重金属镉（Cadmium,Cd）和铬（Chromium,Cr）是生物非必需金属元素，由于工业生产和农业实践，许多农田受其污染^[1]，重金属通过作物根部吸收并传输到体内，可造成幼叶失绿、植株矮小、根损伤等中毒症状，严重时直接导致死亡^[2]。Cd、Cr对植物的毒性诱导其体内产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）^{[3, 4]}，这是一个复杂的胁迫响应过程。近年来，研究发现一些作物受到Cd或Cr胁迫时，产生大量过氧化氢（Hydrogen peroxide，H₂O₂）并增强膜脂质过氧化作用^{[5, 6]}。而质膜NADPH氧化酶是最重要的H₂O₂酶源，它将电子从细胞质的NADPH转移给O2形成O-2·，随后又生成H₂O₂和·OH^[7]，且NADPH氧化酶在植物生长发育、防卫和响应金属（包括Cu、Fe、Zn、Cd）缺乏或过量等过程中起重要作用^{[8, 9, 10, 11]}。

谷子[Setaria italica（L.） P. Beauv.]是我国北方重要谷类作物，具有耐逆性强、适应性广等特性。2012年，Nature杂志发表两篇谷子全基因组序列文章，加快了谷子抗逆机制的研究步伐^{[12, 13]}。国内外有关重金属对谷子生长发育毒害作用的报道甚少，研究发现在Pb、Cu胁迫下不同基因型谷子幼苗的DNA稳定性、生长状态和吸收积累存在差异^{[14, 15]}，而Cd、Cr胁迫对谷子幼苗的毒理效应和NADPH氧化酶的影响目前还未见报道。本文在实验室条件下，研究了高/低浓度Cd、Cr 胁迫对谷子幼苗生长状态、H₂O₂、叶绿素、丙二醛含量和NADPH氧化酶及ROS相关酶活性的影响，旨在探讨谷子响应重金属胁迫的机理。

供试谷子品种为晋谷21号，购买于山西省农科院谷子所。

种子经75%的乙醇溶液消毒1 min，6%的次氯酸钠消毒10 min，用去离子水冲洗3次，23 ℃黑暗浸泡24 h。然后播种于铺有三层纱布的有盖培养皿中，于23 ℃黑暗萌发2 d后，转入培养条件（光强度160 μE·m^-2·s^-1，光暗周期16 h/8 h，相对湿度60%）进行以下不同的处理：

种子萌发2 d后，用10 mL不同浓度的镉（0、50、1000 μmol·L^-1 CdCl₂）或铬（0、50、1000 μmol·L^-1 K₂Cr₂O₇）的1/4 Hoagland营养液处理幼苗，每天更换1次处理液，生长7 d后测定其株高、根长、H₂O₂含量、叶绿素含量及MDA含量。

种子萌发2 d后，转入光照培养条件下生长，每天更换1次营养液，7 d后用10 mL不同浓度的镉（0、50、1000 μmol·L^-1）或铬（0、50、1000 μmol·L^-1）的1/4 Hoagland营养液处理幼苗24 h，检测rboh D/F（Sirboh D/F）基因的表达水平和NADPH氧化酶及ROS相关酶的活性。

1/4 Hoagland营养液为硝酸钙 945 mg·L^-1、硝酸钾 607 mg·L^-1、磷酸铵 115 mg·L^-1、硫酸镁 493 mg·L^-1、铁盐溶液 2.5 mL·L^-1、微量元素 5 mL·L^-1，pH6.0。

谷子幼苗整株取出，蒸馏水冲洗后，测量幼苗的株高、根长（以20株幼苗平均值计，mm）。叶绿素含量采用96%乙醇提取法测定^[16]。MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定^[17]。H₂O₂含量通过检测过氧化钛复合物在410 nm的吸光值计算^[18]。

分别提取谷子幼苗叶片和根的粗酶液，5000 r·min^-1离心3 min，取上清液测定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD，EC 1.15.1.1），过氧化物酶（Peroxidase，POD，EC 1.11.1.7），过氧化氢酶（Catalase，CAT，EC 1.11.1.6）和抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX，EC 1.11.1.11）的活性。酶活测定参照Lata等^[19]的方法；NADPH 氧化酶活性的测定参照GENMED试剂盒（杰美基因 GMS50096.3）。

取适量二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）染液（1% DAB溶于10 mmol·L^-1 MES缓冲液，pH 6.5）加入预处理的叶片，28 ℃避光保存8 h，蒸馏水冲洗3次，加入无水乙醇沸水浴直到叶片完全脱色为止；再次更换无水乙醇，置4 ℃冰箱保存一段时间后观察并拍照^[3]。

不同处理的谷子幼苗离体根尖用蒸馏水冲洗后，置于0.25%（W/V）伊文思蓝溶液染色5 min，然后再用蒸馏水冲洗3次，制片观察并拍照^[3]。

取适量不同处理的谷子幼苗叶片和根，用RNAiso Plus提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行检测，用2^-△△Ct法分析基因表达水平。qRT-PCR特异性引物见表 1，引物由上海生工生物工程股份有限公司（Sangon）合成。

表 1 qRT-PCR特异性引物 Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR

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所有数据均采用3个生物学重复的平均值，差异显著性分析采用SPSS 13.0（IBM，New York，USA）软件进行Duncan检验，然后用SigmaPlot 10.0（Systat Software Inc.，London，UK）软件作图。

图 1A显示，萌发一致的谷子幼苗经低浓度（50 μmol·L^-1）的Cd、Cr处理7 d后，与对照组相比，幼苗变矮，根变短；高浓度（1000 μmol·L^-1）的Cd、Cr显著抑制幼苗植株和根的生长，导致植株矮小、叶片卷曲、根减小。统计分析（表 2）可知，Cd、Cr处理后谷子幼苗株高和根长显著减小（P < 0.05）。叶片中过氧化氢DAB染色表明，低浓度的Cd、Cr诱导红褐色斑点产生于叶尖和叶脉，而高浓度的Cd、Cr处理使整个叶片产生大面积斑点（图 1B）。与对照组相比，不同浓度的Cd、Cr均可显著诱导谷子幼苗产生H₂O₂（表 2）。在根尖染色观察发现，与低浓度处理相比，高浓度Cd、Cr胁迫后根尖细胞染色较深（图 1C）。

图 1 镉、铬对谷子生长影响 Figure 1 Effects of Cd or Cr stresses on plant growth

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表 2 镉、铬处理下谷子幼苗的株高、根长、过氧化氢含量 Table 2 Plant height，root length，and H₂O₂ concentration of foxtail millet seedlings with Cd or Cr treatments

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与对照组相比，高浓度Cd、Cr使根中的MDA含量显著升高（P < 0.05），低浓度胁迫也可导致根中MDA含量升高，但差异不显著；而叶片中高/低浓度Cd、Cr处理后MDA含量都升高，但只有高浓度Cr处理后具有显著差异性（P < 0.05）。与对照组相比（表 3），叶绿素含量随着重金属Cd、Cr浓度的升高而下降，具有显著性差异（P < 0.05）。

表 3 镉、铬处理下谷子幼苗的总叶绿素和丙二醛含量 Table 3 Chlorophyll and MDA concentrations of foxtail millet seedlings with Cd or Cr treatments

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与对照组相比，7 d谷子幼苗经高/低浓度的Cd、Cr处理24 h后，SOD活性增强。在叶片中，低浓度Cd、Cr显著诱导SOD活性升高；而在幼苗根中，高浓度的Cd、Cr处理显著抑制SOD活性（图 2）。在叶片中，低浓度Cd、Cr显著抑制NADPH氧化酶的活性，而高浓度Cd、Cr处理显著增强NADPH氧化酶的活性（P < 0.05，图 3A）；在根中，各浓度的Cd、Cr均可诱导NADPH氧化酶活性升高，高浓度Cd、Cr处理诱导作用强于低浓度（图 3B）。

图中不同小写字母表示各处理间差异显著(P < 0.05)。下同 Different letters indicate significant differences (P < 0.05) between different treatments. The same below图 2 镉、铬对谷子SOD活性影响 Figure 2 Effects of Cd or Cr stresses on SOD activity

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图 3 镉、铬对谷子NADPH氧化酶活性影响 Figure 3 Effects of Cd or Cr stresses on NADPH oxidase activity

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通过检测NADPH 氧化酶编码基因的表达可知，rboh D（Sirboh D）和rboh F（Sirboh F）两个基因在谷子幼苗叶片和根中均有表达。与对照相比，高浓度Cd处理后根部rboh D表达量增多，低浓度Cd处理后幼苗根和叶片中rboh D基因的表达下调；Cr处理后叶片和根中rboh D表达显著上调（P < 0.05，图 4A）。与对照相比，在低浓度Cd处理后编码NADPH氧化酶的rboh F在叶片和根中的表达下调，在叶片中，高浓度的Cd诱导rboh F基因表达上调，差异显著；不同浓度Cr处理幼苗后，rboh F基因在叶片和根中表达显著上调（P < 0.05，图 4B）。

图 4 镉、铬对谷子NADPH氧化酶编码基因表达量影响 Figure 4 Effects of Cd or Cr stresses on NADPH oxidase encoding genes

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与对照组相比，Cd、Cr处理均可使谷子幼苗叶片和根中POD、CAT和APX活性增强（表 4）。在根中Cd、Cr诱导POD活性高于叶片，而叶片中POD活性随Cd浓度增大显著升高（P < 0.05）；CAT活性在叶片和根中均随重金属浓度的升高而升高；在叶片中，高浓度Cd、Cr处理均可使APX活性显著升高，在根中，高/低浓度Cd诱导APX的活性显著升高（P < 0.05），而Cr仅在高浓度时诱导APX活性升高（P < 0.05）。

表 4 镉、铬处理下谷子幼苗中抗氧化酶的活性（U·mg^-1 protein） Table 4 Activities of anti-oxidative enzymes in foxtail millet seedlings with Cd or Cr treatments（U·mg^-1 protein）

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植物在环境中往往受到各种不利因素的胁迫，如干旱、盐、极端温度和重金属等，在长期进化过程中作物会形成不同的反应机制来应对这些胁迫，同时产生多种中毒症状，包括叶片变形^[17]、叶片失绿、根变短、生长与发育受到抑制^[2]等。本研究证实重金属Cd、Cr对谷子幼苗的根系与叶片的发育产生类似的影响，同时诱发植物产生一系列的生理变化。NADPH氧化酶可通过自身的激活或失活迅速引起ROS的升高或降低，由此产生的ROS充当信号分子来激活机体应答胁迫，可见NADPH氧化酶在作物生长与发育中起重要作用^[8]。近来的研究发现NADPH氧化酶与Cd 及Cr 重金属胁迫关系密切，本研究发现低浓度Cd抑制叶片中NADPH氧化酶活性，该结果与Groppa等^[20]用0.1 mmol·L^-1和0.5 mmol·L^-1 Cd 处理向日葵（Helianthus annuus L.）叶片后NADPH氧化酶活性变化一致。高浓度Cr处理谷子幼苗后，叶片和根中NADPH氧化酶的活性升高，Pandey等^[4]研究发现六价Cr处理豌豆（Pisum sativum L.cv. Azad）根可导致NADPH氧化酶的迅速增高，其机理可能是重金属离子与Ca²⁺竞争性的结合到NADPH氧化酶的EF-hand结构域，从而影响酶的活性，损害根质膜的结构和功能，降低光合作用且阻碍生长^[20]。Fang等^[17]研究发现Cr影响体内Ca²⁺的含量，从而激活谷子编码钙转运蛋白和钙受体基因的表达。植物NADPH氧化酶被预测含有6个跨膜螺旋结构，包含2个血红素结合位点、位于C-端的NADPH和FAD结合位点与N-端2个Ca²⁺结合EF-hand结构域^[21]，使NADPH氧化酶活性增强，产生ROS并诱发多种生理学效应。

Osrboh A是第一个被鉴定的NADPH氧化酶编码基因，之后大量的rboh基因在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）、烟草（Nicotiana tabacum L.）、马铃薯（Solanum tuberosum）、玉米（Zea mays）、西瓜（Citrullus lanatus）、小麦（Triticum aestivum L.）、苜蓿（Medicago sativa）、葡萄（Vitis vinifera）等植物中被报道^[22]。rboh基因在不同植物中的表达存在组织差异性，如Atrboh E、Hvrboh E、Vvrboh E在根中表达，Atrboh F、Hvrboh F1、Hvrboh F2和Atrboh D、Vvrboh D 在所有的组织中均有表达^[22]。本研究发现Sirboh D、Sirboh F基因在谷子幼苗的根和叶片中都有表达。不同浓度的Cd、Cr诱导Sirboh D和Sirboh F基因的表达存在差异性，Sirboh D和Sirboh F在叶片和根中表达规律不同（图 4）。在拟南芥中，基因转录分析显示不同的rboh基因对Cd响应表现出不同的转录变化：rboh F表达是瞬时增加，而rboh C 和rboh D的转录水平不变^[23]。由此推测Cd、Cr诱导Sirboh D和Sirboh F基因表达的差异，存在两方面可能的原因：一方面，Cd、Cr胁迫产生大量ROS，进一步将这一信号传递给不同组织中的转录因子，调节编码NADPH氧化酶基因的表达；另一方面，Cd、Cr胁迫激活体内其他信号分子来调控NADPH氧化酶基因的转录水平。

本研究中发现编码NADPH氧化酶的两个基因Sirboh D和Sirboh F表达水平与其活性不完全显示相关，分析其可能的原因是Sirboh D和Sirboh F表达只反应mRNA转录水平的变化，而酶活则体现蛋白水平，这是两种不同的分子机制，所以Sirboh D和Sirboh F基因的高表达不一定显示出NADPH氧化酶活性的增强。Jakubowska等^[24]研究发现，10 μmol·L^-1 Cd处理黄瓜3 d增加CsRbohF1、CsRbohF2、CsRbohF3和CsRbohJ基因的表达水平，但这并没有导致NADPH氧化酶活性增加。在植物体内NADPH氧化酶和SOD酶参与催化的反应可产生H₂O₂^[25]，但在Cd、Cr胁迫下二者响应存在差异（图 2和图 3）；POD、APX和CAT三种抗氧化酶被认为参与清除体内ROS（O₂^-·、H₂O₂、¹O₂及OH·），且在重金属胁迫下有活性增强的趋势^{[6, 17]}。Cd、Cr显著诱导POD、APX和CAT的活性升高（表 4），从而增强胞内对H₂O₂的清除能力，表明植物体自身能够缓解H₂O₂对机体的氧化损伤^[25]。由此推测，植物在重金属胁迫下，能够通过NADPH氧化酶这条途径来调节ROS代谢，响应重金属胁迫的损伤。

（1）Cd、Cr抑制谷子幼苗生长，并产生一系列生理指标的变化，主要表现为叶绿素含量降低、脂质过氧化作用增强、产生大量的H₂O₂造成植株不同程度的损伤。

（2）Cr胁迫上调Sirboh D和Sirboh F基因表达，Cd仅增加叶片中Sirboh F表达量；低浓度胁迫时SOD活性升高，而高浓度时NADPH氧化酶的活性增强，两者活性的变化在响应Cd、Cr胁迫时存在差异，机体通过增强POD、APX和CAT的活性来应对氧化胁迫，在一定程度上对植物体产生保护作用。