近年来，大气活性氮含量日益增加，经生物地球化学循环以沉降形式返回陆地生态系统，并对生态系统健康与功能构成巨大威胁^[1-3]，我国的氮沉降以铵态氮为主^[4]。农业系统是氨气排放的主要来源^[5]，其中29.4%~47.4%的氨气来自化学肥料^[6]。受人口增长、有效耕地面积减少等影响，我国农业生产只能持续依靠氮肥^[2]，这将进一步加剧氨气的排放。

目前针对农田氨挥发的影响因素、控制措施已有大量研究^[7-9]，但多集中于农田土壤氨挥发，对植物冠层氨挥发研究较少。植物冠层可吸收土壤释放的氨气，捕获量占土壤挥发量的2.5%~76%^[10-13]，也可向大气释放氨气^[14]。冠层氨挥发受叶片谷氨酰胺合成酶（GS）活性、叶片氨气补偿点、质外体NH₄⁺浓度等影响^[15-17]。目前对冠层氨挥发的研究多在生长箱内进行，对田间条件下作物冠层氨挥发缺乏连续跟踪，限制了对冠层氨挥发机制的理解。

我国农田施氮量大，具有很高的氨挥发风险。系统研究农田系统与大气氨气交换过程、探讨减少氨挥发的技术措施与作用机制，对减氮增效、提高氮肥利用效率和改善生态环境具有重大的科学价值与现实意义。作为农田氨挥发的变数之一，作物冠层在农田氨挥发中的作用有待深入研究。本研究以我国主要粮食作物--冬小麦为对象，采用改进的通气式氨气捕获装置，对冠层氨挥发动态变化进行原位监测，分析冠层氨挥发规律及其对麦田氨挥发的贡献率，探讨影响冠层氨挥发的生理因素。目的是揭示小麦全生育期的冠层氨挥发特征，进一步加深对农田土壤-冠层-大气之间氨气交换过程的理解，为提高氮肥利用率提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计

试验地点位于西北农林科技大学旱地养分高效利用试验园区（34°17′35″N，108°04′12″E，海拔520 m），属半湿润易旱区。小麦生长季239 d，生长季平均气温10.2 ℃，平均空气湿度65%，总降水量为216.3 mm。土壤为土垫旱耕人为土（Earth-cumuli-Orthic Anthrosol），耕层土壤（0~20 cm）主要理化性质为：有机质13.02 g·kg^-1，全氮0.92 g·kg^-1，矿质氮（NH₄⁺-N和NO-3-N）6.69 mg·kg^-1，速效磷4.77 mg·kg^-1，速效钾141.35 mg·kg^-1，pH 8.5（土水比1:2.5）。

供试冬小麦品种为小偃22（Triticum aestivum L.cv.Xiaoyan22），播种量120 kg·hm^-2。供试肥料为尿素（含N 46%）和过磷酸钙（含P₂O₅ 46%）。试验设置3个施氮水平（0、90 kg N·hm^-2和180 kg N·hm^-2），分别以N0（未施氮处理）、N90（低施氮处理）和N180（高施氮处理）表示。各小区均施磷肥90 kg P₂O₅·hm^-2。小区面积6 m×2.6 m=15.6 m²。各处理随机排列，3次重复。播种前将肥料（各处理2/3尿素+全部磷肥）均匀撒施到地表，翻耕使土肥混匀，平整地面。各小区按25 cm行距开沟播种。剩余1/3尿素于拔节期雨前沟施到各小区。2015年10月19日施肥播种，2016年3月18日追肥。播种施肥当日安放氨气捕获装置进行氨气采集，于10月26日幼苗出土后开始测定冠层氨挥发，2016年6月15日结束测定。

1.2 采样与测定 1.2.1 氨气的采集与测定

对Yang等^[7]的通气式氨挥发装置进行改进，用于小麦冠层氨挥发原位监测（图 1）。装置由5节有机玻璃管（每节高20 cm，内径15 cm）、2层吸收海绵（厚5 cm，直径15 cm，聚氨基甲酸乙酯材质）、有机玻璃遮雨板（直径25 cm，厚0.5 cm）和3个吸盘（支撑遮雨板于装置上方）构成。吸收海绵采用20~30 mL H₃PO₄（0.8 mol·L^-1）和甘油（0.7 mol·L^-1）的混合液预先浸润，其中下层海绵吸收土壤和冠层释放的氨气，上层海绵用于排除外界大气中的氨气对试验的干扰。遮罩冬小麦的装置，其下层海绵距离冬小麦顶部5 cm，捕获冬小麦与土壤释放的氨气（表示为N0、N90、N180）；不遮罩冬小麦的装置，其下层海绵捕获土壤释放的氨气（表示为CK-N0、CK-N90、CK-N180）。参照王朝辉等^[18]的方法，对该装置下层海绵不同高度的氨气回收率进行测定，结果为75.8%~98.4%。每小区安装2个装置，分别位于播种行上（遮罩小麦植株）和小麦行间，插入地下5 cm处。随冬小麦高度的增长适时增加装置玻璃管数，玻璃管之间用金属箍密封固定。

小麦播种后，开始隔天采样，采样时间为上午10时至12时，一周后视氨挥发量逐渐延长采样时间直至冬季土壤上冻。小麦返青后每周采样，视氨挥发量调整采样频率，遇雨天顺延，直至收获。采样当天进行提取与测定。海绵中NH₄⁺-N用1 mol·L^-1 KCl浸提，靛酚蓝比色法测定。采用以下公式计算氨挥发参数：

式中：SAF为土壤氨挥发速率，kg N·hm^-2·d^-1；CAF为冠层氨挥发速率，kg N·hm^-2·d^-1；ASAV为土壤氨挥发累积量，kg N·hm^-2；ACAV为冠层氨挥发累积量，kg N·hm^-2；AWAV为麦田氨挥发累积量，kg N·hm^-2；FALR为氮肥氨挥发损失率，%；NFR为施氮量，kg N·hm^-2；M_（CK-N）为不遮罩植物装置平均每次测得的氨挥发量，kg N；M_N为遮罩植物装置平均每次测得的氨挥发量，kg N；T为每次连续收集的时间，d；S为收集装置的横截面积，3.14×0.0752 m²；R为不同海绵高度氨捕获装置的氨气回收率；AWAV_N0为不施氮小区麦田氨挥发累积量，kg N·hm^-2；10 000为换算成公顷的系数。

1.2.2 叶片质外体溶液提取及其NH₄⁺浓度、pH测定

根据文献[19]提取冬小麦叶片质外体溶液：将新鲜叶片用去离子水洗净，用滤纸吸干，称取约5 g，置于200 mL注射器中，堵住出水口，加入约150 mL 280 mmol·L^-1山梨醇溶液，通过抽动、排液、挤压等过程使叶片大部分变为深绿。取出叶片，吸干表面液体，在4 ℃下以1000×g离心10 min，得到质外体提取液。质外体溶液pH值用pH计（E201P，上海雷磁）测定，NH₄⁺浓度（mmol·L^-1）用靛酚蓝比色法测定。

1.2.3 叶片氨气补偿点的计算

根据文献[20]计算叶片氨气补偿点（nmol NH₃·mol^-1空气）。当质外体pH在一定范围内，K_d < < [H⁺]_apo（质外体H⁺浓度）时，25 ℃下，氨气补偿点可用如下公式计算：

式中：Χ_s为氨气补偿点；Γ为质外体NH₄⁺浓度和质外体H⁺浓度之比，代表不依赖于温度的氨气交换潜力；K_H和K_d是热动力学常数，其值分别为10^-1.76 L·mol^-1和10^-9.25 mol·L^-1（25 ℃）。

通过以下公式，结合计算得到的25 ℃时氨气补偿点，计算实际温度下氨气补偿点：

式中：T_α为实际温度，K，本试验中实际温度为采样当日平均气温；T_ref为298.15 K（25 ℃）；Χ_s T_α为实际温度下氨气补偿点；Χ_s T_ref为25 ℃下氨气补偿点；ΔH_dis⁰为NH₄⁺解离焓，52.21 kJ·mol^-1；ΔH_vap⁰为蒸发焓，34.18 kJ·mol^-1；R为气体常数，0.008 31 kJ·K^-1·mol^-1。

1.2.4 叶片谷氨酰胺合成酶（GS）测定

参考文献[21]测定GS活性（A·mg^-1 protein·h^-1）。

称取叶片1 g（抽穗之后只取旗叶）于研钵中，加3 mL提取缓冲液（0.05 mol·L^-1 Tris-HCl，pH 8.0，内含2 mmol·L^-1 Mg²⁺，2 mmol·L^-1 DTT，0.4 mol·L^-1蔗糖），冰浴研磨成匀浆，转移至离心管中，在4 ℃、12 000 r·min^-1条件下离心20 min，上清液即为粗酶液。

吸取1.6 mL反应混合液B（0.1 mol·L^-1 Tris-HCl缓冲，含盐酸羟胺，pH 7.4）加入离心管中，另取一个离心管加1.6 mL反应混合液A（0.1 mol·L^-1 Tris-HCl缓冲，pH 7.4）作为对照，加入0.7 mL粗酶液和0.7 mL 40 mmol·L^-1 ATP溶液，混匀，于37 ℃下保温0.5 h；加入显色剂（0.2 mol·L^-1 TCA，0.37 mol·L^-1 FeCl₃和0.6 mol·L^-1 HCl混合液）1 mL，摇匀并放置片刻后，于5000 r·min^-1条件下离心10 min，取上清液测定540 nm处的吸光值。利用考马斯亮蓝法测定粗酶液中可溶性蛋白质，根据以下公式计算GS活性，用产生的γ-谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物540 nm处吸光值的大小来表示GS活性：

式中：A为540 nm处的吸光值；P为粗酶液中可溶性蛋白含量，mg·mL^-1；V为反应体系中加入的粗酶液体积，0.7 mL；T为反应时间，0.5 h。

1.3 统计分析

采用SAS 8.2进行单因素方差分析与相关分析，以Origin 2015绘制数据图像。

2 结果与分析 2.1 土壤与冠层氨挥发速率及累积量 2.1.1 越冬前土壤与冠层氨挥发速率

播种施肥后前20 d为麦田氨挥发的主要时期，且土壤氨挥发速率与施氮量成正比（图 2a）。土壤氨挥发速率于施肥后第7~9 d达到峰值，施氮处理峰值（0.086~0.156 kg N·hm^-2·d^-1）比未施氮处理（0.044 kg N·hm^-2·d^-1）高95.5%~254.5%。施肥后第8~11 d，CK-N90、CK-N180的氨挥发速率分别高于N90、N180，而N0处理呈相反趋势（图 2a）。

2.1.2 返青后土壤与冠层氨挥发速率

追肥后10 d内，土壤氨挥发速率波动明显，于第9 d达峰值，施氮处理峰值（0.080~0.097 kg N·hm^-2·d^-1）比未施氮处理（0.030 kg N·hm^-2·d^-1）高166.7%~223.3%。返青-拔节期（图 2b），N180的氨挥发速率略低于CK-N180，而N0与N90处理呈相反趋势。小麦灌浆后（图 2c），N0、N90和N180的氨挥发速率明显高于CK-N0、CK-N90和CK-N180（灌浆前期N180处理略低于CK-N180）。5月下旬（灌浆末期）以后，CK-N0、CK-N90和CK-N180氨挥发速率波动较小，而N0、N90和N180的氨挥发速率增加显著。

2.1.3 氨挥发累积量

施氮显著提高了麦田氨挥发累积量（表 1），施氮处理比未施氮处理高103.2%~130.7%，施氮处理间也存在显著差异（P < 0.05）。随施氮量的提高，麦田氮肥氨挥发损失率从4.3%（N90）降至2.7%（N180）。土壤氨挥发对麦田氨挥发的贡献率达87.2%~89.3%，施氮处理比未施氮处理高107.3%~136.3%，各处理间差异显著（P < 0.05）；冠层氨挥发对麦田氨挥发贡献率为15.4%~19.9%，施氮处理比未施氮处理高56.9%~94.8%。

越冬前，施肥后20 d之内是土壤氨挥发的主要时期，且土壤氨挥发累积量随施氮量的增加显著提高（P < 0.05），施氮处理比未施氮处理高220.1%~357.4%（表 1）；施氮处理冠层对土壤挥发氨气存在净吸收，吸收量占土壤挥发氨气的7.1%~9.7%；随施氮量的增加，冠层对土壤挥发氨气的吸收量占土壤氨累积挥发量的比率降低；而未施氮处理冠层发生氨气的净释放，占同时段土壤挥发氨气的8.6%。施肥20 d之后，各处理冠层均为氨气的净释放。返青后，各生育期施氮处理土壤氨挥发累积量比未施氮处理显著提高80.2%~179.1%（P < 0.05）。在返青-拔节期与灌浆前期，高施氮处理冠层对土壤挥发氨气发生净吸收，低施氮处理与未施氮处理的冠层发生氨气净释放。生育后期（灌浆末-枯死期）是冠层氨挥发的主要时期，冠层氨挥发占土壤氨挥发的65.1%~74.5%，施氮处理比未施氮处理提高96.5%~136.9%（P < 0.05）。

2.2 与冠层氨挥发相关的影响因子 2.2.1 质外体NH₄⁺浓度、pH、叶片氨气补偿点变化

灌浆末期，各处理质外体NH₄⁺浓度均高于其他生育期，且施氮处理显著高于未施氮处理（图 3a，P < 0.05）。拔节-灌浆前期质外体NH₄⁺浓度处于较低水平，抽穗期施氮处理显著低于未施氮处理（P < 0.05），开花期与灌浆末期则呈相反趋势。质外体溶液pH值（图 3b）变化范围为5.73~6.82，在开花期达到峰值，生育后期有降低趋势，在灌浆末期降至最低。除孕穗-抽穗期外，施氮处理的质外体pH均高于未施氮处理。开花期与灌浆末期，叶片氨气补偿点出现2个峰值（图 3c），冠层氨气补偿点为8.2~64.1 nmol·mol^-1，且施氮处理叶片氨气补偿点显著高于未施氮处理（P < 0.05）；其他生育期叶片氨气补偿点较低，波动范围为1.3~16.0 nmol·mol^-1。

2.2.2 GS活性变化

返青后叶片GS活性先降低、后升高、再降低，在拔节期和开花期出现2个峰值，并在灌浆末期降至最低（图 3d）。拔节期与灌浆前期，N0处理GS活性最高，显著高于2种施氮处理（P < 0.05），且随施氮量的提高，GS活性降低；抽穗期，N0处理显著低于施氮处理（P < 0.05），且随施氮量的提高，GS活性提高；其余时期各处理间GS活性没有显著差异（P>0.05）。

2.2.3 冠层氨挥发速率与各影响因子相关性

冠层氨挥发速率与叶片氨气补偿点呈极显著正相关（P < 0.01），与质外体NH₄⁺浓度显著正相关（P < 0.05），但与叶片GS活性、质外体溶液pH没有显著相关性（表 2）。

3 讨论 3.1 冠层氨挥发

土壤与冠层是麦田氨挥发的主要来源，对麦田氨挥发的贡献率分别为87.2%~89.3%和15.4%~19.9%（表 1）。土壤氨挥发主要发生在施肥后1~2周内，而冠层氨挥发主要发生在生育后期（图 2b，图 2c），符合一般农田土壤的氨挥发规律^{[7-8, 14]}。

冠层氨气吸收主要出现在生育前期，并受施肥影响。低施氮处理，冠层氨气吸收主要发生在苗期；高施氮处理，苗期、返青期和灌浆前期均有冠层氨气吸收发生。Harper等^[22]报道，缺氮时冠层会从大气中吸收氨气。但本研究发现N0处理冠层并没有发生明显的氨气吸收现象，可能是因为不施肥处理土壤氨挥发少（图 1），冠层空气中氨气浓度低于叶片氨气补偿点所致。相反，施氮处理土壤氨挥发强烈，空气中的氨气浓度可能高于叶片氨气补偿点，因此冠层有氨气吸收发生。Herrmann等^[20]报道，施肥刈割后，尽管新生黑麦草叶片的质外体NH₄⁺浓度及其氨挥发潜势升高，但始终低于空气中氨气浓度，因此存在冠层氨气吸收的可能性。

冬小麦冠层氨挥发主要发生在开花期与灌浆末-枯死期（图 2b，图 2c），分别占冠层氨挥发的4.5%~9.3%和79.1%~99.0%（表 1）。这是因为生育后期植物叶片以氮素转运为主，尤其是到了衰老期，蛋白质水解产生大量的NH₄⁺（图 3a），为叶片氨挥发提供了直接来源，也导致较高的叶片氨气补偿点（图 3c）。

3.2 影响冠层氨挥发的因素

质外体NH₄⁺是冠层氨挥发的直接来源，叶片氨气补偿点是调控植物与大气氨气交换方向与强度的主要参数，其数值越大表明植物叶片氨挥发越强烈^[20]。影响氨气补偿点的因素有施氮量^[23]、细胞代谢或物质运输^[24]等，这些因素也是影响质外体NH₄⁺浓度的关键。相关性分析也表明，冠层氨挥发速率与叶片氨气补偿点极显著正相关（P < 0.01），与质外体NH₄⁺浓度显著正相关（P < 0.05，表 2），而与GS活性相关性不显著。有研究^[15]表明，叶片氨挥发与GS活性密切相关，利用MSO（GS抑制剂）降低GS酶活性会增加冠层氨挥发速率。这是因为降低GS活性会造成氨同化作用受到限制，导致细胞和质外体中NH₄⁺的累积。但在正常情况下，营养生长期叶片GS活性不会受到强烈抑制，且生长越旺盛，酶活性越高，氨同化越快，此时控制冠层氨气交换方向的主要因素是大气氨气浓度。高施氮处理土壤氨挥发强烈，大气氨气浓度高于氨气补偿点，冠层从大气中吸收氨气。

冠层氨挥发主要发生于灌浆末期与枯死期，此时冠层氮代谢以分解转运为主，氨同化不是主导氮素代谢方向的关键因素；同时土壤氨挥发少，大气氨气浓度低于氨气补偿点，冠层以氨挥发为主。在营养生长和生殖生长的交汇期（花期），GS活性（图 3d）与冠层氨挥发速率（图 2b）均出现峰值，说明氮代谢和氨挥发都很旺盛。可能是由于光呼吸氮循环释放的NH₄⁺多，其释放速率超过GS/GOGAT途径的同化速率^[25]，造成质外体NH₄⁺浓度上升和冠层氨气释放。冠层氨挥发也可能来源于植株下部老叶或者地上的枯枝落叶^[26]。因此，冬小麦冠层在土壤-大气氨气交换过程中的作用受生育期、施肥和营养状况等影响。

4 结论

冬小麦麦田氨挥发主要出现在施肥后2~3周内，且随施氮量的增加而提高，此时施氮处理冠层发生氨气吸收现象。冠层氨挥发主要发生在生殖生长期，特别是灌浆末-枯死期。冠层氨气扩散方向主要受氨气补偿点和质外体NH₄⁺浓度控制，与GS活性关系不大。在未来的氮素调控方面，应充分考虑冠层在农田氮素循环中的作用。