化N₂O转化成N₂，减少了温室气体N₂O的产生^[8]。因此，应用nosZ基因检测反硝化细菌得到广泛关注^[9,10]。

虽然目前已有不少关于反硝化细菌群落结构方面的研究，但接种菌剂对反硝化细菌群落影响的报道很少见。本实验采用传统培养与PCR-DGGE技术相结合的方法，研究了接种菌剂对牛粪堆肥中反硝化细菌数量及以nosZ基因为标记的反硝化细菌群落结构和多样性的影响，旨在明确堆肥过程中反硝化细菌群落的组成与动态变化，为进一步深入研究反硝化细菌与氮素间的相互关系及其在堆肥氮素循环中的作用提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料

供试牛粪采自哈尔滨市幸福乡奶牛养殖厂，水稻秸秆采自哈尔滨香坊农场东北农业大学实验基地。堆肥材料主要成分见表 1。外源菌剂由东北农业大学实验室配制，包括有降解木质素的模式菌株——黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）和兼具木质素、纤维素、半纤维素三种酶活性的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens） C-5。

表 1 堆肥材料的主要成分 Table 1 Properties of raw materials for composting

表选项

自然堆肥：将水稻秸秆铡成5 cm左右的小段，与牛粪按质量比1∶3.5混合，调节含水率在65%左右，建成1 m×1 m×1.2 m的发酵堆，定期翻堆，发酵45 d，堆肥初始C/N约为30∶1。 接种菌剂堆肥：在堆肥初期添加菌剂，接种量为1%，接种菌剂后均匀混合堆肥材料。堆制方式同自然堆肥。 1.3 样品采集

在堆肥的第0、3、7、15、21、36、45 d取样，每次从堆体的上、中、下层各取300 g样品，混合均匀后用四分法保留500 g，部分冷藏，部分用于相关指标的测定。 1.4 测定内容与方法

采用LNI-T UT325数字电子温度计测量堆体30 cm处温度，pH值采用数显pH仪测定。全碳和全氮分别采用重铬酸钾容量法和凯氏定氮法，铵态氮采用靛酚蓝比色法，硝态氮采用紫外分光光度法^[11]测定。种子（大豆）发芽率测定方法见参考文献^[12]。反硝化细菌数量采用最大或然数计数（MPN）法，采用反硝化细菌培养基^[13,14]，在30 ℃条件下培养14 d，培养基成分及检测方法见表 2^[13]。

表 2 反硝化细菌培养基成分及检测方法 Table 2 Medium composition and detection method for denitrifying bacteria

表选项

堆肥样品总DNA的提取方法参考文献^[15]。用OMEGA凝胶回收试剂盒对粗提基因组DNA进行纯化，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。 1.6 反硝化细菌nosZ基因的PCR扩增

引物采用nosZ-F和nosZ1622R^[16,17]。GC夹（5-GGC GGC GCG CCG CCC GCC CCG CCC CCG TCG CCC-3）添加到nosZ1622R的5′端^[18]。反应体系及条件：50 μL PCR体系（10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，模板1 μL，Taq酶0.6 μL，nosZ-F 0.8 μL，nosZ1622R 0.8 μL，补充ddH2O到50 μL） 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，63.5 ℃（每循环降0.1 ℃）退火1 min，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min。 1.7 DGGE及条带测序

变性梯度凝胶电泳（DGGE仪器为Bio-RAD DCodeTM）采用8%的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶双丙烯酰胺= 37.5∶1 m·V^-1），其中尿素浓度范围为30%~70%。电泳条件：1×TAE电泳缓冲液，130 V电压，60 ℃恒温、恒压电泳12 h。电泳结束后用硝酸银染色，将DGGE图谱上的主要条带切胶回收，溶于无菌去离子水中^[19,20]，用引物nosZ-F和nosZ1622R进行PCR扩增，反应条件同1.6。将所得产物送到测序公司进行测序。 1.8 DGGE图谱分析

应用Quantity One 4.6.2软件对DGGE图谱条带进行分析，根据公式H=-ΣP_ilnP_i计算出反硝化细菌的多样性指数H（式中P_i=N_i/N，N_i为各泳道上第i个条带吸收峰面积，N为各泳道上所有条带的总吸收峰面积^[21,22]）。 1.9 系统发育分析

通过Blast程序将所得序列与GenBank数据库中数据进行比对，获得相近已知序列，用MEGA 4中NJ（Neighbor-Joining）法构建基因系统进化树并对其进行系统发育分析。 2 结果与讨论 2.1 堆肥温度变化

温度变化能够比较直观地反映堆肥进程，也是评价堆肥腐熟度的重要检测指标之一^[23]。从图 1可以看出，两组堆肥温度变化趋势相同，都经历了升温、高温、降温和腐熟四个时期。接种菌剂堆肥0~3 d为升温期，在第3 d堆体温度升至50 ℃以上；3~15 d为高温期，其中，第9 d达到最高温度66 ℃，温度在50 ℃以上共持续13 d；15~36 d为降温期；36~45 d温度下降到40 ℃以下并趋于稳定，为腐熟期。自然堆肥0~7 d为升温期，第7 d温度达到50 ℃以上；7~15 d为高温期，在第13 d达到最高温度59 ℃，温度在50 ℃以上共持续9 d；15~36 d为堆肥降温期；36~45 d为腐熟期。一般认为堆肥温度在50℃以上并维持5～10 d就可达到无害化^[12]，两组堆肥都符合无害化标准。

图 1 堆肥温度变化 Figure 1 Temperature changes during composting

图选项

温度变化表明接种外源菌剂堆肥比自然堆肥进入高温期更快，持续时间更长，可见接种外源菌剂加速了堆肥过程的启动，提高了堆肥温度^[20]，能够更加有效地杀死堆肥中病原微生物，达到无害化目的。 2.2 pH值变化

从图 2可以看出，两组堆肥的pH值都呈先上升后下降的变化趋势。在接种菌剂堆肥第7 d、自然堆肥第15 d，pH分别达到最大值8.71和8.66。这是因为堆肥初期随着温度升高，含氮物质降解，产生的NH₄⁺不断积累，从而使pH值不断升高。堆肥后期产生的氨类物质减少，pH值逐渐下降，接种菌剂和自然堆肥在堆制结束时的pH值分别为8.05和8.13，符合腐熟堆肥pH值在8.0~9.0（呈弱碱性）的标准^[24]。

图 2 堆肥pH值变化 Figure 2 pH changes during composting

图选项

　C/N是最常用的堆肥腐熟度评价方法之一，为了有利于微生物的正常生长繁殖和有机物的快速分解，一般调节堆肥初始C/N在25~30为最佳，随着堆肥进行，当C/N小于20时可认为堆肥已基本达到腐熟^[25]。从图 3可以看出，堆肥结束时，两组堆肥C/N都在20以下，达到腐熟标准。接种菌剂堆肥C/N低于自然堆肥，说明接种菌剂堆肥有机质分解率更高，腐熟效果更好。 　

图 3 堆肥C/N值变化 Figure 3 C/N changes during composting

图选项

未腐熟的堆肥对植物具有毒害作用，会抑制植物生长，因此种子发芽率（GI）被认为是评价堆肥腐熟程度最敏感且最有效的生物方法。GI＞50可认为堆肥基本达到腐熟，GI≥85则认为堆肥已完全腐熟^[24]。从图 4可以看出，两组堆肥种子发芽率变化规律相同，堆肥初期，种子发芽率较低，表明堆肥未腐熟，生物毒性较强。第15 d种子发芽率都达到50%以上，堆肥基本腐熟，到第21 d种子发芽率都在85%以上，堆肥完全腐熟。堆肥结束时接种菌剂堆肥GI大于自然堆肥GI，说明接种菌剂堆肥腐熟度更好，更利于农作物生长。

图 4 种子发芽率变化 Figure 4 Seed germination rates under different periods of composting

图选项

从图 5可以看出，在整个堆肥过程中，铵态氮含量呈现出升高-降低趋势。堆肥初期，氮素含量相对较高，随着微生物的生长和繁殖作用，微生物氨化作用及有机氮的矿化分解加剧了有机氮的分解，铵态氮含量增加。接种菌剂堆肥和自然堆肥铵态氮最大值分别出现在第3 d和第7 d，分别为2595、2410 mg·kg^-1。堆肥后期，由于氨气的挥发以及部分铵态氮转化为硝态氮，导致其含量逐渐下降。堆肥结束时，接种菌剂堆肥和自然堆肥铵态氮含量分别为189、342 mg·kg^-1，前者低于后者，可能是因为接种菌剂堆肥促进了微生物的生长，更多铵态氮为微生物菌体所利用^[26]。

图 5 堆肥铵态氮含量变化 Figure 5 Changes of NH4+-N contents during composting

图选项

堆肥初期氮素主要以铵态氮等形式存在，硝态氮含量变化不大，随着堆肥进行，铵态氮逐渐向硝态氮转化，进入降温期硝态氮含量迅速增加，至堆肥腐熟期出现最大值（图 6）。接种菌剂堆肥硝态氮含量（478 mg·kg^-1）是自然堆肥（324 mg·kg^-1）的1.5倍，与初始相比，分别增加了248、209 mg·kg^-1。堆肥初始至结束阶段，接种菌剂堆肥硝态氮含量始终高于自然堆肥，与马丽红等^[27]研究结果一致，表明接种菌剂可增加硝化细菌数量，促进铵态氮向硝态氮的转化，从而使硝态氮含量较高。

图 6 堆肥硝态氮含量变化 Figure 6 Changes of NO3--N contents during composting

图选项

从图 7可以看出，堆肥初始阶段反硝化细菌数量相对较少，堆肥中后期数量逐渐增多。这可能是由于堆肥前期其他微生物大量生长，与之竞争，同时受到氧气及底物浓度等影响，从而抑制了反硝化细菌的生长；而堆肥后期存在部分厌氧区域，导致反硝化作用增强。接种菌剂堆肥中反硝化细菌数量与自然堆肥差异显著（P<0.05），前者始终少于后者，与徐大勇等^[28]研究结果一致。堆肥第21 d反硝化细菌数量达到最大，其对数值分别为4.51、4.84。在降温期至腐熟期反硝化细菌数量逐渐下降。

图 7 堆肥反硝化细菌数量变化 Figure 7 Changes of denitrifying bacterial population during composting

图选项

两组堆肥中，反硝化细菌数量均与铵态氮呈负相关关系，与硝态氮呈显著正相关关系（表 3）。这与刘学玲等^[29]研究结果一致，与马丽红等^[27]结果不一致，可能是由于堆肥中存在好氧反硝化细菌，兼具反硝化和硝化作用，能够将NH₄⁺转化成NO₂^-甚至NO₃^-[29,30]。和自然堆肥相比，接种菌剂堆肥中各相关系数均有所增加，可能与接种菌剂堆肥中存在更多好氧反硝化细菌有关。

表 3 堆肥反硝化细菌与铵态氮和硝态氮间相关系数 Table 3 Correlation coefficients between denitrifying bacteria and NH₄⁺-N and NO₃^--N

表选项

本研究堆肥基因组 DNA 长度在23.1 kb左右，均已获得较完整的基因组 DNA 片段。粗提DNA含有较多杂质，不利于之后的PCR反应，因此需要进一步纯化^[31]。以纯化后的DNA作为模板进行PCR扩增，堆肥样品均得到长度为453 bp的特异性片段。接种的复合菌剂中未检测到nosZ基因，说明添加的菌剂中不含有nosZ-反硝化细菌。 2.10 DGGE图谱分析

DGGE图谱上条带亮暗强度及条带数量反映了微生物数量多少及多样性情况，从图 8可以看出，自然堆肥各泳道条带较为相似，而接种菌剂堆肥各泳道条带差异性较大，可能是由于接种菌剂加速了微生物间的群落演替，从而使条带差异明显。自然堆肥过程中，条带A、B、C、D、E、F始终出现，是堆肥中的优势类群。G和I在降温期出现，成为该时期的特异性条带。接种菌剂堆肥各个时期，也同样检测到了条带B、C、E、F。A、D只在堆肥前期出现，到后期消失，为堆肥前期优势类群。降温至腐熟期，自然堆肥中的条带H也被检测到，但亮度较暗，说明在接种菌剂堆肥中该种反硝化细菌数量较少，同时出现了新的特异性条带，分别为J、K、L、M和N。

L1-L7分别代表自然堆肥第0、3、7、15、21、36、45 d；J1-J7 分别代表接种菌剂堆肥第0、3、7、15、21、36、45 d 图 8 反硝化细菌nosZ基因的DGGE图谱 Figure 8 DGGE profile of nosZ gene of denitrifying bacteria in composts

图选项

利用Quantity one软件对DGGE 图谱进行聚类分析（UPGAMA），结果如图 9和图 10所示。可以看出，在自然堆肥中，相邻泳道间相似性较高，泳道1和2、3和4、6和7的相似性系数分别达到66%、70%、75%，说明取样时间越接近，相似性越高。接种菌剂堆肥中，泳道2和3、6和7聚在一起，2和3相似性系数为68%，6和7的为76%。自然堆肥各泳道相似性在50%~75%之间，接种菌剂堆肥泳道相似性在27%~76%之间，说明接种菌剂加速了反硝化细菌群落的演替，最终形成稳定的群落类型。

图 9 自然堆肥DGGE图谱聚类分析 Figure 9 Cluster analysis of DGGE profile in natural compost

图选项

图 10 接种菌剂堆肥DGGE图谱聚类分析 Figure 10 Cluster analysis of DGGE profile in microbes-inoculated compost

图选项

堆肥过程中，反硝化细菌多样性指数整体呈增加趋势（图 11）。堆肥初期，反硝化细菌多样性指数变化较小，到了后期多样性指数有所增加。这是由于堆肥后期反硝化底物NO₃^-逐渐累积或存在部分厌氧区域，利于厌氧反硝化细菌生长，从而提高了多样性。接菌菌剂堆肥各时期反硝化细菌多样性指数均大于自然堆肥，可能是因为堆肥初期添加的外源菌剂能够更好地分解堆料中的有机质，为微生物生长提供更多碳、氮源，使反硝化细菌种类增加。

图 11 反硝化细菌nosZ基因多样性指数 Figure 11 NosZ gene diversity index of denitrifying bacteria

图选项

在GenBank中选取和条带A~N序列相似性较高的nosZ基因序列，通过软件Mega4将这些序列构建系统发育树。从图 12可以看出，堆肥中含nosZ基因的反硝化细菌类群包括γ-变形菌纲（γ-proteobacteria）、β-变形菌纲（β-proteobacteria）、未培养细菌（Uncultured bacteria）和α-变形菌纲（α-proteobacteria）。自然堆肥中，条带A~F在各个时期始终出现，其中E、F属于未培养细菌，B~D属于γ-变形菌纲，且均为假单胞菌属，是自然堆肥整个过程中的优势菌属，条带A所测得序列虽然和未培养细菌同源性最高，但与产碱菌属（Alcaligenes）也有较高的相似性，可归属于β-变形菌纲。H在降温和腐熟期被检测到，与无色杆菌属（Achromobacter）同源性达到99%。在接种菌剂堆肥中，同样能检测到条带A~F和H，且B、C、E、F在整个堆肥过程中始终出现，成为堆肥反硝化细菌优势菌属。而A和D只在堆肥前期出现，后期消失。高温和降温期还分别检测到J、K、L、M，其中：J与盐单胞菌属（Halomonas）同源性达98%；K在高温后期开始出现，一直到堆肥腐熟期仍然存在，成为接种菌剂堆肥后期的优势类群，与它同源性较高的为固氮螺菌属（Azospirillum）；L和M都只在堆肥降温初期出现，与它们同源性较高的分别为副球菌属（Paracoccus）和草螺菌属（Herbaspirillum）。N与产碱菌属同源性为99%。接种菌剂堆肥中出现的K和J均属于α-变形菌纲。

图 12 反硝化细菌nosZ基因系统发育树 Figure 12 Phylogenetic tree based on nosZ sequences of denitrifying bacteria

图选项

接种菌剂堆肥中出现自然堆肥中不存在的反硝化菌属，包括盐单胞菌属、固氮螺菌属、副球菌属、草螺菌属和产碱菌属。有研究发现，其中的产碱菌属、副球菌属存在好氧反硝化现象^{[32,33,34,35]}，且这些菌属中某些菌株的反硝化终产物为N₂^[36]，避免了N₂O的产生。而自然堆肥中并未检测到这些反硝化细菌类群，可见接种菌剂加速了反硝化细菌的演替过程，增加了nosZ-反硝化细菌群落多样性。 3 结论

（1）接种菌剂可提高堆肥温度，延长高温期，更利于微生物生长，促进堆肥腐熟，达到无害化标准。

（2）在整个堆肥过程中，接种菌剂堆肥中可培养反硝化细菌数量始终少于自然堆肥，且其与铵态氮和硝态氮间相关性也较自然堆肥更为显著。

（3）通过对DGGE图谱泳道间聚类分析可知，自然堆肥各泳道相似性在50%~75%之间，接种菌剂堆肥泳道相似性在27%~76%之间。和自然堆肥相比，接种菌剂堆肥加速了反硝化细菌群落演替，使nosZ-反硝化细菌多样性有所增加。

（4）通过序列比对及系统发育分析得出，堆肥中的反硝化细菌类群主要属于γ-变形菌纲和β-变形菌纲，假单胞菌属和一些未培养的细菌。接种菌剂堆肥在高温和降温期检测到了自然堆肥中不存在的nosZ-反硝化类群，这些新的类群分别属于盐单胞菌属、固氮螺菌属、副球菌属、草螺菌属和产碱菌属。