表观遗传修饰是一种不同于核苷酸序列的可遗传信息，主要包括DNA 甲基化和组蛋白修饰，研究发现其在植物生长发育、基因表达调控以及抗逆胁迫中起着至关重要的作用^[1-2]。DNA 甲基化广泛存在于多种有机体中，且多数发生在胞嘧啶第5 碳原子上形成5-甲基胞嘧啶。在植物中，DNA 甲基化是一种普遍现象，20%~30%的基因组胞嘧啶处于甲基化状态，并分布于CG、CHG、CHH位点（H代表A、G 或T）^[3-5]。随着人们对植物DNA 甲基化研究愈来愈关注，开发出众多检测DNA甲基化的方法。根据研究内容和目的的不同，可分为检测全基因组甲基化和位点特异性甲基化两类方法，其中前者主要以高效液相色谱法^[6]、基于甲基化敏感内切酶（如：Methylation sensitive amplifi原cation polymorphism，MSAP^[7]和Methylation-sensitivearbitrarily primed PCR，MSAP-PCR^[8-10]等）和基于Southern 探针杂交（如：CGI array 和cDNA microarray 等）^[2]的方法为主，由于芯片技术需要开发大量探针且成本较高，而高效液相色谱法条件优化较复杂，因此在植物研究中多数使用基于甲基化敏感内切酶的方法。

在位点特异性甲基化研究中，以使用重亚硫酸盐限制酶组合分析[11（] COBRA）、甲基化特异性 PCR^[12]（MSP）和重亚硫酸盐测序法（Bisulfite Sequencing）^[13-15]为主。随着DNA 测序技术发展，由于植物基因组CG含量较高而无法使用焦磷酸测序，重亚硫酸盐测序法的检测效率和准确性均高于COBRA法和MSP法，目前位点特异性甲基化研究中重亚硫酸盐测序法的使用最为广泛^[16-17]。然而，随着该方法在植物上的不断应用，发现其中仍然存在一些较棘手的技术性问题，即DNA 目的片段重亚硫酸盐修饰后扩增结果不理想和测序后甲基化率不稳定，其中涉及引物的设计、PCR条件的优化和Taq酶的选择三个方面^[18]。由于植物基因组CG 含量与动物及人相比较高^[19]，基因组修饰后重复序列过多，导致应用该方法时在设计引物和选择目标区域上会受到极大限制，同时还因所需目的基因区域的范围限制，导致所设计引物的T_m、特异性和稳定性不佳，使其在修饰后的DNA上不易扩增。另外，我们还发现不同的Taq酶对测序后的DNA 甲基化率有明显影响，而这些问题都让植物甲基化研究受到阻碍。因此，本研究从完善方法着手，首次通过分析不同引物设计方式和不同引物扩增体系对甲基化结果的影响，优化植物研究中重亚硫酸盐测序法的实验条件，最终建立一个兼顾实验操作性和结果稳定性的重亚硫酸盐测序法实验体系，为植物的位点特异性甲基化研究提供依据。

1 材料与方法 1.1 植物材料的培养与处理

选用哥伦比亚型拟南芥种子，经10%次氯酸钠消毒后，于灭菌超纯水中4℃浸种24 h打破春化。浸种后在无菌台上将种子转移至灭菌后0.5×MS 培养基（0.5%蔗糖）中，并于21益、10 h光照培养15 d^[9]。

1.2 DNA的提取

将不同培养罐中的幼苗混合，使用北京康为世纪生物科技有限公司的新型植物基因组DNA 提取试剂盒（CW0531）提取混合幼苗地上部DNA，然后使用Eppendorf Biophotometor Plus 检测DNA 含量，根据测定结果上样50 ng DNA进行琼脂糖电泳，用TaKaRaDL2000 DNA Marker 进行含量校准并分装成每管1μg，-70℃冰箱保存。

1.3 重亚硫酸盐测序法

按照说明书使用EZ DNA Methylation-GoldTMKits（Zymo research）修饰100 ng DNA。根据TAIR（www.tair.org）拟南芥DNA 序列数据库，使用Primer 5和Oligo 7 自设计引物PCR 扩增错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6 和MSH7 启动子片段（引物序列及PCR 条件详见“结果与分析”）；扩增产物使用1%琼脂糖（TaKaRa）凝胶电泳检测；目的片段使用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收纯化；纯化后的PCR 片段连接载体后克隆测序（上海英骏生物技术有限公司）。

2 结果与分析 2.1 植物甲基化研究中短引物的设计与应用

由于植物核基因组CG 含量较高，修饰后造成基因组存在大量重复序列使引物特异性降低，因此本实验室为研究胁迫诱导拟南芥幼苗错配修复基因启动子甲基化变异，设计了大量长度在17~30 bp 的正、反向引物，发现其中仅有3对引物MLH1-1F/MLH1-1R、MLH1-410F/MLH1-410R 和MSH6_P6F/MSH6_P6R3（表 1）扩增出所需目的片段，且扩增稳定（图 1）。通过比较引物相关信息，发现这3 对成功扩增的引物，其正向引物的长度和T_m均大于反向引物（表 1），说明在正、反向引物的设计上，需要反向引物的长度短于正向引物，前者可以优先退火结合模板；而正引物较长，可增加引物的特异性，其T_m高于反向引物利于在反向引物扩增后，迅速结合反向引物所在的模板链，最终完成整个PCR 过程。

图 1 表明，在PCR 扩增条件优化上，通过使用多种方式扩增后发现，Touch-down 对于这三种甲基化短引物的扩增均有较好的效果：引物MLH1-1F/MLH1-1R 使用55℃退火30 s，且每个循环降0.5℃，运行17个循环，然后47℃退火30 s运行21 个循环为退火条件；引物MLH1-410F/MLH1-410R 使用55℃退火30s，且每个循环降1℃，运行11 个循环，然后45℃退火30 s运行27 个循环为退火条件；引物MSH6_P6F/MSH6_P6R3 使用56℃退火30 s，且每个循环降0.5益，运行9 个循环，然后52℃退火30 s运行30 个循环为退火条件。

该结果说明，甲基化短引物设计的实现需对应优化PCR 条件，根据正、反向引物的T_m决定Touchdown程序的递降范围，原则上Touch-down 程序退火最高温度设定于正、反向引物T_m之间，不可超过反向引物T_m过多，最低退火温度与最高退火温度之差原则上小于10℃。而且，引物3’端的驻G 需要低于普通PCR 引物，更利于甲基化引物退火后快速引发延伸反应。

结果还发现，虽然引物MSH6_P6F/MSH6_P6R3 能够扩增出较稳定的PCR 产物，且与DNA marker 比较后其片段大小也与目的片段基本相似，但经过克隆测序并与NCBI 数据库比对后发现，所扩增的序列与叶绿体DNA高度同源（图 2），并非所需目的基因MSH6 的PCR 片段。这说明甲基化短引物仍存在弊端，无法避免基因组修饰后导致的引物特异性严重下降。

2.2 植物甲基化研究中长引物的设计与应用

由于甲基化短引物无法避免基因组修饰后导致的引物特异性严重下降，致使PCR 产物可能为非目的片段。为了克服该问题，本研究设计了大量长度为31~50 bp 的长引物。表 2 中提供了部分该实验中的自设计引物，其中覆盖了拟南芥MSH2和MSH7基因的启动子区0~-600，且每个基因含有2 对有效引物，表 2中带“*”号引物为有效引物，其中dMSH2-11F/dMSH2-5R 和dMSH2b-7F/dMSH2b-4R 为MSH2 基因启动子引物，dMSH7-3F/dMSH7-2R 和dMSH7b-4F/dMSH7b-2R 为MSH7基因启动子引物。根据实验结果该4 对引物均为有效扩增（图 3），且经测序比对验证是目的片段。

由于引物长度的加大可以使引物特异性得到很大的提升，正向引物已很难非特异性的结合非对应模板。根据短引物设计所得经验，在设计引物中依然尽量保持反向引物的长度小于正向引物，至少保证绝对不大于正向引物长度。结合表 2 和图 3 结果分析，表明反向引物仅需不大于正向引物，两者T_m仅需相差不大，且有较低的3’端驻G，便可扩增出目的片段。在引物的PCR 程序选择上，通过对各种方式的尝试，最终发现，使用55℃退火30 s、60℃延伸2 min 适合甲基化长引物扩增，而且其特异性和稳定性较高。

表 2 显示，随着引物加长，不可避免的问题便是引物中覆盖了许多可修饰位点，但这些位点是否被修饰未知，因此只能通过使用简并碱基代替。过多的简并会导致引物的特异性和稳定性下降，因此本实验在设计引物时，每个引物均设计成3~6 对简并形式（表 2）。通过比较有效引物和无效引物，在我们成功扩增的4 对引物中，发现并非所有可修饰位点全部简并是最佳的，其3’端需要简并，尤其是3’端的前1/3 部分，然而其前3个碱基不能出现可修饰位点；其他位置的可修饰位点并无明显的规律，一般情况下非5’端连续3个可修饰位点的碱基需要简并，同时连续可修饰位点应避开3’端。

2.3 不同Taq 酶对甲基化率的影响

本实验室对拟南芥错配修复基因的甲基化研究发现，不同的Taq酶对PCR扩增效果和甲基化率有明显的差别。因此本实验选用3种不同类型的Taq酶（表 3）对相同DNA的MLH1基因启动子进行扩增，结果如图 4所示，发现PrimeSTAR ^® HS所得结果的甲基化率远大于其他两种Taq酶，而专为重亚硫酸盐修饰模板扩增开发的EpiTaq^TM HS 比常规的TaKaRaTaq 的甲基化率略高。该结果表明，高保真酶PrimeSTAR^® HS 由于其结果过高并不适合于甲基化研究，而TaKaRaTaq由于其酶能力所限，无法检测出目的片段内全部甲基化变异位点。

3 讨论 3.1 引物设计及优化在植物位点特异性甲基化研究

中的重要性随着分子生物学和生物技术的高速发展，对于一般生物科学研究而言，实验中使用的关键技术已不再是制约，而且各类仪器、技术服务以及试剂盒的开发极大地方便了科学研究并简化了实验过程。因此，实验和研究人员所面临的难题便是课题或实验的设计，以及方法或技术的选择和优化^[20]。对于植物位点特异性甲基化研究而言，其特异性位点的引物设计、选择和优化便是难点。

一方面，由于植物基因组CG 含量较高^[19]，导致经过重亚硫酸盐修饰后基因组重复序列过多，引物结合模板的特异性下降，而且胞嘧啶过多也给设计引物造成较大的困难，因为在指定的区域或范围内，很难找到较优异的引物。另一方面，由于PCR 扩增的模板是修饰过的，与原DNA差异较大，网上并没有相关的数据库，也无法对所设计的引物进行特异性分析（Primer-blast），只有通过PCR 实践检测验证。这些原因均极大地阻碍了实验的进度和研究的开展，导致即使拥有高效的DNA 提取、修饰及纯化的试剂盒，实验却仍然停滞不前。因此，在植物位点特异性甲基化研究中，引物的设计和优化尤为重要。

3.2 植物位点特异性甲基化的引物设计

本实验室主要研究Cd 胁迫下拟南芥的遗传损伤^{[9-10, 21-22]}，其中包括对错配修复基因表观遗传损伤的研究，并为此设计了大量的引物。然而经PCR 扩增检验的结果并不理想，约20 余对短引物（17~30 bp）中，仅有3对成功扩增（表 1）。通过整理引物并总结经验，我们发现主要原因在于引物的特异性上，由于引物长度较短，修饰的DNA 重复序列高，导致引物的非特异性极高，这便使目的片段很难扩增。然而根据这些所设计引物，我们对有效引物和失败引物进行了比较分析，得到了一些有用的经验。我们发现正向引物的长度和T_m需要大于反向引物，且3’端驻G 也要保持较低（-6.0 kcal·mol-1左右），这样引物的成功率会显著提升（表 1）。该现象是因为甲基化引物PCR 与常规PCR有一重要区别，便是在实际扩增过程中只利用了一条链作为模板，即单链扩增，而与该模板链对应的引物便是反向引物，故在设计引物时，首先需考虑的便是让反向引物更易退火且特异性较高。反向引物长度短于正向引物，便会先于正向引物退火结合到模板上；同时因3’端驻G 较低，会让引物退火后快速有效的引发延伸反应，而正向引物尽管T_m高于反向引物，但因引物长度大导致其引物特异性略高，且没有对应模板，不易退火。当反向引物扩增后，正向引物的高T_m会迅速让其退火反向引物扩增链，并保持高于反向引物的退火能力及延伸能力，这样可尽量保持两条引物的同步扩增，又不至于单条链过于富集造成PCR效率下降。

在成功扩增产物的引物中，经测序比对验证仍有非目的片段的扩增（图 2），因此短引物用作甲基化引物依然存在弊端。为此本实验室又设计了大量长引物（31~50 bp）。根据表 2发现，除不同简并形式外，长引物的成功率可在50%以上，其中设计引物原则基本与短引物保持一致，即反向引物更易于结合模板。另外，引物除5’端外要保持较低驻G，即在引物内部稳定性上（Internal stability）呈“W”型，并且不能存在驻G 过低的发夹或二聚体。另一方面，由于引物过长必然导致覆盖较多的可修饰位点，引物当中的可变碱基需要简并，然而不同的简并形式会对PCR 扩增造成直接影响。根据经验我们发现3’端若有可修饰位点则必须简并，但该状况越少越好，因为它直接影响引物延伸反应的引发，但是3’末端的前3个碱基不允许存在可修饰位点。另外，需要避免2 个碱基以上的连续可修饰位点，且不应出现在3’端，如含有则须简并。终上所述，虽然长引物依然存在一些不可控因素，但与短引物相比，其引物设计成功率已得到极大提升，并且通过选择适合的PCR 程序和Taq 酶也可在一定程度上提高其成功率。

3.3 PCR程序和Taq酶的选择

图 1 结果表明，短引物扩增所使用的PCR 程序是Touch-down模式。在该方式下，设定的起始退火温度高于反向引物的T_m，使反向引物能有较高的特异性，而该温度低于正向引物T_m，可在反向引物延伸后迅速以其为模板进行扩增。随着前几轮扩增，使有义模板富集，此时退火温度已下降，可增加PCR 扩增的整体效率以便得到较高含量的目的片段。但是，因为退火温度只是影响PCR 效率的次要因素，如果引物特异性差，PCR 程序如何优化也于事无补，所以长引物的选用成必然趋势。

表 2 和图 3 结果表明，通过多种方式的尝试和验证，最终发现长引物的PCR 程序如下：95℃变性30s，55℃退火15 ~ 30 s，60℃延伸2~3 min。在该PCR程序中，选用长退火或延伸时间会造成PCR 总时间过长而引起酶活力下降，因而需要根据不同Taq 酶的扩增能力（主要指单位时间扩增片段长度）和活力的持久度，决定退火及延伸时间，此PCR 条件与Hen原derson等^[18]所用方法相似。该PCR 条件的优点是，对于T_m 较高的长引物，55℃会让引物迅速地在高特异性和稳定性的位点上退火，然后在60℃进行边退火边延伸，这样可使一些低稳定性和可修饰的位点继续退火，也可进行较稳定的延伸。然而缺点便是PCR 程序时间过长且对酶的性能要求较高，因为60℃并不是Taq 最佳温度，在该温度下其延伸效率不足72℃的一半，致使延伸时间过长，而普通的Taq 在2 h后性能会明显下降，最终影响PCR 的效果。

图 4 结果表明，在Taq酶的选择上，PrimeSTAR RHS并不适合甲基化PCR，因为所有的高保真酶都含有3’寅5’核酸外切酶活性，而尿嘧啶与胸腺嘧啶相比少一个甲基，虽然在碱基配对时也可形成两个氢键，但形成双链螺旋结构时并不稳定，可能会影响高保真酶的扩增，甚至会误认其是错配而将其外切掉，导致已修饰位点不易扩增而含甲基化位点的DNA 可正常延伸，最终引起结果中高甲基化的极端现象。而且在部分品牌高保真酶的说明书上，虽然没有强调却有提示“不宜使用含dUTP 或尿嘧啶的模板和引物”。因此，甲基化引物的PCR 更注重对Taq酶的扩增能力。相对于普通的TaKaRaTaq，由于EpiTaq^TM HS 专为修饰DNA 设计，其扩增能力得到加强，且在保真性能上不依赖外切酶活性，因此其结果优于TaKaRaTaq。

4 结论

（1）17 ~30 bp 短引物使用Touch-down 程序PCR效果较好，但无法避免其特异性低的弊端；31~50 bp长引物可解决该问题，并以55℃退火60℃延伸PCR程序扩增，成功率最高，其中反向引物的长度及T_m低于正向引物较佳。

（2）高保真酶因其外切酶活性所致的高甲基化现象，并不适宜用于甲基化研究，而EpiTaq^TM HS 由于专为修饰模板PCR 设计，其有较强的扩增含尿嘧啶模板及不依赖3’寅5’外切酶活性的保真能力，在实际应用中效果最佳。