三氮苯类除草剂是目前国内外广泛使用的选择性内吸收传导型除草剂，可防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草及某些多年生恶性杂草。扑草净（2-甲硫基-4，6-双异丙氨基均三氮苯，Prometryn）是三氮苯类除草剂中常见的一种，主要通过抑制植物的电子传输来影响植物的光合作用，从而达到除草的作用。在水产养殖业中也被频繁应用，主要用于清除鱼、虾、蟹、贝、海参等养殖水体中的丝状藻类（如浒苔）、大型草类及其他有害藻类。扑草净在欧洲已于2004年被禁用^[1]，但由于它毒性低、杀草谱广，目前中国^[2]、美国、加拿大、新西兰、南非还在广泛使用^[3]。

扑草净在环境中比较稳定，半衰期为13个月，其较长的残效期，更容易在环境中残留并造成危害。有学者对渤海某海域60个站点海水分析后发现，扑草净的检出率为100%^[4]；上海某河水中也检测出扑草净，其浓度高达7.12~0.54 μg·L^-1[5]。马晓雁等^[6]检测了上海某水厂（该水厂以黄浦江水为原水）中扑草净的平均浓度，结果表明4月扑草净的浓度最高，达到1.25 μg·L^-1。有报道显示捷克的河流中扑草净的浓度为0.51 μg·L^-1[7]，希腊的地表水中扑草净的范围在0.91～4.40 μg·L^-1，而在地下水中超过1 μg·L^-1[8]。可见，扑草净在环境中不仅残留时间长，而且分布较为广泛。扑草净进入环境后会对非靶细胞生物造成影响。研究发现扑草净对月牙藻（Selenastrum capricornutum）的5 d EC50为0.023 mg·L^-1[9]，对浮萍（Lemna minor）的24 h EC50为0.083 μmol·L^-1，对轮藻（Chara canescens）的24 h LC₅₀为0.071 μmol·L^-1[10]。李雪芹等^[11]发现扑草净对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的EC50为0.16 mg·L^-1，并且在低浓度（0.01 mg·L^-1）下对蛋白核小球藻表现出一定的刺激生长效应，而随扑草净浓度的增加，抑制生长作用增强，藻体内丙二醛含量急剧升高。Jiang等^[12]发现扑草净能够抑制小麦的生长，表现为扑草净（4 mg·kg^-1）能够导致叶绿素含量的大幅度降低，植物体脂质过氧化水平升高。

可溶性有机质（DOM）通常被定义为能够透过0.45 μm滤膜，且在以后的分析过程中不因蒸发而丢失的有机物质。在表面水体中的浓度（按溶解性有机碳DOC计）为1～15 mg·L^-1[13]。也有报道称天然水体中DOM的浓度范围为1～40 mg·L^-1，江河中平均可达7 mg·L^-1。腐植酸（Humic acid，HA）是DOM的主要组成部分^[14]，在水环境中普遍存在，它不仅能对生物产生直接影响^[15]，还能够通过改变有机污染物的生物有效性间接影响生物。Cánepa等^[16]以胆碱酯酶活性作为生物标志物，研究了在不同浓度（5、20、60 mg·L^-1）HA存在条件下杀螟硫磷对双脐螺（B. glabrata）的影响，发现在20、60 mg·L^-1 HA条件下，杀螟硫磷处理组双脐螺体内胆碱酯酶的活性与空白组近似，说明该条件下高浓度HA的存在没有使杀螟硫磷的可利用性增加。

扑草净的检测手段、在土壤和水环境中的吸附解吸^[17]以及它对植物的影响^{[11, 12]}已有报道，而其对斑马鱼（Danio rerio）的毒性以及HA的存在对其毒性的影响未见报道。本研究考察了扑草净对斑马鱼的毒性，以及HA对扑草净毒性的影响，为评价扑草净对水生生物乃至非靶标生物的潜在威胁提供理论依据，对更好地控制和预测环境中扑草净污染情况具有重要意义。同时，以丙二醛（MDA）为测定指标，研究HA对斑马鱼的直接影响，并选择紫外-可见光吸收光谱法对扑草净和HA进行定性分析，探索HA影响扑草净对斑马鱼毒性的原因。 1 材料与方法 1.1 受试生物

斑马鱼，购自天津市安琪花鸟虫鱼市场。斑马鱼为成鱼，平均体长2.9 cm，平均体重0.13 g。实验用水为充分曝气脱氯的自来水，pH7.9，温度（24±2）℃。在实验室水族缸内驯养14 d以上，每3 d喂食一次，及时清理缸底粪便，试验前24 h停止喂食，驯养期间自然死亡率<1%。驯养过程中去除受伤、体色异常、畸形个体，选择生长良好的鱼作为试验鱼，雌雄不限。 1.2 试验方法

试验用水为曝气一周以上的自来水，采用自然光照。每个处理设置2个重复，处理系列均采用5 L烧杯盛2 L溶液，每个烧杯中放入10条斑马鱼，试验期间轻微曝气，周期为96 h。试验前将烧杯用2%（质量分数）KMnO4消毒。

扑草净（表 1，纯度＞97％，浙江省中山进出口有限公司）储备液以丙酮为助溶剂，45 ℃超声30 min后，过0.45 μm有机滤膜，现配现用。标准曲线用扑草净标样（纯度＞99%，Aladdin）配置。

表 1 扑草净的性质 Table 1 Properties of prometryn

表选项

HA购自美国Sigma-Aldrich公司，CAS号为1415-93-6，它的提取来源是褐煤，主要组成元素的质量百分含量和原子比等理化值见表 2。称取2 g腐植酸于2 L蒸馏水中，搅拌24 h，3500 r·min^-1离心10 min后，取上清液过0.45 μm滤膜。测定该溶液的总有机碳TOC（Analytik jenamulti N/C 3100）浓度，用该浓度（mg C·L^-1）表示腐植酸浓度。

表 2 HA的元素质量百分含量和原子比等理化值^[20] Table 2 Elemental percent contents and atomic ratios of humic acid

表选项

为保证试验水体中扑草净浓度维持基本稳定，利用高效液相色谱测定10 mg·L^-1（对斑马鱼的100%致死浓度）扑草净在曝气条件下96 h前后的浓度，结果显示浓度仅减少了0.26%，因此可以采用静态方式进行此急性毒性实验。根据预实验，得到扑草净对斑马鱼的急性毒性耐受范围为0～10 mg·L^-1，在此范围内设置0（CK小于0.1%的丙酮）、3、4、5、6、7、8、9、10 mg·L^-1 共9个扑草净浓度水平。 1.2.1.2 腐植酸对扑草净毒性的影响

各浓度组设定见表 3，同时设置0.1%的丙酮助溶剂、15 mg·L^-1 HA对照和空白组。待各浓度组溶液混匀平衡48 h后放入斑马鱼，实验期间及时去除死亡鱼体，称重记录。

表 3 腐植酸与扑草净的浓度处理 Table 3 Concentration treatments of HA and prometryn

表选项

配置0、5、15 mg·L^-1 HA溶液，容器为1 L的烧杯，设置2个重复，每个烧杯中放5条斑马鱼，其他条件与上述急性毒性试验相同。96 h后测定试验溶液的电导率及鱼体内MDA浓度。 1.2.3 紫外-可见光吸收分析

按照1.2.1.2中毒性试验的梯度设置配制各组溶液及5、15 mg·L^-1 HA溶液，以双蒸水作为对照，平衡48 h后，将样品置于1 cm的石英比色皿中，在200～420 nm范围内全扫描。 此分析在TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）上完成。 1.2.4 测定方法

MDA的测定方法：将斑马鱼活体解剖，在冰浴条件下按1∶9（鱼体质量/0.86%生理盐水体积）的比例加入预冷的生理盐水，在预先冷冻过的玻璃匀浆器中匀浆，制备成10%的组织液。组织液在4 ℃、2500 r·min^-1条件下离心（Hettich Mikro 200R，德国）15 min，取上清液备用。采用硫代巴比妥酸法（TBA法，南京建成公司试剂盒）测定斑马鱼体内MDA浓度；蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。

扑草净的测定方法：采用Waters高效液相色谱[Waters 1525 Binary HPLC Pump，Waters 2487 DualλAbsorbance Detector，Venusil XBP C18-L（4.6 mm×250 mm]对水溶液中扑草净浓度进行分析，流动相为75∶25（V/V）的甲醇/超纯水溶液，流速1 mL·min^-1，检测波长220 nm，柱温为室温，进样量20 μL，保留时间为8.83 min。 1.3 数据处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，显著性分析采用单因素方差分析，用Origin 8.5作图。 2 结果与分析 2.1 斑马鱼中毒症状

试验开始前10 h连续观察不同染毒浓度下斑马鱼的中毒症状。观察结果显示在扑草净为7、8、9、10 mg·L^-1浓度组，斑马鱼表现出先快速窜动，随后开始侧卧不动、侧身游动、游动迟缓、头向下游动、身体旋转游动等异常行为，最后或逐渐适应水体继续存活，或因无法适应而死亡。这些异常行为在染毒浓度较高的处理组，出现的时间较早。而在扑草净3、4、5、6 mg·L^-1浓度下，鱼体的中毒症状较轻，与空白组没有明显差别。 2.2 扑草净对斑马鱼的急性毒性

扑草净对斑马鱼的96 h LC₅₀为7.488 mg·L^-1（表 4），参照国家环保局制订的《生物技术监测规范（水环境部分）》，扑草净对斑马鱼的毒性属于高毒。对照组中斑马鱼的死亡率为0。

表 4 扑草净对斑马鱼96 h LC₅₀值及95%置信区间 Table 4 96 h LC₅₀ of prometryn for zebrafish and 95% confidence intervals

表选项

HA存在下，当扑草净浓度为6.5 mg·L^-1和7.5 mg·L^-1时，斑马鱼的96 h致死率没有显著性差异（P<0.05）。在P_8.5+HA₁₅实验组斑马鱼的致死率达到100%，而P_8.5和P_8.5+HA₅组的死亡率分别为60%和50%（图 1）。0.1%的丙酮助溶剂及HA₁₅对照组中斑马鱼没有死亡。

*表示不同处理组间差异显著（P<0.05） *Indicates significant differences between treatments（P<0.05） 图 1 HA存在下扑草净对斑马鱼的96 h致死率 Figure 1 Cumulative motality of prometryn to zebrafish under HA presence

图选项

在以下表述中P_6.5、P_6.5+HA₅、P_6.5+HA₁₅为Ⅰ组，P_7.5、P_7.5+HA₅、P_7.5+HA₁₅为Ⅱ组，P_8.5、P_8.5+HA₅、P_8.5+HA₁₅为Ⅲ组。Ⅰ组在72～96 h累积死亡率增加较快，96 h累积死亡率较72 h时高出30%～35%；Ⅱ和Ⅲ组较早进入快速死亡期（48～72 h），72 h累积死亡率较48 h时高出30%～40%和20%～80%（图 2）。另外，在Ⅰ组中，HA对扑草净毒性的影响不大，而随着扑草净浓度的升高，HA对扑草净毒性的影响逐渐增大，并且这一过程在染毒的72 h最为显著。

图 2 HA存在下扑草净对斑马鱼的累积致死率 Figure 2 Cumulative motality of prometryn to zebrafish with and without HA

图选项

扑草净对斑马鱼的96 h LC₅₀为7.488 mg·L^-1，95%置信区间为7.032~7.971 mg·L^-1。这与扑草净对鲤鱼（Cyprinus carpio）的96 h LC₅₀（8 mg·L^-1）^[21]毒性数据相似，可能是由于斑马鱼和鲤鱼均属于鲤科种类的原因。扑草净对杂色鳉（Cyprinodon variegatus）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的96 h LC₅₀分别为5.1 mg·L^{-1 [3]}和2.9 mg·L^-1[9]，低于斑马鱼的96 h LC₅₀，可能是由物种之间的差异、生物体大小不同等因素所致。

HA是水体中一类重要的溶解性有机质（DOM），含有一系列功能团，如羟基、羧基、酚羟基、烯醇羟基等，会对疏水性有机污染物在环境中的行为产生重要影响。研究表明HA能改变污染物在生物体内的富集、急性毒性和抗氧化能力^{[22, 23]}。曹璐等^[22]研究发现低浓度HA（0～2 mg·L^-1）与0.5 mg·L^-1四溴双酚共存条件下，HA降低了四溴双酚 A在金鱼藻中的富集。Wiegand等^[23]研究了三种DOM（5、25 mg·L^-1）存在条件下，带丝蚓（Lumbriculus variegates）对百草枯的富集，结果表明随着DOM浓度的升高，百草枯在带丝蚓体内的富集量减少，这是由于DOM与百草枯形成了电荷转移复合物或是离子捆绑导致电荷中和，从而降低了百草枯的生物可利用性。徐盈等^[24]发现一定浓度的HA能够降低甲氰菊酯的生物可利用性及其对草鱼的急性毒性，而且在HA浓度为10 mg·L^-1时这种影响比5 mg·L^-1时更大。而本研究并未得到类似结果，虽然5 mg·L^-1 HA对扑草净的毒性影响不大，但当扑草净浓度大于或等于96 h LC₅₀（7.488 mg·L^-1）时，15 mg·L^-1 HA的存在增加了扑草净的毒性，并且这一结果在48～72 h表现最显著。这与Meems等^[25]的研究结果有相似之处，他们发现在两种低浓度（5 mg·L^-1）的DOM（天然有机质和合成腐殖质HS1500）存在时，能降低氯氰菊酯对大型蚤（Daphnia magna）的毒性，而在50 mg·L^-1浓度时含有合成腐殖质HS1500组比没有DOM存在时大型蚤活动抑制的比率增加50%。Oikari等^[26]采集5种天然水作为不同浓度和性质的DOM来源（浓度为4.6～20.3 mg·L^-1），发现在这些DOM存在条件下，氰戊菊酯对大型蚤的48 h急性毒性效应均增加。另外，还发现在20.3 mg·L^-1 DOM（采自Lake Louhilampi）存在时，林丹和氰戊菊酯对大型蚤的48 h急性毒性效应分别增加了4.6、3.6倍。本试验中HA增加扑草净毒性可能是由于DOM降低污染物生物可利用性的能力仅在低污染物浓度下显示出作用，而并非在高浓度下。因此，在较高浓度的扑草净（大于LC₅₀值）与DOM共存时，减少污染物毒性的络合机制被其他能够引起毒性增加的机制所掩盖，例如DOM中含有的醌型和芳香族结构会提高生物体内抗氧化酶的活性，已有研究发现天然DOM可以引起生物体内谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和氧化物酶（POD）的升高^{[25, 27]}，而这些活性物质可能会调节污染物在生物体内的代谢，从而增加污染物的毒性。另外，DOM可能会促进毒物更快进入生物体内，表现为更早出现死亡。Steinberg等^[28]曾假设DOM可能会通过干扰细胞膜的通透性来增加在鱼体内的富集。

有研究报道DOM对多种水生生物有不利影响^[29]，如其诱导热休克蛋白^[23]、激活谷胱甘肽-S-转移酶（sGST）^[30]和细胞色素氧化酶（CYP1A）^[31]或改变生物行为等。Wiegand等^[23]发现三种不同来源的天然DOM在5 mg·L^-1时不能使带丝蚓（L. variegates）体内sGST增加，而在25 mg·L^-1时sGST较不含DOM组明显增加，同时两个浓度均能引起带丝蚓体内过氧化氢酶和热休克蛋白水平的明显增加。此外，1、5、10、50 mg·L^-1 DOM（天然可溶性有机质SR NOM和人工合成有机质HS1500）的存在均能引起大型蚤（Daphnia magna）体内sGST的显著性增加^[25]。在HA对斑马鱼的96 h急性毒性试验中，15 mg·L^-1的HA增加了斑马鱼体内MDA浓度，并且与空白组有显著性差异，5 mg·L^-1 HA组则与空白组无明显差异（图 3）。这一结果与扑草净和HA共存对斑马鱼的毒性结果相对应。

不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05） Different letters indicate the significant differences between treatments（P<0.05） 图 3 HA对斑马鱼体内丙二醛的影响 Figure 3 Effect of HA on MDA in zebrafish

图选项

有机化合物的紫外-可见光吸收光谱（Uv-Vis）常被用作结构分析的依据。在225～320 nm波长范围内扑草净单独存在组以及5 mg·L^-1和15 mg·L^-1 HA存在的各组中，溶液的吸光度随扑草净浓度的增加而增加，即扑草净引起了HA吸收峰发生红移效应（图 4）。张芹等^[32]研究发现吸收峰的红移效应可能与化合物分子间的结合相关。扑草净与HA共存产生的结合作用可能与毒性增加的结果有关，具体机制有待进一步研究。本文只考虑了HA存在下扑草净对斑马鱼的急性毒性，在未来的研究中将考虑HA影响扑草净对斑马鱼的慢性毒性，例如HA存在下扑草净对斑马鱼体内相应功能酶及扑草净在斑马鱼体内的富集变化情况等。　

图 4 扑草净和扑草净-HA在水溶液中的紫外-可见光吸收光谱图 Figure 4 Uv-Vis absorption of prometryn and prometryn-HA solution

图选项

（1）扑草净对斑马鱼的96 h LC₅₀为7.448 mg·L^-1，95%置信区间为7.032～7.971 mg·L^-1。表明扑草净对斑马鱼的毒性属于高毒，对其他水生生物也存在潜在危害。

（2）在HA影响扑草净对斑马鱼急性毒性的试验中，Ⅰ组（P_6.5，P_6.5+HA₅和P_6.5+HA₁₅）、Ⅱ组（P_7.5，P_7.5+HA₅和P_7.5+HA₁₅）和Ⅲ组（P_8.5+HA₁₅，P_8.5和P_8.5+HA₅）中5 mg·L^-1 HA对扑草净的毒性没有显著性影响，而在Ⅲ组中，15 mg·L^-1 HA能够显著增加扑草净对斑马鱼的急性毒性。另外，Ⅱ组和Ⅲ组进入快速死亡期（48～72 h）的时间比Ⅰ组（72～96 h）早，也表明在较高浓度扑草净条件下，HA对毒性的影响机制有所不同。