苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，在其芽孢形成过程中产生杀虫晶体蛋白^[1]。自1987年Vaeck等^[2]首次报道转Bt基因抗虫植物以来，转Bt基因棉花^[3]、玉米^[4]和茄子^[5]相继实现商业化生产。我国自1997年开始种植Bt棉花，随着规模的不断扩大，目前种植面积已达370万hm²。近年来Bt杨树也开始种植，2015年栽培已达543 hm^2[6]。

随着Bt作物种植面积的不断扩大，其环境安全性问题日益引起关注，Bt蛋白通过根系分泌、秸秆还田和花粉飘落^[7]等方式释放到土壤，并迅速被矿物颗粒吸附^[8]。一旦吸附完成，就能对微生物和酶的降解产生抗性，使持效期显著延长。由于Bt蛋白在土壤矿物表面吸附迅速，有关其动力学研究很少。刘洁等^[9]研究了蒙脱石等四种矿物对Bt蛋白吸附的动力学，发现矿物性质、温度、pH对动力学特征有重要影响。近年的研究表明，除了温度、pH、矿物类型之外，离子强度也是影响Bt蛋白吸附的重要因素。刘宁等^[10]研究了钠、钾离子对Bt蛋白在蒙脱石和凹凸棒石表面吸附和解吸的影响，证实钠、钾离子对Bt蛋白吸附有促进作用，且钾的影响稍高于钠。Fu等^[11]研究了离子强度和倍半氧化物对Bt蛋白吸附的影响，证实在低浓度范围内（ < 10 mmol·kg^-1）钠、钙离子均对Bt蛋白吸附有促进作用。然而Sander等^[12]则观察到了相反结果，在pH>6的条件下，Bt蛋白在土壤有机质上的吸附随着离子强度的降低而增加。

截至目前，离子强度对Bt蛋白吸附动力学的影响尚无文献报道。本文选取蒙脱石、高岭石、凹凸棒石和碳酸钙四种不同类型的矿物，研究Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺四种阳离子对Bt蛋白吸附动力学的影响，并通过Bt蛋白、矿物表面电位变化对影响机制做出探讨，为环境风险评价提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

Bt库斯塔克亚种原粉由华中农业大学微生物农药国家工程中心提供，蒙脱石由浙江丰虹粘土化工有限公司提供，凹凸棒石由江苏省盱眙县华丰油田钻井液用材料厂提供，高岭石购自上海五四化学试剂有限公司，超细碳酸钙由山西芮城华纳纳米材料有限公司提供。氯化钠、氯化钾、氯化镁和氯化钙均为分析纯。

1.2 Bt蛋白提取

Bt蛋白的提取按照文献[10]进行。

1.3 金属阳离子对Bt蛋白吸附动力学的影响

Bt蛋白用Tris缓冲液（0.01 mol·L^-1，pH7.2）溶解，离心去除沉淀，取少量样品测定吸光度值，然后按照标准曲线计算其浓度。矿物预先配制成水悬液，吸附前离心管中预先加入金属盐溶液，并使其最终浓度为1 mmol·L^-1。Bt蛋白和矿物按质量比1:5加入离心管中，在25 ℃条件下进行振荡吸附，分别在1、2、4、6、8、10、20、30、60、100 min进行高速离心（15 000 r·min^-1，15 min），取上清液在280 nm测定吸光度，利用标准曲线计算Bt蛋白浓度，计算吸附量。同时做矿物空白和不添加金属离子的动力学实验。

1.4 金属阳离子对Bt蛋白和矿物表面电位的影响

将Bt蛋白用Tris缓冲液配成0.2 mg·mL^-1溶液，依次加入0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L^-1金属盐溶液，混合后放置1 h，用电泳淌度仪（Nano-ZS90，Malvern Instruments，UK）测定Bt蛋白Zeta电位，用于确定合适的离子添加浓度^[13]。矿物粉体分别用蒸馏水配成水悬液（1 mg·mL^-1），然后与1 mmol·L^-1金属盐溶液混合放置1 h，用电泳淌度仪测定Zeta电位。

1.5 Bt蛋白标准曲线的测定

Bt蛋白配成0.3 mg·mL^-1溶液，依次稀释为0.225、0.187 5、0.15、0.112 5、0.075、0.037 5 mg·mL^-1，以Tris缓冲液作对照，在280 nm处测定吸光度。以横轴为Bt蛋白浓度、纵轴为吸光度值绘制标准曲线。

1.6 动力学模型 1.6.1 一级动力学模型^[14]

式中：q_e是吸附达到最终平衡时的最大吸附量，mg·mg^-1；q_t是在任意时刻测定的吸附量，mg·mg^-1；k₁是吸附平衡常数，min^-1。

用ln（q_e-q_t）对t作图得到直线，利用斜率可以求出k₁，利用截距可以计算理论吸附量。

1.6.2 二级动力学模型^[14]

式中:k₂是二级吸附平衡常数，mg·mg^-1·min^-1。

利用t/q_t对t作图得到直线，利用斜率可以求出理论吸附量，再用截距计算k₂。

1.6.3 内扩散模型^[14]

式中:k_id是内扩散速率常数，mg·min^-0.5。

用q_t对t^0.5作图得到直线，利用斜率可以求出k_id。

1.6.4 Elovich模型^[15]

式中：α、β均为吸附常数。

用q_t对lnt作图得到直线。

1.7 统计分析

运用SPSS软件对吸附数据进行统计分析，并比较差异显著性。

2 结果与分析 2.1 金属阳离子对Bt蛋白在蒙脱石表面吸附动力学的影响

Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对Bt蛋白在蒙脱石表面吸附动力学的影响如图 1所示。吸附体系不添加金属离子时，Bt蛋白吸附平衡时间为20 min；当添加1 mmol·L^-1 Na⁺或K⁺时，吸附速率较无离子添加相差不大，经30 min吸附趋于平衡。当添加1 mmol·L^-1 Mg²⁺或Ca²⁺时，吸附速率急剧增加，且Ca²⁺对Bt蛋白吸附的促进程度超过Mg²⁺。统计分析结果表明：Ca²⁺、Mg²⁺均对Bt蛋白吸附有极显著影响，且二者之间存在显著差异（P < 0.01）；Na⁺、K⁺对Bt蛋白吸附有显著影响，但二者之间差异不显著（P >0.05）。

2.2 金属阳离子对Bt蛋白在凹凸棒石表面吸附动力学的影响

Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对Bt蛋白在凹凸棒石表面吸附动力学影响如图 2所示。吸附体系不添加金属离子时，Bt蛋白在凹凸棒石上的吸附特性与在蒙脱石上相似，20 min吸附即趋于平衡。当添加1 mmol·L^-1 Na⁺或K⁺时，吸附速率较无离子添加时提高，且K⁺的提高程度大于Na⁺。当添加1 mmol·L^-1 Mg²⁺或Ca²⁺时，2 min后吸附速率分别增加6.3倍和7.0倍，且Ca²⁺的促进作用大于Mg²⁺。统计分析结果表明：Ca²⁺、Mg²⁺均对Bt蛋白吸附有极显著影响（P < 0.01），且二者之间差异显著；K⁺对Bt蛋白吸附有显著影响，且与Na⁺之间存在显著性差异；Na⁺对Bt蛋白吸附无显著影响（P >0.05）。

2.3 金属阳离子对Bt蛋白在高岭石表面吸附动力学的影响

Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对Bt蛋白在高岭石表面吸附动力学影响如图 3所示。吸附体系不添加金属离子时，Bt蛋白在高岭石表面的吸附60 min后趋于平衡，平衡时间较蒙脱石、凹凸棒石延长。当添加1 mmol·L^-1 Na²⁺或K⁺离子时，初始吸附速率较不添加金属离子明显加快，平衡时间缩短至30 min，但Na⁺、K⁺之间差别不大。当添加1 mmol·L^-1 Mg²⁺时，2 min后吸附速率增加15.9倍，30 min后趋于平衡。Ca²⁺对Bt蛋白吸附的促进作用大于Mg²⁺，与不添加金属离子相比，2 min后吸附速率增加22.7倍，20 min出现短暂的平衡后，至60 min时吸附又有小量增加。统计分析结果表明：Ca²⁺对Bt蛋白吸附有极显著影响（P < 0.01），Mg²⁺有显著影响（P < 0.05），Na⁺、K⁺无显著影响。

2.4 金属阳离子对Bt蛋白在碳酸钙表面吸附动力学的影响

Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对Bt蛋白在碳酸钙表面吸附动力学影响如图 4所示。吸附体系不添加金属离子时，Bt蛋白在碳酸钙表面的吸附20 min趋于平衡。当添加1 mmol·L^-1 Na⁺时，吸附速率较无离子添加时加快，30 min吸附达到平衡，吸附速率提高1.5倍。当添加1 mmol·L^-1 K⁺时，吸附速率较Na⁺添加进一步加快，至30 min吸附达到平衡时，吸附速率提高1.9倍。当添加1 mmol·L^-1 Mg²⁺时，吸附速率较一价离子添加明显加快，30 min后吸附速率提高3.3倍。Ca²⁺对Bt蛋白吸附的影响明显超过Mg²⁺，前10 min吸附速率急剧增加，此后呈缓慢增加趋势，至吸附实验结束时，仍未出现明显的平衡拐点。统计分析结果表明：Na⁺对Bt蛋白吸附有显著影响，而K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺三种离子则有极显著影响（P < 0.01），且彼此之间差异显著（P < 0.05）。

2.5 吸附动力学参数分析

Bt蛋白在四种矿物表面的吸附数据经过一级动力学模型拟合，R²在0.710 8~0.987 6之间（表 1），四种金属离子的影响顺序为：Ca²⁺>Mg²⁺>K⁺>Na⁺。依据相关性的知识判断，该模型基本能够反映Bt蛋白的吸附动力学特性^[14]。但模型计算得出的平衡吸附量与实测值出入较大，故该模型拟合效果并不理想。

二级动力学模型拟合的R²在0.995 1~0.999 9之间（表 2）。该模型不仅相关系数高，而且由模型计算得出的平衡吸附量与实测值非常接近，故拟合效果理想。内扩散及Elovich模型的动力学模型拟合结果见表 3。内扩散模型的R²在0.619 4~0.898 0之间，相关性较低，表明该模型拟合效果不够理想；而Elovich模型的R²在0.914 1~0.982 9之间，相关性较高，表明该模型拟合效果比较理想。

2.6 金属阳离子对Bt蛋白和矿物表面电位的影响

Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺浓度对Bt蛋白表面电位影响如图 5所示。随着金属阳离子浓度提高，Bt蛋白表面电位受一价离子影响较小，其中K⁺的影响较Na⁺稍高。二价离子对Bt蛋白表面电位影响较大，离子浓度达到0.25 mmol·L^-1时，Bt蛋白表面电位急剧升高，但当浓度超过0.5 mmol·L^-1时，变化趋于平缓。总体比较，Ca²⁺的影响程度高于Mg²⁺。

凹凸棒石、高岭石、蒙脱石、碳酸钙在水溶液中表面电位均为负值，添加金属离子（1 mmol·L^-1）后，表面电位均有不同程度的提高（图 6），四种金属离子对矿物表面电位的影响有着一致的规律性，即：Ca²⁺>Mg²⁺>K⁺>Na⁺。

3 讨论

金属离子促进Bt蛋白在矿物表面吸附的作用，是与矿物表面Zeta电位升高、胶体粒子团聚以及金属离子与Bt蛋白之间的螯合作用有关。首先，Bt蛋白等电点在5.5左右^[10]，在吸附条件下（pH7.2），Bt蛋白和矿物表面均带负电荷，因此Bt蛋白分子与矿物粒子之间存在着电荷斥力。随着金属离子浓度的提高，Bt蛋白和矿物表面的负电荷均朝着绝对值减小的方向变化，导致斥力减小，吸附量增加。土壤胶体双电层厚度与金属离子价态的关系如古依-查普曼（Gouy-Chapman）模型所示^[16]：

式中：1/K为扩散双电层厚度，ε₀为真空介电常数，ε为水的介电常数，k为玻尔兹曼常数，T为绝对温度，n₀为离子浓度，e为单位电荷，υ为阳离子价态数。

当其他条件不变时，阳离子价态越高，扩散双电层厚度越小，表面电势绝对值越低。对于同价离子而言，它们对胶体粒子Zeta电势的影响与离子水合半径有关。Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺水合离子半径分别为0.358、0.331、0.428、0.412 nm^[17]，水合离子半径越大，扩散双电层厚度越大，Zeta电势绝对值越大。因Na⁺水合半径高于K⁺，Mg²⁺水合半径高于Ca²⁺，故Na⁺对Bt蛋白的促进作用低于K⁺，Mg²⁺对Bt蛋白的促进作用低于Ca²⁺。金属离子促进矿物吸附Bt蛋白的第二个原因，是矿物胶体粒子结构重排^[18]。随着金属盐浓度的增加，矿物粒子双电层结构受到一定程度破坏，胶体粒子开始出现团聚现象，对Bt蛋白实行包裹或产生新的凹陷吸附位点，导致吸附量增加。此外，金属离子能够争夺Bt蛋白分子表面水化膜中的水分子，使Bt蛋白分子更易与矿物粒子接触，促进吸附发生。第三个原因则是钙镁二价金属离子可以与Bt蛋白形成螯合键，同时金属离子也容易被矿物吸附，从而使矿物与Bt蛋白之间形成盐桥^[19]，导致吸附量增加。

4 结论

Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对Bt蛋白在矿物表面吸附动力学有一定影响，添加金属离子后，Bt蛋白吸附量增大，金属阳离子作用强弱依次为：Ca²⁺>Mg²⁺>K⁺>Na⁺。Bt蛋白吸附动力学可用二级动力学模型和Elovich模型来描述，其中二级动力学模型拟合结果最好，由该模型计算得出的平衡吸附量与实测值吻合；Elovich模型R²>0.914 1，也能够较好描述动力学特征。一级动力学模型R²在0.710 8~0.987 6之间，相关系数分布范围太宽，且由模型计算得出的平衡吸附量与实测值差异较大，故不适合用于动力学特征描述；内扩散模型相关系数低（R²>0.619 4），不建议在Bt蛋白吸附动力学中使用。