背角无齿蚌 (Anodonta woodiana woodiana) 栖息于淡水底泥中, 行动缓慢, 长期接受水体污染物的暴露, 能较为准确地反映栖息地底泥与淡水的污染状况, 是一种理想的环境污染指示生物^[1-3]。科学界将背角无齿蚌作为环境指示生物的研究主要集中于有机化合物对其生理生化等的毒性影响, 如:Alves^[4]发现除草剂-2, 4-二氯苯氧乙酸可以在无齿蚌中蓄积, 且可以影响其生长与发育; Xia等^[5]研究了农药-氟虫腈异构体在背角无齿蚌体内的代谢毒性 (蓄积、转化和清除); Qu等^[6]探讨了2, 4-二氯苯酚和五氯苯酚对背角无齿蚌含硒谷胱甘肽过氧化物酶的影响。但是, 对重金属镉致使背角无齿蚌相关组织的损伤研究则相对甚少。

镉 (Cd²⁺) 是一种银白色有光泽的重金属, 其在锌-镉电池等工业生产中被广泛利用, 产生的镉废弃物对生态环境造成的污染日趋严重^[7], 且主要以水体镉污染形式存在。研究表明, 镉可通过食物链在人体中富集, 进而打破机体组织器官活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 的平衡, 引起细胞抗氧化系统受损, 导致组织器官病变, 从而引起慢性或长期不可逆的病理效应^[8-9], ROS的过量产生是镉引起细胞氧化损伤、导致生物体肝脏病变^[10-11]、产生毒性作用的主要原因之一。生物体中的ROS主要包括过氧化氢 (Hydrogen peroxide, H₂O₂)、超氧阴离子 (Superoxide anion, O₂^-·) 和羟自由基 (Hydroxyl radical, ·OH) 等物质^[12-13]。那么, 镉对背角无齿蚌ROS系统是否会产生影响? ROS系统的变化对背角无齿蚌抗氧化系统将产生怎样的影响?本文通过设置不同浓度Cd²⁺溶液, 对背角无齿蚌分别处理24、48、72、96 h, 测定背角无齿蚌鳃和肝脏中ROS的含量, 同时对鳃和肝脏总抗氧化能力 (Total Antioxidant Capacity, T-AOC) 进行测定, 探讨Cd²⁺对背角无齿蚌鳃和肝脏的氧化损伤, 旨在为水体Cd²⁺污染寻找灵敏的生物学监测指标, 并为Cd²⁺污染对水生动物的组织病理影响提供数据支撑与理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物

背角无齿蚌也称河蚌, 于2013年4月购自太原市五龙口水产批发市场, 置水族缸 (45 cm×35 cm×30 cm) 中暂养两周。养殖条件:自来水曝气48 h, 室温15 ℃, pH 6.8, 溶氧6 mg·L^-1以上。

1.1.2 试剂

氯化镉 (CdCl₂·2.5H₂O)、氯化钠 (NaCl) 均为分析纯; H₂O₂含量、抗O₂^-·能力、抑制·OH能力、T-AOC及总蛋白 (TP) 测定试剂盒 (带标准:考马斯亮蓝法), 均购自南京建成生物公司。

1.2 实验方法 1.2.1 实验设计

根据Cd²⁺对河蚌96 h LC₅₀：134.9 mg·L^-1的急性毒性实验, 设计了5个Cd²⁺浓度处理组4.22、8.43、16.86、33.72、67.45 mg·L^-1和1个空白对照组, 每个浓度设3个平行组。分别处理24、48、72、96 h。将108只大小相近、体重相当的活体河蚌 (平均质量49.5 g, 平均体长7.46 cm, 平均体高3.2 cm) 分别置于18个处理缸中 (50 cm×30 cm×20 cm), 每缸6只。对照组加4 L曝气48 h的自来水, 处理组加4 L不同浓度Cd²⁺溶液, 室温15 ℃, pH 6.8, 溶氧6 mg·L^-1以上。实验期间不喂食、不换水, 实验过程中未出现河蚌死亡现象。

1.2.2 样品制备

在染毒24、48、72 h和96 h后, 用双蒸水洗净河蚌表面残留的Cd²⁺溶液, 分别剖取约0.1 g的鳃和肝脏组织, 迅速置于液氮中, 于-80 ℃超低温冰箱储存备用。

按照质量 (g)：体积 (mL)=1：9的比例, 加入9倍体积的生理盐水, 冰水浴条件下机械匀浆, 10000 r·min^-1离心10 min, 取上清10%匀浆待测。

1.2.3 生化指标及其测定方法

H₂O₂含量、抑制·OH能力、抗O₂^-·能力和T-AOC的测定均依据试剂盒的说明操作。

1.2.4 蛋白含量测定

采用Bradford方法, 用考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒测定, 标准蛋白以试剂盒提供的蛋白为参照。

1.3 数据处理

实验结果利用SPSS (中文17.0) 软件分析处理, 用平均值±标准误 (mean±S.E.) 表示, 用偏度系数和峰度系数检验数据的正态分布性, 对符合正太分布的数据进行单因素方差分析 (One-Way ANOVA), 应用Dunnett法进行对照组与处理组的比较, 以P < 0.05和P < 0.01作为差异显著和极显著的界值。

2 结果与分析 2.1 Cd²⁺对背角无齿蚌鳃H₂O₂含量、抑制·OH能力和抗O₂^-·能力的影响

观察图 1 (a)得知:在同一时间, 与对照相比, 背角无齿蚌鳃中H₂O₂含量呈极显著升高 (P < 0.01)。在24、48、72 h, 不同浓度Cd²⁺处理组相比, 随着Cd²⁺浓度的增加, H₂O₂含量呈先升后降趋势。在96 h, 16.86 mg·L^-1处理组, H₂O₂含量达到最大值 (22.68±2.87 mmol·g^-1prot), 是对照组的3倍。在4.22 mg·L^-1 Cd²⁺处理组, 随着时间的延长, H₂O₂含量逐渐增加; 在8.43 mg·L^-1 Cd²⁺处理组, 随着时间的延长, H₂O₂含量逐渐降低; 在较高浓度Cd²⁺处理组 (16.86、33.72、67.45 mg·L^-1), 随着时间的延长, H₂O₂含量呈倒U型趋势, 在96 h, H₂O₂含量逐渐恢复到对照组水平。

由图 1 (b)得出, 在24、72、96 h, 与对照组相比, 鳃抑制·OH能力出现极显著降低 (P < 0.01)。在48 h, 与对照组相比, 鳃抑制·OH能力无明显变化 (P > 0.05)。在24 h, 33.72 mg·L^-1浓度组, 鳃组织抑制·OH能力达到最低 (0.575±0.175 mmol·g^-1prot)。在同一浓度Cd₂₊处理组, 随着时间的延长, 鳃组织抑制·OH能力均呈先升高后降低的趋势。

从图 1 (c)可知:在同一时间, 与对照组相比, 背角无齿蚌鳃组织抗O-2·能力均呈极显著 (P < 0.01) 降低趋势。在同一Cd²⁺浓度处理组, 随着时间的延长, 鳃组织抗O₂^-·的能力无显著变化。

2.2 Cd²⁺对背角无齿蚌肝脏H₂O₂含量、抑制·OH能力和抗O₂^-·能力的影响

由图 2 (a)得知, 在同一时间, 与对照相比, 肝脏中H₂O₂含量整体呈极显著升高 (P < 0.01)。在24 h, 不同浓度Cd²⁺处理组相比, 肝脏中H₂O₂含量呈逐渐升高的趋势; 在48 h, 4.22、8.43、16.86、33.72 mg·L^-1 Cd²⁺处理组, 肝脏中H₂O₂含量呈逐渐减低趋势, 在67.45 mg·L^-1浓度组肝脏中H₂O₂含量略微升高; 在72 h, 不同浓度Cd²⁺处理组相比, 肝脏中H₂O₂含量呈先升高后降低的趋势; 在96 h, 肝脏中H₂O₂含量呈逐渐降低趋势。在4.22、8.43、16.86、33.72 mg·L^-1 Cd²⁺浓度处理组, 随着时间的延长, 肝脏中H₂O₂含量呈先升高后降低的趋势; 在67.45 mg·L^-1 Cd²⁺浓度处理组, 随着时间的延长, 肝脏中H₂O₂含量呈逐渐降低的趋势, 且在96 h, 67.45 mg·L^-1浓度组H₂O₂含量降至最低, 表现出明显的浓度-时间-效应关系。

依据图 2 (b)得知, 与对照组相比, 同一时间不同浓度或者同一浓度不同时间, 肝脏抑制·OH能力均无显著变化。

观察图 2 (c)发现, 在同一时间, 与对照组相比, 肝脏抗O-2·能力呈极显著降低 (P < 0.01)。在48 h, 不同浓度Cd²⁺处理组相比, 4.22、8.43、16.86 mg·L^-1 Cd²⁺处理组, 肝脏抗O₂^-·能力呈逐渐升高趋势, 33.72、67.45 mg·L^-1 Cd²⁺处理组, 肝脏抗O₂^-·能力呈现回落趋势。在48 h, 16.86 mg·L^-1 Cd²⁺处理组, 肝脏抗O₂^-·能力达到最高 (26.31±3.06 mmol·g^-1prot)。

2.3 Cd²⁺对背角无齿蚌鳃和肝脏T-AOC的影响

如图 3 (a)所示, 在24、72、96 h, 与对照组相比, 鳃T-AOC呈升高趋势, 且在72、96 h, 除67.45 mg·L^-1 Cd²⁺处理组鳃T-AOC能力无变化外, 其他Cd²⁺浓度处理组鳃T-AOC能力均出现极显著性升高 (P < 0.01)。在48 h, 与对照组相比, 鳃T-AOC无明显变化, 维持稳定; 在4.22、8.43、33.72、67.45 mg·L^-1 Cd²⁺浓度处理组, 随着时间的延长, 鳃T-AOC能力呈先升高后降低的趋势; 在16.86 mg·L^-1 Cd²⁺浓度处理组, 鳃T-AOC能力呈逐渐升高趋势。

观察图 3 (b)发现, 在同一时间, 与对照组相比, 肝脏T-AOC呈极显著性升高趋势 (P < 0.01)。在72 h, 不同浓度Cd²⁺处理组相比, 肝脏T-AOC呈先升高后降低的趋势。在4.22、8.43、16.86 mg·L^-1 Cd²⁺浓度处理组, 随着时间的增加, 肝脏T-AOC能力呈先升高后降低的趋势。

3 讨论

正常生理条件下, 组织细胞中H₂O₂、·OH和O₂^-·含量由机体抗氧化系统维持动态平衡状态^[14]。当机体受到外界因素的胁迫时, ROS含量失衡, 机体抗氧化系统受损^[15]。本实验结果也证实, Cd²⁺可以导致背角无齿蚌鳃和肝脏中H₂O₂、·OH和O₂^-·含量的失衡。

鳃主要由鳃丝构成, 水流经过鳃丝可以进行气体交换, 其承担蚌体的呼吸作用。本实验结果得出, 与对照组相比, 鳃组织抗O₂^-·能力减弱, H₂O₂含量增加, 抑制·OH能力减弱。这可能是因为Cd²⁺可以诱使鳃细胞发生单电子氧化还原反应而产生O₂^-·^[16], O₂^-·在活性升高的超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)^[17-19]催化作用下, 大量生成H₂O₂且不能被及时清除, 则通过Fenton反应转化为具有较强氧化活性的·OH^[15,20], 从而致使鳃抑制·OH能力减弱。这一结果证实了Cd²⁺可以致使背角无齿蚌鳃组织中ROS的含量增加, 进而诱使鳃组织中丙二醛 (Malondialdehyde, MDA) 含量增加, 脂质发生过氧化损伤^[22], 核溶解和吞噬细胞增多^[21]。本研究中H₂O₂含量的增加与李静等^[23]研究镉可以诱导长江华溪蟹 (Sinopotamon yangtsekiense) 鳃、肝、胰腺中H₂O₂含量增加的结果一致。

肝脏承担蚌体的解毒作用, 含有丰富的抗氧化物酶类^[24]。实验结果得出:在同一时间, 与对照组相比, 肝脏抗O₂^-·能力呈极显著性降低, H₂O₂含量呈极显著性升高, 抑制·OH能力无显著变化, 说明Cd²⁺可以引起肝脏抗氧化系统受损, 迫使组织抗氧化能力下降^[25-26], 在24 h, 肝脏中H₂O₂含量呈逐渐升高的趋势。这可能是因为肝脏中O₂^-·在活性升高的SOD^[14]催化作用下, 大量生成H₂O₂^[15], 说明肝脏对镉引起的毒性效应较为敏感, 可以作为环境监测的靶器官。然而, 在48、72、96 h, 不同浓度Cd²⁺处理组相比, 肝脏中H₂O₂却呈逐渐降低趋势, 这可能是因为:①肝脏中部分O₂^-·被细胞色素C直接催化形成水^[27], 使生成的H₂O₂含量减少; ②肝脏激活了过氧化物歧化酶 (Catalase, CAT)^[21], 其催化H₂O₂转变为水和氧气^[28], 致使肝脏中H₂O₂含量减少; ③肝脏中生成的H₂O₂被细胞色素C释放的电子还原, 清除了部分H₂O₂^[27]。肝脏抑制·OH能力无明显变化, 可能是因为肝脏产生的O₂^-·和H₂O₂被肝脏中抗氧化酶类 (SOD、CAT等) 代谢, 很少或没有O₂^-·和H₂O₂经Fenton反应生成·OH, 说明肝脏作为机体解毒器官, 对外来毒物引起的氧化损伤具有一定抵御作用。鳃和肝脏中抗O₂^-·的能力均呈下降趋势, 说明O₂^-·可以作为监测水生生态环境Cd²⁺污染的生物学指标。

T-AOC是机体中包括抗氧化酶系统及非酶系统相互作用的综合性衡量指标。近年来, 对T-AOC在水生态毒理学机制研究中受到了广泛的重视, 而且, 认定组织中T-AOC是反映机体抗氧化作用的重要指标之一^[29-30]。本研究结果显示, 在同一时间, 与对照组相比, 鳃和肝脏中T-AOC均呈升高趋势, 可能是因为鳃和肝脏ROS的生成刺激组织抗氧化防御系统活性增高, 从而抵御活性氧对组织的损害^[28]。但是, 在4.22、8.43、33.72、67.45 mg·L^-1 Cd²⁺浓度处理组, 随着时间的延长, 鳃T-AOC能力呈先升高后降低的趋势; 同时, 在4.22、8.43、16.86 mg·L^-1 Cd²⁺浓度处理组, 随着时间的增加, 肝脏T-AOC能力也呈先升高后降低的趋势。这可能是因为:短时间Cd²⁺溶液处理背角无齿蚌, 鳃和肝脏产生氧化应激反应, 启动组织的酶与非酶系统抵御ROS的氧化损伤, 随着时间的延长, 鳃和肝脏中ROS产生过快或者过量^[28], SOD和GSH等抗氧化酶与非酶物质受损, 鳃和肝脏细胞受损, T-AOC也呈降低趋势, 严重时将引发细胞凋亡^[30-31]。

4 结论

(1) 肝脏作为背角无齿蚌的解毒器官, 对外源Cd²⁺污染较为敏感, 其可以作为水体Cd²⁺污染监测的靶器官。

(2) 鳃和肝脏抗O₂^-·能力均呈降低趋势, 说明O₂^-·可能是Cd²⁺致使背角无齿蚌氧化损伤的首要因素, 其可以作为水体Cd²⁺污染监测的生物指标。