近年来，随着工业的快速发展以及化肥的过度使用，土壤、水体等受到了不同程度的重金属污染^[1]。我国受重金属污染的耕地面积近2000万 hm²，约占耕地面积的1/5^[2]。土壤中的重金属能够被植物吸收，并通过作物生产进入食物链，对人类健康造成巨大的威胁。镉（Cd）是毒害性较大的重金属元素之一，在较低浓度时就可以影响植物的光合、呼吸、氮代谢以及营养元素的吸收等代谢活动，严重时甚至导致植株死亡。小白菜（Brassica chinensis L.），又称青菜、不结球白菜等，是含矿物质和维生素较丰富的蔬菜之一，在我国南北方各地栽培十分广泛。因此，研究小白菜对Cd胁迫的生理响应和调控措施具有重要意义。

硫是植物生长的必需营养元素，被称为仅次于氮、磷、钾的第四要素，在植物的生长发育和逆境应答过程中起着重要作用^[3]。近年来的研究表明，硫参与植物对重金属胁迫的应答。Zhong 等^[4]在砷污染的土壤中施入硫肥，可明显提高油菜籽产量，同时减少油菜籽粒中的砷含量；王云等^[3]研究表明，0.5 mmol·L^-1硫能明显促进低水平Cd毒害下小麦幼苗叶和根的生长，增加幼苗中叶绿素含量，提高硝酸还原酶活性，但对高水平Cd毒害的缓解效应不显著；衣纯真等^[5]在Cd污染的水稻田土施入K₂SO₄肥，能显著降低水稻对Cd的吸收，降低水稻茎、谷壳以及糙米中的Cd含量。李会合^[6]研究发现增硫处理可提高Cd胁迫下超积累东南景天叶片的抗氧化酶活性，增强活性氧清除能力，缓解Cd胁迫下自身的膜脂过氧化程度；Zhang等^[7] 和孙惠莉等^[8] 研究表明，镉硫交互处理明显增加了水稻和小白菜幼苗体内非蛋白巯基、谷胱甘肽和络合素含量以及抗坏血酸-谷胱甘肽循环关键酶的活性，从而提高植株对Cd胁迫的耐受性。目前关于外施硫对Cd胁迫下小白菜Cd富集转运、光合特性及渗透调节物质的影响还不是十分清楚。本研究通过室外盆栽试验，探讨外施硫对不同Cd处理水平下小白菜生长、Cd吸收转运、光合特性以及渗透调节物质含量的影响，揭示硫缓解Cd毒害的生理机制，为硫素在缓解植物重金属毒害方面的应用提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 供试材料

供试小白菜（Brassica chinensis L.）品种为“七宝青”，种子购于南京秋田种业有限公司。 1.2 试验设计

盆栽试验于2014 年5—6 月在西北农林科技大学生命科学学院网室内进行，试验期间大气温度变化见图 1。供试土壤取自陕西关中地区大田耕作层土（0～20 cm），属旱耕土垫人为土（红油土）。土壤基本理化性质为：pH 8.02，有机质12.57 g·kg^-1，速效氮64.29 mg·kg^-1，速效磷19.58 mg·kg^-1，速效钾78.62 mg·kg^-1，全硫138.42 mg·kg^-1，有效硫7.24 mg·kg^-1，总镉0.13 mg·kg^-1。土壤风干后过5 mm筛，装入聚乙烯塑料盆（18 cm×15 cm）中，每盆装土2.5 kg，以溶液形式均匀喷洒施入CdCl₂·2.5H₂O和Na₂SO₄，镉硫交互处理，根据前期试验和文献数据共设9 个处理水平（试验因素与水平见表 1），每个处理水平均设置4 次重复。装盆前每千克干土施尿素0.324 g，磷酸二氢钾1.25 g，氯化钾0.158 g。搅拌均匀，平衡4 周。挑选籽粒饱满的小白菜种子播种，每盆播种10 粒，待植株生长至3 片真叶间苗至5 株。根据小白菜生长需要，通过称重法用去离子水浇灌使土壤含水量保持在田间最大持水量的70%，并及时去除杂草和虫害。生长30 d后收集全部植株，测定各项生理指标。

图 1 试验期间大气温度变化 Figure 1 Temperature dynamics during pot experiment

图选项

表 1 试验因素与水平 Table 1 Experimental factors and levels

表选项

土壤pH测定采用电位法（水∶土= 2.5∶1）^[9]；有机质含量测定采用重铬酸钾容量法^[9]；速效氮含量测定采用0.01 mol·L^-1 NaCl浸取、酚二磺酸比色法^[9]；速效磷含量测定采用0.5 mol·L^-1 NaHCO₃浸取、钼锑抗比色法^[9]；速效钾含量测定采用1.0 mol·L^-1 乙酸铵浸取、火焰光度法^[9]；全硫含量测定采用Mg（NO₃）₂氧化-BaSO₄比浊法^[10]；有效硫含量测定采用0.5 mol·L^-1 NaHCO₃浸取，比浊法^[11]。 1.3.2 生物量测定

取植株样，用自来水反复冲洗，再用20 mmol·L^-1 Na₂-EDTA浸泡15 min，以除去根表面吸附的Cd²⁺，最后用去离子水洗净，吸水纸吸干多余水分。将植株分为地上部和根部，105 ℃杀青15 min，于80 ℃烘干至恒重，称取干重。 1.3.3 植株和土壤中镉含量测定

取小白菜地上部和根部干样，磨碎混匀，称取0.2 g样品加入 HNO₃-HClO₄（4∶1，V/V）混合酸，定容至10 mL，220 ℃沙浴消解至透明色，采用火焰原子吸收分光光度计（Z-2000赛曼，日立公司）测定Cd含量。土壤风干后机械粉碎，过100目筛，称取2.0 g土壤样品于锥形瓶中，加入少许去离子水湿润，然后加入15 mL HNO₃，于电热板上缓慢加热分解，并加以回流，蒸至近干；稍冷后加入HNO₃-HClO₄（4∶1，V/V）10 mL，220 ℃沙浴消解，蒸至近干；稍冷却后反复加入10 mL HNO₃，待样品蒸至近灰白色，定容至25 mL，上清液用火焰原子吸收分光光度计测定土壤Cd含量^[9]。 1.3.4 各项生理指标测定

选取小白菜植株从第1 片展开叶向下数的第4 片成熟功能叶进行相关生理指标的测定：叶片色素含量测定参照高俊凤的丙酮浸取法^[12]；叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO₂浓度的测定采用便携式光合仪（Li-6400XT，美国），测定选择在晴天上午9：00—11：30进行，测定过程中光强1000 μmol·m^-2·s^-1，大气温度26 ℃，大气CO₂浓度390 μmol·mol^-1；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法^[12]；可溶性糖含量测定根据赵世杰等^[13]的方法；脯氨酸含量测定采用磺基水杨酸法^[12]；抗坏血酸含量测定采用2，6－二氯靛酚比色法^[14]。 1.4 数据分析与处理

每个指标测定均重复3次。采用Excel 2007进行数据处理，SPSS17.0 软件进行统计分析，通过最小显著法（LSD）检验差异显著性水平（P<0.05）。计算公式如下^[15]：

耐受指数（TI）=Cd处理植株的生物量/ 对照植株的生物量×100%

生物富集系数（BCF）=植株组织中Cd含量/土壤中Cd含量

转运系数（TF）=植株地上部Cd含量/植株根部Cd含量 2 结果与分析 2.1 外施硫对镉胁迫下小白菜生长特性的影响

由表 2可知，Cd胁迫对小白菜的生长具有显著地抑制作用。随着Cd处理水平的增加，小白菜生长受到的抑制程度亦逐渐加重，其株高、地上部和根部的干重均呈下降趋势。与CK相比，Cd100处理水平下，小白菜株高、地上部和根部干重分别降低了43.21%、60.01%和57.65%，降幅最大。与单一Cd处理相比，Cd5和Cd25处理水平下，外施硫明显促进了Cd胁迫下小白菜的生长，其株高分别增加了11.14%和21.16%，地上部干重分别增加了22.55%和19.90%，根部干重分别增加了27.83%和20.29%。而Cd50和Cd100处理水平下，外施硫对小白菜生长的影响差异均不显著。

表 2 外施硫对镉胁迫下小白菜株高、 干重及耐受指数的影响 Table 2 Effects of sulfur on plant height,dry mass and tolerance index （TI）of pakchoi under Cd stresses

表选项

耐受指数（TI）能够反映植物对重金属的耐受性，TI越大表明植物对重金属的耐受性越强。不同Cd处理水平下（Cd50除外），地上部干重的降幅均大于根部，说明小白菜地上部对Cd更敏感。与单一Cd处理相比，Cd5、Cd25和Cd50处理水平下，外施硫对小白菜根部生长的促进作用大于地上部，根部TI分别增加了27.83%、20.29%和16.68%，地上部TI分别增加了22.55%、19.90%和15.24%。而Cd100处理水平下，外施硫对小白菜地上部生长的促进作用大于根部，地上部和根部TI分别增加了16.25%和11.80%。 2.2 外施硫对镉胁迫下小白菜Cd富集转运的影响

由表 3可知，与CK相比，不同Cd处理水平下小白菜地上部和根部Cd大量累积，且随着Cd处理水平的增加小白菜地上部和根部的Cd含量呈升高趋势。与单一Cd处理相比，外施硫促进了小白菜根部对Cd 的吸收，降低了地上部的Cd含量。Cd25处理水平下，外施硫小白菜地上部Cd含量显著降低了24.82%，而其他Cd处理水平下，外施硫对地上部Cd含量的影响差异均不显著。Cd25和Cd50处理水平下，外施硫小白菜根部Cd含量显著增加了23.94%和13.47%，而其他Cd处理水平下，外施硫对根部Cd含量的影响差异均不显著。

表 3 外施硫对镉胁迫下小白菜地上部和根部 Cd 含量、 生物富 集系数 （BCF） 和转运系数 （TF） 的影响 Table 3 Effects of sulfur on Cd content,BCF and TF in shoot and root of pakchoi under Cd stresses

表选项

生物富集系数（BCF）能够反映植物对土壤中重金属的富集能力。由表 3可知，小白菜根部BCF明显高于地上部，表明根部是Cd的主要富集部位。随着Cd处理水平的增加，小白菜地上部和根部BCF均呈下降趋势。与单一Cd处理相比，外施硫小白菜地上部BCF降低了6.96%～25.46%，根部BCF增加了0.53%～35.76%。

转运系数（TF）能够反映植物根部从土壤中吸收重金属元素后向地上部的转运能力。随着Cd处理水平的增加小白菜TF呈下降趋势。与单一Cd处理相比，外施硫进一步降低小白菜TF，且在Cd25处理水平下TF值最小，为29.97%。 2.3 外施硫对镉胁迫下小白菜叶片色素含量的影响

由图 2可知，随着Cd处理水平的增加，小白菜叶片中叶绿素a、叶绿素b和叶绿素（a+b）含量均呈下降趋势。外施硫可不同程度提高Cd胁迫下叶片中的叶绿素含量，且在Cd25处理水平下，外施硫小白菜叶片叶绿素a、叶绿素b和叶绿素（a+b）含量分别增加了8.44%、53.57%和15.13%，差异显著。而Cd5处理水平下，外施硫小白菜叶片中叶绿素b和叶绿素（a+b）含量分别显著增加了46.32%和11.81%，叶绿素a含量变化不明显。Cd50处理水平下，外施硫小白菜叶片中叶绿素b含量显著增加了49.02%，而叶绿素a和叶绿素（a+b）含量变化不明显。Cd100处理水平下，外施硫小白菜叶片中叶绿素b和叶绿素（a+b）含量分别显著增加了70.68%和13.92%，而叶绿素a含量变化不明显。

图 2 外施硫对镉胁迫下小白菜叶片叶绿素和类胡萝卜素含量的影响 Figure 2 Effects of sulfur on chlorophyll and carotenoid content in leaves of pakchoi under Cd stresses

图选项

类胡萝卜素含量随着Cd处理水平的增加呈先升后降趋势（图 2）。与CK相比，Cd5处理水平下，类胡萝卜素含量显著增加了15.85%。与单一Cd处理相比，Cd25处理水平下，外施硫小白菜叶片中类胡萝卜素含量显著增加了25.44%，而其他Cd处理水平下，外施硫对类胡萝卜素含量的影响差异均不显著。 2.4 外施硫对镉胁迫下小白菜叶片光合特性的影响

由图 3可知，与CK相比，Cd胁迫下小白菜叶片光合作用受到明显抑制。随着Cd处理水平的增加，小白菜叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）均呈下降趋势，而胞间CO₂浓度（Ci）则呈升高趋势，外施硫有效缓解了Cd胁迫对小白菜叶片光合作用的抑制。与单一Cd处理相比，Cd5和Cd25处理水平下，外施硫小白菜叶片Pn、Gs和Tr分别增加了13.15%、13.81%、11.61%和15.22%、15.42%、17.39%，差异显著。而Cd50和Cd100处理水平下，外施硫对小白菜叶片Pn、Gs和Tr的影响差异均不显著（Cd50处理水平下Tr除外）。不同Cd处理水平下，外施硫均能明显降低小白菜叶片Ci。

图 3 外施硫对镉胁迫下小白菜叶片净光合速率、 气孔导度、 蒸腾速率和胞间 CO2 浓度的影响 Figure 3 Effects of sulfur on net photosynthetic rate,stomatal conductance,transpiration rate and intercellular CO2 concentration of pakchoi under Cd stresses

图选项

由图 4可知，小白菜叶片可溶性蛋白、可溶性糖以及抗坏血酸含量均随着Cd处理水平的增加呈先升高后降低趋势。与CK相比，Cd5处理水平下，小白菜叶片可溶性糖和抗坏血酸含量分别显著增加了20.35%和10.46%，而可溶性蛋白含量增加不明显。外施硫可不同程度提高Cd胁迫下小白菜叶片可溶性蛋白、可溶性糖和抗坏血酸的含量，且在Cd25处理水平下，外施硫可溶性蛋白、可溶性糖以及抗坏血酸含量分别增加了20.82%、23.34%和25.72%，差异显著。与单一Cd处理相比，Cd5处理水平下，外施硫小白菜叶片抗坏血酸含量显著增加了10.16%，可溶性蛋白和可溶性糖含量变化不明显。Cd50处理水平下，外施硫可溶性糖含量显著增加了10.74%，可溶性蛋白和抗坏血酸含量变化不明显。而Cd100处理水平下，外施硫对小白菜叶片可溶性蛋白、可溶性糖以及抗坏血酸含量的影响差异均不显著。

图 4 外施硫对镉胁迫下小白菜叶片可溶性蛋白、 可溶性糖、 脯氨酸和抗坏血酸含量的影响 Figure 4 Effects of sulfur on soluble protein,soluble sugar,proline and ascorbate content in leaves of pakchoi under Cd stresses

图选项

与CK相比，Cd胁迫显著增加了小白菜叶片的脯氨酸含量，且随着Cd处理水平的增加，脯氨酸含量呈先升高后降低趋势（图 4）。与单一Cd处理相比，Cd5和Cd25处理水平下，外施硫小白菜叶片脯氨酸含量显著增加了47.37%和26.79%，而Cd50和Cd100处理水平下，外施硫对小白菜叶片脯氨酸含量的影响差异均不显著。 3 讨论

Cd具有很强的毒性和生物迁移性，可对植物产生多种伤害。生物量的变化是植物对Cd胁迫响应的综合体现。研究表明，外施硫能有效缓解Cd胁迫对小麦^[3]、水稻^[7]和菜豆^[16]等植物生长的抑制。本研究中，不同Cd处理水平下，小白菜地上部和根部的生长均受到抑制，且处理水平越高抑制效应越明显。外施硫可明显缓解Cd5和Cd25处理水平对小白菜生长的抑制作用，而对Cd50和Cd100处理水平的缓解效应不明显，说明硫对Cd胁迫的缓解存在一定的剂量效应。此外，外施硫对Cd胁迫下小白菜地上部和根部生长的促进作用有所差别。Cd5、Cd25和Cd50处理水平下，外施硫对小白菜根部生长的促进作用大于地上部，可能是由于低Cd处理水平下根部吸收进入小白菜体内，合成较多的非蛋白巯基化合物以抵抗Cd胁迫，而SO₄^2-需要根部向上运输才能到达地上部发挥作用。Cd100处理水平下，外施硫对小白菜地上部生长的促进作用大于根部，可能是根部Cd大量累积，为地上部Cd含量的1.98 倍，超过了小白菜自身的解毒能力。

硫及其代谢影响重金属在植物体内的生化进程。一方面，硫通过直接氧化还原或间接释放金属配位体影响重金属的有效性和植物吸收累积量；另一方面，土壤或水体中的含硫功能团能够与重金属形成高亲和稳定的化合物^[17]。目前关于硫对Cd在植物体内富集转运的影响存在多种看法。衣纯真等^[5]研究发现施用K₂SO₄肥能减少水稻茎、谷壳以及糙米对Cd的吸收；Zhang 等^[7]研究发现外施硫能抑制Cd在水稻根部的累积，促进Cd向地上部的转运；李会合等^[18]研究表明增硫处理显著提高超积累东南景天根、茎和叶的Cd含量、累积量及整株累积总量；安志装等^[19]研究表明随着供硫浓度的升高，水稻叶片中Cd含量显著增加，根中Cd含量先增加后降低，而茎中Cd含量则显著降低，硫可促进根部和茎部累积态Cd向叶部的转运。本研究中，小白菜BCF和TF均随着Cd处理水平的增加呈下降趋势，可能是由于随着Cd毒害的加剧，根部细胞结构被破坏，影响了根部吸收Cd以及由根部向地上部转运的能力。外施硫可明显提高根部BCF，表明外施硫可促进根部对Cd的累积，可能是外施硫导致土壤pH下降，增大了土壤中Cd的生物有效性和迁移性，从而提高植物对Cd的提取效率^[17]。而外施硫小白菜TF和地上部BCF明显降低，表明硫可减少Cd向地上部的转运，降低小白菜地上部Cd含量，硫对Cd从根部向地上部的运输有拮抗作用。

叶绿素含量与植物光合作用强度密切相关。Cd胁迫可抑制叶绿素合成并加快叶绿素降解。本研究中，Cd胁迫下小白菜叶片叶绿素含量明显降低；类胡萝卜素含量随着Cd处理水平的增加呈先升高后降低趋势，可能与类胡萝卜素参与植物体内活性氧的清除有一定关系。Cd25处理水平下，外施硫小白菜叶片中色素含量显著提高，推测其原因可能为：①外施硫降低了Cd胁迫下小白菜地上部Cd含量，减轻Cd对叶绿体基粒垛叠结构的破坏；②外施硫提高了Cd胁迫下小白菜叶片抗氧化酶活性，增强活性氧清除效率，缓解活性氧对叶绿体色素蛋白复合体和酶的破坏^[20]。这表明外施硫有助于提高小白菜叶绿体结构的稳定性，对色素具有保护效应。

光合作用是植物有机物累积和能量获取的根本途径。本研究中，Cd胁迫显著降低了小白菜叶片Pn。Farquhar等^[21]认为，Pn降低有气孔限制和非气孔限制两方面因素。当Pn、Gs和Ci同时下降，Pn的降低主要是由气孔限制因素引起的，否则Pn的降低归因于非气孔限制因素。本研究中，Cd胁迫下小白菜叶片Pn、Gs和Tr均下降，而Ci升高，说明Pn降低主要是由非气孔限制因素引起，即由叶肉细胞光合活性下降引起，这也与叶绿素含量的变化趋势相吻合。Cd5和Cd25处理水平下，外施硫小白菜叶片Pn、Gs和Tr均显著升高，同时Ci明显降低，说明外施硫能有效缓解Cd胁迫对小白菜叶片的非气孔限制，提高叶绿素和类胡萝卜素含量，从而维持叶片较高的光合能力。

可溶性蛋白是植物体内重要的渗透调节物质，同时可溶性蛋白的降解也是植物受重金属胁迫的最显著特征之一。本研究中，随着Cd处理水平的增加，小白菜叶片可溶性蛋白含量呈先升后降趋势。这与前人在桐花^[22]、秋茄^[23]和龙葵^[24]上的研究结果相似，可能由于低Cd处理水平诱导小白菜产生多种逆境蛋白或金属硫蛋白，以解除毒害；而高Cd处理水平下，地上部累积的过多的Cd破坏了叶绿体结构的完整性，由于叶片中有70%的蛋白质存在于叶绿体中，从而导致可溶性蛋白含量下降^[22]。本研究中，外施硫显著降低了Cd25处理水平下小白菜地上部的Cd含量，从而减轻Cd对叶绿体结构的破坏，提高了Cd胁迫下小白菜可溶性蛋白的含量。

可溶性糖是植物体内能量的储存者，也是植物合成其他有机物的起始物质，还是植物体内重要的渗透调节物质^[25]。研究表明，适度加硫可提高植物中的可溶性糖含量^{[26, 27, 28]}。本研究中，Cd25和Cd50处理水平下，外施硫显著增加了Cd胁迫下小白菜叶片可溶性糖的含量，可能是由于外施硫增强了叶片的光合作用，促进了光合产物的合成和累积。

脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，也是水溶性最大的氨基酸（162.3 g·L^-1，25 ℃），除了作为渗透调节物质以外，同时具有保护蛋白质、生物膜、亚细胞结构的完整性以及活性氧自由基的清除等功能，在保护植物细胞免受重金属胁迫伤害中起到非常重要的作用^{[29, 30, 31]}。本研究中，随着Cd处理水平的增加，小白菜叶片的脯氨酸含量呈先升高后降低趋势，但均显著高于对照组（CK），脯氨酸含量增加是小白菜适应重金属Cd胁迫的一种自身调节机制，有利于保持细胞渗透平衡、清除过量累积的活性氧自由基、保护细胞膜结构和功能的完整性、调节细胞氧化还原势以及维持PSⅡ的电子传递，提高植株对Cd胁迫的耐受性。Khan等^[30]研究表明，添加硫能够增加Cd胁迫下小麦幼苗叶片中脯氨酸的累积，通过提高脯氨酸代谢过程中的谷氨酰激酶（GK）活性，降低脯氨酸氧化酶（PROX）活性，从而缓解重金属Cd毒害对小麦幼苗造成的氧化胁迫。本研究也得到类似的结果，Cd5和Cd25处理水平下，外施硫进一步提高了Cd胁迫下小白菜叶片中的脯氨酸含量。

抗坏血酸是抗坏血酸-谷胱甘肽循环中重要的抗氧化物质，能够与谷胱甘肽相偶联增强植物对活性氧的清除能力^{[8, 32]}。本研究中，小白菜叶片抗坏血酸含量随着Cd处理水平的增加呈先升高后降低趋势，可能低Cd处理水平下，抗坏血酸含量增加是其对逆境的一种应激和自我保护反应，从而去适应逆境并再次建立活性氧自由基产生与清除之间的平衡关系；高Cd处理水平下，活性氧自由基水平爆发，抑制了抗坏血酸的合成。本研究中，低Cd处理水平（Cd5、Cd25）下，外施硫显著增加了Cd胁迫下小白菜抗坏血酸含量，可能镉硫交互处理能够保持较高且相对协调平衡的抗坏血酸过氧化物酶、脱氢抗坏血酸还原酶、谷胱甘肽还原酶和单脱氢抗坏血酸还原酶活性以及高水平的抗坏血酸含量，从而较好地维持抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统的完整性^[8]。 4 结论

（1）与对照相比，Cd胁迫下小白菜地上部和根部Cd含量显著增加，明显抑制了小白菜的生长和光合作用。同时，随着Cd处理水平的增加，小白菜叶片中渗透调节物质（可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸）及抗坏血酸的含量呈先升高后降低趋势。

（2）外施50 mg·kg^-1硫可不同程度缓解Cd胁迫对小白菜生长的毒害，尤其对25 mg·kg^-1 Cd处理水平的缓解效果最为显著，能明显促进小白菜的生长和光合作用，减少Cd从根部向地上部转移，降低小白菜地上部Cd含量，显著增加叶片中渗透调节物质及抗坏血酸的含量。此外，外施硫也明显促进了5 mg·kg^-1 Cd处理水平下小白菜的生长和光合作用，显著增加叶片中脯氨酸和抗坏血酸含量，而50、100 mg·kg^-1 Cd处理水平的缓解效应并不明显。